مقالة منهجية

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

13.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52650

⸱

مارس 24, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Center for Biologics Evaluation and Research, US Food and Drug Administration, 2Center for Drug Evaluation and Research, US Food and Drug Administration

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول مقايسة qRT-PCR عالية الإنتاجية لتحليل توقيعات تعبير IFN من النوع الأول والثالث. يميز الاختبار اختلافات زوج القاعدة المفردة بين النصوص المتشابهة للغاية لهذه الجينات. من خلال تجميع الدفعات وسحب العينات الروبوتية، تكون المقايسات متسقة وقابلة للتكرار.

الملخص

الموصوف في هذا التقرير هو اختبار qRT-PCR لتحليل سبعة عشر نوعا فرعيا من IFN البشري في شكل لوحة 384 بئرا يشتمل على مجسات الحمض النووي المقفل (LNA) والمنارة الجزيئية (MB) ، ومعايير النسخ ، والماصة الآلية متعددة القنوات ، وتجفيف الألواح. تحديد التعبير بين النوع الأول من الإنترفيرون (IFN) ، وخاصة الأنواع الفرعية الاثني عشر IFN-α ، محدود بهوية التسلسل المشتركة الخاصة بهم. وبالمثل ، فإن تسلسلات النوع الثالث IFN ، وخاصة IFN-λ2 و -λ3 ، متشابهة للغاية. يوفر هذا الاختبار وسيلة موثوقة وقابلة للتكرار وغير مكلفة نسبيا لتحليل التعبير عن نصوصات النوع الفرعي السبعة عشر من الإنترفيرون.

المقدمة

أنواع الأول والثالث إنترفيرون (IFN) هي الحاسمة في الاستجابة المناعية للفيروسات والمحفزات الأخرى المسببة للأمراض والحاضر في جميع الفقاريات 1. الخلايا المناعية وغير المناعية تعبر عن وتفرز، فضلا عن الاستجابة ل، IFN 2. أجهزة الاستشعار المناعية الفطرية، مثل مستقبلات تول مثل (TLR)، STING، وRIG-I، لحث النوع الأول والثالث IFN التعبير عند الكشف عن العوامل المسببة للأمراض المرتبطة أنماط الجزيئية (PAMP) 3،4. في البشر، النوع الأول الإنترفيرون تشمل IFN-β، -ω، -κ، و 12 أنواع فرعية من IFN-α، وربط لمستقبلات IFNAR1 / IFNAR2 معقدة 2،5. النوع الثالث IFN تشمل IFN-λ1، -λ2، و-λ3 وربط مجمع مستقبلات IL10RB / IL28RA 2. كلاسيكيا، وأنواع الأول والثالث IFN ربط إلى المجمعات مستقبلات منها والتي ثم تجنيد STAT1 / heterodimers STAT2 وبدء النسخ من الإنترفيرون حفز الجينات (ISG) 6. وتشارك ISG في مجموعة متنوعة من الوظائف، من فيروسات ومضادةالنشاط التكاثري لتفعيل الاستجابة المناعية التكيفية 7.

آليات عديدة تطورت مسببات الأمراض للتهرب، تخريب، وخطف عناصر من مسار IFN إشارات تدل على أهمية IFN في الاستجابة المناعية الفطرية 8. على سبيل المثال، فيروس اللقاحية يعبر عن مستقبلات شرك مع IFNAR1 التماثل أن تعزل اكتب I الإنترفيرون 9 في حين أن فيروس المرض يابا مثل يفرز بروتين سكري الذي يمنع اكتب الأول والثالث IFN البروتينات 10. بالإضافة إلى دورها في الدفاع المضيف، وتورط IFN أيضا في مراقبة السرطان وعدد من الأمراض الالتهابية السيارات: إسكات التعبير IFN في خلايا سرطان الثدي يقيد الترصد المناعي 11، الإفراط في IFN-α هو آلية في تطوير النظامية الذئبة الحمامية 12، وتفعيل المخطئين من STING يؤدي إلى التهاب النظامية الناجمة عن كميات مفرطة من IFN في المصاحب STING اعتلال وعائيوتستخدم 13. العلاجي، IFN لعلاج التصلب المتعدد 14، والالتهابات الفيروسية المزمنة مثل HBV 15 و HCV 16،17، والسرطانات مثل اللوكيميا خلية شعر 18 و ابيضاض الدم النقوي المزمن (19). أسئلة حول أهمية IFN في عملية فسيولوجية معينة تكشف باستمرار طبيعة في كل مكان من هذه العائلة خلوى.

اكتب I IFN، وخاصة الأنواع الفرعية-α IFN، وغالبا ما تعتبر واحدة كيان 20-23، بدلا من أن تكون مجموعة من يرتبط ارتباطا وثيقا، ولكن متميزة، والبروتينات. وجود واستمرار الأنواع IFN متعددة بما في ذلك الأنواع الفرعية IFN-α، في جميع أنحاء تطور الفقاريات 24 تشير إلى أن ما لا يقل عن مجموعة فرعية من هذه الأنواع الفرعية لها وظائف محددة أو فريدة من نوعها. ومن الممكن أن أنماط المميزة لIFN التعبير وفك وتساعد على توصيف وظائف محددة من واحد أو أكثر من أنواع فرعية 17. التحدي المتمثل في دراسة ركان النوع الأول والثالث IFN فرعية تقوم على هوية مشتركة تسلسل منهم: اثني عشر فرعية IFN-α تشترك> 50٪ 25 و الأنواع الفرعية-IFN λ حصة 81-96٪ 26 من سلاسل من الأحماض الأمينية الخاصة بهم. في وصف QRT-PCR الفحص، منارة الجزيئية (MB) والحمض النووي مؤمن (LNA) تحقيقات الفلورسنت تميز الاختلافات زوج قاعدة واحدة بين مماثلة إلى حد كبير تسلسل IFN النوع الفرعي وتسمح لتوصيف التوقيع IFN التعبير. ويشمل 384 جيدا شكل لوحة الفحص على حد سواء الكمية (معايير النص) وشبه الكمية (الجينات التدبير المنزلي (HKG)) تدابير، والسماح لتحليلها من قبل عدد نسخ النص وΔCq على التوالي. التجمع دفعة، سهلت الآلي pipetting لمتعددة القنوات، والتخزين على المدى الطويل، ممكن من خلال تجفيف التمهيدي / مسبار (العلاقات العامة / الرصاص) يضع على لوحات، وتعزيز استنساخ، والمرافق، والتطبيق العملي للمقايسة.

يصف هذا البروتوكول عمليةلإعداد لوحات 384 جيدا QRT-PCR فحص (الشكل 1) مع ما يصل الى سبعة عشر مجموعات مختلفة العلاقات العامة / الرصاص استهداف فرعية IFN الإنسان (الجدول 1). ضبط العلاقات العامة / الرصاص العمل وتستخدم لوحات مصدر الأوراق المالية (الشكل 2) لإعداد متعددة 384 جيدا لوحات الفحص في عملية يمكن أن يكون آليا باستخدام متعددة القنوات pipettor الروبوتية. في حين كان التركيز في البداية على خلق بروتوكول لدراسة IFN التوقيعات التعبير الإنسان، وقد تم تطبيق هذا الأسلوب لقرود المكاك ريسوس كذلك. على الرغم من أن تخطيطات لوحة مختلفة قليلا ومجموعات العلاقات العامة / الرصاص (الجدول 2) ومتميز، وطريقة إعداد الكلي لخلق لوحات البشرية والقرد هو متطابقة. مع تعديلات طفيفة على البروتوكول، يمكن تنفيذ طريقة للسماح لتطوير المقايسات لدراسة مجموعات أخرى من الجينات ترتبط ارتباطا وثيقا.

انظر الشكلين 1 و 2 أدناه

انظر الجدولين 1 و 2 بيلآه

البروتوكول

1. إعداد التخفيفات معيار المسلسل (الشكل 3A)

ملاحظة: يتم استخدام سلسلة التخفيف المسلسل من البلازميدات خطي تحتوي على متواليات مستهدفة من قبل مجموعة العلاقات العامة / الرصاص من المعايير الكمية للمقايسة QRT-PCR. كل التسلسلي مجموعة التخفيف القياسي لفرعية IFN يحتوي على حجم ما يكفي لتشغيل 90 وحات الفحص. يتم اختيار أربع نقاط من منحنى التخفيف القياسية المستخدمة للمقايسة لتغطية القيم ط م من مجموعة من 20-32 (الجدول 3).

  1. ذوبان الجليد، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة مستوى (50 مساء) والحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية (SSDNA، 10 ملغ / مل) حلول الأسهم.
  2. تحضير مزيج SSDNA / الماء لمدة 17 مجموعات تخفيف القياسية عن طريق خلط 51 ميكرولتر من SSDNA مع 20.3 مل من الماء.
  3. تسمية واحدة 8-PCR أنبوب الشريط لمجموعة التخفيف القياسية.
    ملاحظة: سوف إعداد التخفيفات التسلسلية القياسية من الحلول الأسهم يستغرق 2-3 ساعة.
  4. الاستغناء 190 ميكرولتر من مزيج SSDNA / المياه إلى وأنبوب IRST في القطاع و180 ميكرولتر من SSDNA مزيج / المياه إلى أنابيب الخمسة المتبقية.
  5. إجراء 01:20 التخفيف عن طريق نقل 10 ميكرولتر من الأسهم 50 PM القياسي لأنبوب مع 190 ميكرولتر من SSDNA / المياه، المزيج؛ دوامة وسرعة أجهزة الطرد المركزي في قطاع PCR.
  6. أداء 1:10 التخفيف عن طريق نقل 20 ميكرولتر من الأنبوب تضعف معظم مؤخرا إلى أنبوب التالي في سلسلة؛ دوامة وسرعة أجهزة الطرد المركزي في قطاع PCR.
  7. كرر الخطوة 1.6 حتى أنبوب الماضي في سلسلة التخفيف تلقت المعيار.
  8. كرر الخطوات من 1.3-1.7 لكل معيار.

انظر الجدول 3 أدناه

2. إعداد التمهيدي / مسبار (العلاقات العامة / الرصاص) ولا قالب التحكم (NTC) العمل سهم المزج (الشكل 3B)

ملاحظة: تعيين كل 1.7 مل العلاقات العامة / الرصاص الأسهم و128.6 ميكرولتر لا تحكم قالب (NTC) العمل الاسهم مزيج سيجعل 30 لوحات فحص العمل.

  1. إعداد تعيين العلاقات العامة / الرصاص العمل يمزج الأسهم.
    NOTE: إعداد مجموعة العلاقات العامة / الرصاص وNTC الأسهم العمل يمزج من الحلول الأسهم سوف يستغرق 2-3 ساعة.
    1. Resuspend والاشعال وتحقيقات في 100 ميكرومتر مع الماء نقي للغاية لإعداد الحلول الأسهم.
    2. تسمية ما يصل الى سبعة عشر 2 مل أنابيب. واحد لكل مجموعة العلاقات العامة / الرصاص المدرجة في الفحص.
    3. ذوبان الجليد، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة الاشعال (100 ميكرومتر)، المسابير (100 ميكرومتر)، وSSDNA (10 ملغ / مل) حلول الأسهم.
    4. إضافة 2 ميكرولتر من SSDNA إلى كل أنبوب باستخدام 12.5 ميكرولتر ماصة الأقنية الإلكترونية. إضافة التمهيدي إلى الأمام المناسب، التمهيدي عكس، وتحقيق لتحديد كل العلاقات العامة / الرصاص العمل أنبوب الأسهم. انظر الجدول رقم 1 لمجموعات العلاقات العامة / الرصاص استهداف فرعية IFN الإنسان والجدول (2) لالمكاك ريسوس مجموعات العلاقات العامة / الرصاص. إضافة الماء لتبرزي حجم كل العلاقات العامة / مجموعة الرصاص العمل أنبوب الأسهم إلى 200 ميكرولتر.
      ملاحظة: حجم الاشعال، التحقيق، والماء لإضافة تعتمد على تركيز رد الفعل النهائي المطلوب من العلاقات العامة / الرصاصتعيين.
  2. إعداد يمزج الأسهم NTC العمل.
    1. التسمية قطعتين 5-PCR أنبوب لمخزون العمل NTC تختلط.
    2. نقل مجموعة 14.3 ميكرولتر من كل العلاقات العامة / الرصاص لمناسبة NTC يعمل مزيج الأسهم الأنبوب. انظر الجدول (4) لمجموعة العلاقات العامة / الرصاص توليفات للآبار المجلس الوطني الانتقالي. إضافة الماء إلى كل من الأسهم العمل NTC يمزج لجلب الحجم النهائي إلى 128.6 ميكرولتر.
    3. دوامة، لفترة وجيزة الطرد المركزي، ووضع الأنابيب في الظلام على الجليد أو في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.

انظر الجدول 4 أدناه

  1. تمييع تعيين العلاقات العامة / الرصاص الأسهم العمل.
    1. بعد إزالة قسامة من مجموعات العلاقات العامة / الرصاص اللازمة لNTC يمزج الأسهم العمل، إضافة 1.5 مل من الماء لتبرزي حجم النهائي لكل العلاقات العامة / الرصاص مجموعة العمل أنبوب الأوراق المالية إلى 1.7 مل.
    2. دوامة، لفترة وجيزة الطرد المركزي، ووضع الأنابيب في الظلام على الجليد أو في -20 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
3. إعداد لوحات فحص 384 جيدا باستخدام pipettor الأقنية الآلي

  1. إعداد لوحة مصدر 96-جيدا من مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويمزج المجلس الوطني الانتقالي لaliquoting إلى 384-جيدا لوحات الفحص.
    ملاحظة: إعداد لوحة مصدر من العلاقات العامة / الرصاص يمزج الأسهم عمل تستغرق أقل من 1 ساعة. كل لوحة مصدر 96-جيدا بما فيه الكفاية لجعل ست لوحات فحص 384 بئر (الشكل 3C).
    1. دوامة لفترة وجيزة الطرد المركزي تعيين العلاقات العامة / الرصاص الأسهم العمل وNTC يمزج الأسهم العمل.
    2. ضع جديدة لوحة 96-جيدا في برود كتلة التبريد 96-جيدا وتعيين الآبار لكل مجموعة العلاقات العامة / الرصاص أو NTC مزيج تتلقى الآبار (انظر الشكل 2).
    3. إضافة الماء إلى لوحة 96-جيدا باستخدام ماصة الأقنية 250 ميكرولتر الإلكترونية: الاستغناء عن 66 ميكرولتر من الماء لكل العلاقات العامة / مجموعة الرصاص جيدا (باستثناء 4 آبار للالهدف 17). الاستغناء 82.5 ميكرولتر من المياه إلى 4 الهدف 17 بئرا. الاستغناء 27.5 ميكرولتر من الماء لكل مزيج المجلس الوطني الانتقالي جيدا.
    4. إضافة تعيين الصحيح العلاقات العامة / الرصاص الأسهم عمل إلى الآبار المعينة من لوحة 96-جيدا: الاستغناء عن 54 ميكرولتر من الصحيح العلاقات العامة / الرصاص مجموعة الأسهم عمل إلى المعين العلاقات العامة / الرصاص مجموعة آبار (باستثناء 4 آبار للالهدف 17). الاستغناء 67.5 ميكرولتر من الهدف 17 العلاقات العامة / الرصاص ضبط المخزون عمل إلى المعين الهدف 17 العلاقات العامة / الرصاص مجموعة آبار. إضافة 22.5 ميكرولتر من الصحيح NTC يعمل مزيج الأسهم إلى الآبار المعينة.
    5. ختم لوحة 96-جيدا مع ختم لوحة اللصق وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 700 x ج لضمان محتويات هي في الجزء السفلي من الآبار.
    6. وضع لوحة 96-جيدا في الخلاط دوامة باستخدام محول لوحة 96-جيدا وتخلط لمدة 1 دقيقة في 1،000 دورة في الدقيقة. أجهزة الطرد المركزي لوحة 96-جيدا لمدة 5 دقائق في 700 ز س.
    7. تخزين لوحة مصدر 96-جيدا في الظلام في 4 درجات مئوية في حالة استخدام في نفس اليوم، وتخزين خلاف ذلك في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.
  2. إعداد لوحات 384 جيدا فحص بإضافة العلاقات العامة / الرصاص مجموعات باستخدام pipettor الأقنية الآلي.
    ملاحظة: إعداد ست لوحات فحص من لوحة مصدر 96-جيدا تأخذ 3-4 ساعة.
    1. قبل اتخاذ وحات، قبل البرد العش التبريد إلى 4 درجة مئوية، وقبل حرارة المبخر لوحة إلى 125 ° C وكتلة الحرارة أسفل إلى 80 درجة مئوية مع تدفق الهواء تهب بين 20-25 لتر لكل دقيقة (LPM).
    2. التبديل على pipettor الأقنية الآلي وفتح بروتوكول لصنع لوحات فحص IFN عن طريق النقر المزدوج على أيقونة البرنامج.
    3. لإعداد منصة، ووضع مربع طرف الماصة الكامل تماما في منصة موقف 1، لوحة مصدر 96-جيدا في الموقف 4، وصفيحة 384 بئر جديدة في الموقف 6. بيغن على المدى عن طريق الضغط على زر التشغيل.
      ملاحظة: عند الانتهاء من تشغيل كل سيحتوي بشكل جيد 5 ميكرولتر من العلاقات العامة / الرصاص المزيج.
      ملاحظة: المبلغ النهائي للSSDNA أضاف لكل بئر من لوحة فحص 384 جيدا هي 0.025 ميكروغرام.
    4. اضغط برفق لوحة فحص 384 جيدا على سطح مستو لضمان السوائل هي في الجزء السفلي من الآبار وتطبيق لاصقةلوحة الختم.
    5. أجهزة الطرد المركزي لوحة لمدة 1 دقيقة في 700 ز س. إزالة لوحة الختم لاصق، وضع لوحة 384 جيدا الفحص في مجفف لوحة ووضع مشعب 384 بئر مباشرة فوق الآبار.
    6. عندما محتويات لوحة فحص 384 البئر جافة، وتطبيق لوحة اللصق ختم الجديد، والتفاف في احباط، والتسمية، وتخزينها في الظلام في 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
      ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في 4 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.
    7. كرر الخطوات 3.2.3-3.2.6 حتى 6 × 384 بئر تم إعداد لوحات الفحص أو يتم استنفاد السائل في لوحة مصدر 96-جيدا.
    8. إيقاف العش التبريد، إغلاق البرنامج، وإيقاف pipettor الأقنية الآلي. إيقاف تشغيل مجفف وحة.

4. تحميل وتشغيل لوحة فحص 384 جيدا

  1. إعداد اثنين من الجينات التدبير المنزلي (HKG) جيدا يمزج، والتي تتكون من مجموعة العلاقات العامة / الرصاص لHKG، SSDNA، PCR مزيج الرئيسي، والماء، وتضاف إلى المجففة لوحة 384 جيدا الفحص ( الشكل 3D).
    ملاحظة: إعداد يمزج وسوف تحميل لوحة الفحص يستغرق 1-2 ساعة. سوف تشغيل لوحة الفحص تستغرق أقل من 2 ساعة.
    1. تسمية أنبوب 1.5 مل لكل مزيج HKG.
    2. تمييع 2 ميكرولتر من SSDNA (10 ملغ / مل) مع 84.9 المياه ميكرولتر. إضافة 2 ميكرولتر من SSDNA الواحد، 11.8 ميكرولتر من الماء، 23 ميكرولتر من مزيج الرئيسي، و 9.2 ميكرولتر من الصحيح 20x ووضع HKG العلاقات العامة / العلاقات العامة لكل أنبوب، الدوامة، لفترة وجيزة الطرد المركزي.
    3. استخدام نازعة غليسيرألدهيد-3-فوسفات (GAPDH) واليوبيكويتين C (UBC) مثل HKG للمقايسة البشري (انظر الجدول مواد). استخدام GAPDH و18S الريباسي RNA مثل HKG للمقايسة هندي صغير.
      ملاحظة: HKG استخدامها لإجراء الفحص مرنة وينبغي أن تعكس الجينات المناسبة لنوع من الخلايا التي يجري اختبارها GAPDH، UBC، و18S أمثلة شائعة الاستخدام HKG؛ آخر HKG قد تكون أكثر ملاءمة.
  2. تحضير العينة وpositiلقد السيطرة جيدا يمزج، والتي تتكون من عينة أو [كدنا السيطرة إيجابي، مزيج الرئيسي، والماء، وتضاف إلى المجففة لوحة فحص 384 أيضا. تحضير العينة ويمزج مراقبة إيجابية في كمية كافية ليستغني إلى 21 بئرا لوحة (الشكل 3D).
    1. قبل التوليف [كدنا، اتبع إرشادات الشركة المصنعة لتحضير عينات الحمض النووي الريبي مع خطوة الدناز الهضم.
    2. إعداد العينات ومراقبة إيجابية مقدما من التوليف [كدنا لا يقل عن 500 نانوغرام من الحمض النووي الريبي تليها العلاج مع ريبونوكلياز H (الحجم النهائي من 24 ميكرولتر لكل عينة) باتباع إرشادات الشركة المصنعة. تخزين [كدنا مستعد في -20 درجة مئوية حتى الاستخدام. ذوبان الجليد، الدوامة، وأجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على عينة [كدنا].
    3. إضافة 78.8 ميكرولتر من مزيج الرئيسي و 54.8 ميكرولتر من المياه لكل عينة 24 ميكرولتر وأنبوب السيطرة إيجابي.
    4. دوامة لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب.
  3. إعداد المعايير وNTC يمزج جيدا، ويخدعsisting من مزيج الرئيسي والماء، لتضاف إلى 384 المجففة جيدا لوحة فحص (الشكل 3D). لخلط المعايير جيدا، إضافة 165 ميكرولتر من المياه إلى 275 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في أنبوب 1.5 مل. لNTC تخلط جيدا، إضافة 52.5 ميكرولتر من الماء إلى 52.5 ميكرولتر من مزيج الرئيسي في أنبوب 1.5 مل. دوامة لفترة وجيزة الطرد المركزي الأنابيب.
  4. إعداد المجففة 384 جيدا لوحة فحص للتحميل من خلطات والعينات.
    1. إزالة المجففة لوحة 384 جيدا الفحص من 4 ° C وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 700 ز س.
    2. وضع لوحة على المبردة كتلة التبريد 384 جيدا، وإزالة لوحة ختم اللصق والخطوط العريضة للآبار من لوحة لتعيين حيث سيتم pipetted مختلف يمزج والعينات (الشكل 1).
  5. تحميل لوحة فحص 384 بشكل جيد مع مزيج جيد القياسية والمعايير، NTC تخلط جيدا، والعينات، مراقبة إيجابية، وHKG مزيج (الشكل 3E). دوامة لفترة وجيزة الطرد المركزي كل الحلول قبل الاستغناء على لوحة.
    1. الاستغناء 6 ميكرولتر من المعايير تخلط جيدا إلى كل بئر القياسية مع 30 ميكرولتر ماصة الأقنية الإلكترونية. الاستغناء 1.5 ميكرولتر من التخفيف التسلسلي القياسي الصحيح إلى المعين جيدا مع 12.5 ميكرولتر ماصة الأقنية الإلكترونية.
    2. الاستغناء 7.5 ميكرولتر من NTC تخلط جيدا إلى كل NTC جيدا مع 30 ميكرولتر ماصة الأقنية الإلكترونية. الاستغناء 7.5 ميكرولتر من العينة إلى الآبار المعينة مع 30 ميكرولتر ماصة الأقنية الإلكترونية. الاستغناء 2.5 ميكرولتر من HKG العلاقات العامة / الرصاص يمزج إلى الآبار المعينة مع 12.5 ميكرولتر ماصة الأقنية الإلكترونية.
    3. ملء أي آبار فارغة مع 7.5 ميكرولتر من الماء ومزيج الرئيسي خليط بقايا مع 30 ميكرولتر متعددة القنوات الإلكترونية ماصة. 7.5 ميكرولتر من الماء وحده سوف تعمل أيضا.
    4. ختم لوحة 384 جيدا الفحص مع الفيلم لاصقة البصرية وأجهزة الطرد المركزي لمدة 1 دقيقة في 700 ز س. دوامة مغلقة لوحة 384 جيدا في الخلاط دوامة لمدة 2 دقيقة في 2،600 دورة في الدقيقةوأجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 700 ز س.
    5. ضع مختومة 384 جيدا لوحة فحص في الجهاز QRT-PCR، افتح قالب للتخطيط فحص وبدء التشغيل.
      ملاحظة: النتائج يمكن تصديرها كجدول بيانات أو كملف نصي للتحليل.
    6. استخدام الحرارية ظروف التفاعل cycler على المثلى التالية للمقايسة: ط) 50 ° C لمدة 2 دقيقة، والثاني) 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة، الثالث) 95 درجة مئوية لمدة 25 ق، والرابع) 59 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة. كرر الخطوات من الثالث والرابع لمدة 40 دورات.
    7. تصدير البيانات الخام من منصة QRT-PCR إلى تطبيق البرمجيات جدول البيانات. رسم لكل معيار 4 نقطة النحو منحنى القياسية لمراقبة الخطي. إجراء تحليل عن طريق حساب ΔCq أو عدد النسخ على أساس منحنيات أربع نقاط القياسية 27.

انظر الشكل 3 أدناه

النتائج

وصف فحص QRT-PCR يمكن تنفيذها لتحليل أنماط التعبير من أنواع الأول والثالث IFN في مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا والسياقات. على سبيل المثال، تم تحليل نوع I بشر والثالث IFN التوقيعات التعبير في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) من حفزت 6 المانحين مع يغاندس TLR. بولي I: C (25 ميكروغرام / مل)، LPS (10 نانوغرام / مل)، إميكويمود (10 ميكرون)، و[أليغنوكليوتيد الدليل السياسي الشامل (1 ميكرومتر) (الشكل 4). وقد تم تحليل البيانات باستخدام برنامج تطبيق جداول البيانات وعرضها كما الخرائط الرادارية مع الأنواع الفرعية IFN-α رتبت في اتجاه عقارب الساعة وفقا لشجرة النشوء والتطور من تسلسل البروتين 27. يتم عرض الرسوم البيانية رادار التعبير IFN البشري في نطاق وسجل حسابها باستخدام طريقتين مختلفة من التحليل دمجها في تصميم فحص: القيمة المطلقة CQ تطبيع لHKG (ΔCq)، ونسخ عدد من القالب في ميكروغرام (ميكروغرام) من إجمالي RNA . يتم حساب القيم في عدد النسخ من نتائج س منحنى اتحاد كرة القدم نسخة القياسية. تظهر البيانات أن التوقيعات التعبير IFN الإنسان التي تسببها منبهات TLR محددة يجند.

انظر الشكل 4 أدناه

كما تبين للتوقيعات IFN التعبير الإنسان، الأول والثالث IFN في قرود المكاك ريسوس كنا التوقيعات التعبير من أنواع أيضا TLR يجند محدد. وقد حفز PBMC من 3 المانحين مع بولي I: C (50 ميكروغرام / مل)، LPS (10 ميكروغرام / مل)، وإميكويمود (10 ميكروغرام / مل) لمدة 3 ساعة (الشكل 5). كان IFN النوع الفرعي التعبير في الخلايا unstimulated في الأساس منخفضة. وأعرب عن عدد محدود من IFN- فرعية ردا على LPS وبولي I: C. في المقابل، كان IFN التعبير ردا على إميكويمود عالية وكان التعبير النوع الفرعي واسع. تم تعزيز التعبير عن الإنترفيرون β وIFN-λ1 من قبل جميع TLR ثلاثة منبهات 28.

انظر الشكل 5 أدناه

دائما "> figure-results-1
الشكل 1: تخطيط لوحة 384 جيدا الفحص مع سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص الهدف رقم يشير إلى مجموعة العلاقات العامة / الرصاص. يتم إضافة منحنيات القياسية أربع نقاط (المثلث الرمادي الداكن) إلى الأعمدة 1-5. يتم إضافة مجموعات HKG العلاقات العامة / الرصاص (خلفية بيضاء) إلى أعمدة 6 و 7. الأعمدة المتبقية، 8-24، هي محددة لواحدة من سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص. يتم إضافة عينات لصفوف AP، من أعمدة 6-24 (الأسهم السوداء). وبئرين (O5، P5) في الجزء السفلي من العمود 5 تتلقى الماء فقط ومزيج الرئيسي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2: تخطيط لوحة مصدر 96-جيدا مع سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويشير العدد المستهدف إلى العلاقات العامة / الرصاصتعيين. السهام السوداء تمثل عند إضافة مجموعة العلاقات العامة / الرصاص إلى الآبار متعددة. تضاف يمزج المجلس الوطني الانتقالي إلى الآبار المعينة (خلفية رمادية داكنة). وبئرين (F3، G3) مع الخطوط القطرية غير المستخدمة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
الشكل 3: تخطيطي من الخطوات المحددة في البروتوكول فحص QRT-PCR AE الرسم البياني اختيار أجزاء من البروتوكول. (A) الخطوة 1: إعداد التخفيفات التسلسلية القياسية. (ب) الخطوة 2: إعداد العلاقات العامة / الرصاص وNTC يمزج الأسهم العمل. (C) الخطوة 3.1: إعداد الأسهم لوحة العمل 96-جيدا من مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويمزج المجلس الوطني الانتقالي. (D) الخطوة 4،1-3: إعداد يمزج لتحميل لوحة فحص 384 أيضا. (Estالجيش الشعبي 4.5: تحميل لوحة فحص 384 أيضا. وقراءة الرسوم البيانية من أعلى اليسار إلى أسفل الزاوية اليمنى. يتم تخزين الكواشف لفيروسات (IFN) فحص في -20 درجة مئوية ومدرجة في العمود الأيسر. خطوط إجراءات منفصلة في البروتوكول. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
يختلف توقيع IFN التعبير البشري في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) ردا على بروابط TLR تستخدم لتحفيز PBMC وحفز مع يغاندس TLR وكان حصادها RNA لتحليل QRT-PCR: الشكل 4. وسائل هندسية الردود الذروة إلى بولي I: C (25 ميكروغرام / مل) في 8 ساعة (المربعات الحمراء)، LPS (10 نانوغرام / مل) في 4 ساعة (مثلثات خضراء)، إميكويمود (10 ميكرومتر) في 16 ساعة ( الماس الأرجواني)، الدليل السياسي الشامل (1 ميكرومتر) فيوترد 16 ساعة (الدوائر السوداء)، والسيطرة unstimulated في 16 ساعة (الدوائر الزرقاء) في الفترة من 6 المانحين في سجل 10 الحجم بوصفها وظيفة من التعبير عن HKG UBC ΔCq (يسار) أو رقم نسخة لكل ميكروغرام من الحمض النووي الريبي (يمين) . يتم ترتيب الأنواع الفرعية IFN-α فقا لمؤامرة النشوء والتطور من الأحماض الأمينية تسلسل التشابه. وقد نشر هذا الرقم في الأصل في علم المناعة وعلم الأحياء الخلوي 27.

figure-results-5
الشكل 5: يختلف المكاك ريسوس IFN توقيع التعبير في خلايا الدم وحيدات النوى المحيطية (PBMC) ردا على بروابط TLR تستخدم لتحفيز PBMC من ثلاثة قرود المكاك ريسوس (المعين من قبل مربع، والماس، والمثلث) تم عزل من الدم الكامل و حفز مع lipopolysaccharide في (LPS) (10 ميكروغرام / مل)، وبولي I: C (50 ميكروغرام / مل) أو إميكويمود (10 ميكروغرام / مل). تم حصاد الخلايا في 0 ساعة (مكتب مستشار رئيس الوزراءن الأشكال) أو بعد 3 ساعات من التحفيز TLR (الأشكال المغلقة) لقياس IFN التعبير. يتم عرض مستويات النص من النوع I، II، III وIFN في سجل 10 الحجم بوصفها وظيفة من التعبير عن HKG GAPDH ΔCq (يسار) أو نسخة رقم / ميكروغرام RNA (يمين). وقد نشر هذا الرقم أصلا في مجلة الانترفيرون وخلوى بحوث 28.

figure-results-6
الجدول 1: IFN البشري التمهيدي / مسبار مجموعة سلاسل ورد فعل من المعلومات يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.

figure-results-7
الجدول 2: مكاك ريسوسي IFN التمهيدي / مسبار مجموعة سلاسل ورد فعل من المعلومات يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.

تركيز البلازميد (FM)
A B C D
IFN-α1 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α2 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α4 2500 250 25 2.5
IFN-α5 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α6 250 25 2.5 0.25
IFN-α7 250 25 2.5 0.25
IFN-α8 250 25 2.5 0.25
IFN-α10 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α14 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α16 250 25 2.5 0.25
IFN-α17 25 2.5 0.25 0.025
IFN-α21 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ1 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ2 25 2.5 0.25 0.025
IFN-λ3 250 25 2.5 0.25
IFN-β 25 2.5 0.25 0.025
IFN-ω 250 25 2.5 0.25

الجدول 3: المعلومات تركيز مجموعة التخفيف القياسية.

مجموعات IFN العلاقات العامة / الرصاص وأضافت حجم الماء المضاف (مل)
NTC 1 IFN-β، -ω، -λ3 85.7
NTC 2 IFN-α1، -α5 100.0
NTC 3 IFN-α2 114.3
NTC 4 IFN-α4 114.3
NTC 5 IFN-α7 114.3
NTC 6 IFN-α6، -α8، -α10 85.7
NTC 7 IFN-α14، -α16 100.0
NTC 8 IFN-α17 114.3
NTC 9 IFN-α21، -λ1 100.0
NTC 10 IFN-λ2 114.3

الجدول 4: NTC الأسهم العمل يمزج المعلومات.

المناقشة

ويصف هذا التقرير التصميم والإنتاج دفعة، وهذا النهج نحو تحليل لفحص لقياس النسخ من مجموعة من الجينات مماثلة إلى حد كبير في إعداد مختبر الأبحاث. الفحص QRT-PCR عالية الإنتاجية ذكرت هنا يقيس IFN- و- فرعية λ مع خصوصية عالية. يتضمن هذا الأسلوب جانبين رئيسيين، وتصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص التي تميز بين أفراد من عائلة الجينات المتماثلة وتطوير منصة الإنتاج لخلق لوحات فحص 384 جيدا موثوقة ومتسقة مسبقة مع مجموعات العلاقات العامة / الرصاص. تحقيقات QRT-PCR تشتمل على (MB) أو كيميائية (LNA) النهج الهيكلي نحو تعزيز خصوصيتها 29. لاثنين من مجموعات التمهيدي في مقايسة هندي صغير (الجدول 2)، وقد أدرج النظام الطفرة التضخيم صهر (ARMS) في تسلسل التمهيدي لمواصلة تعزيز خصوصية 30. في حين كان من عادة أفضل لاستهداف تقاطعات اكسون-اكسون لenhaالامتحانات التنافسية الوطنية خصوصية رد فعل QRT-PCR، وكان هذا غير ممكن لأن النوع الأول الإنترفيرون الجينات تفتقر الإنترونات. لذلك، سوف تتضخم الحمض النووي الجيني في رد فعل PCR، ويجب أن تدهورت بفعل العلاج الدناز بعد استخراج الحمض النووي الريبي.

كان مقتصرا على المنطقة المستهدفة لمجموعات العلاقات العامة / الرصاص إلى المناطق الترميز من الببتيد ناضجة لكل IFN. بسبب تشابه تسلسل عالية بين الأنواع الفرعية-α IFN، وخاصة في المنطقة الببتيد ناضجة، كان من الضروري في بعض الأحيان للتنازل حساسية لضمان خصوصية. كان هذا هو الحال بصفة خاصة مع IFN-α17، حيث الببتيد نسخة ناضجة لديها سوى أربعة قواعد فريدة بالمقارنة ضد أخرى فرعية IFN-α. استهداف IFN-α17 المطلوبة الاشعال التي تربط بين نصوص فرعية متعددة، وتقييد خصوصية إلى التحقيق. ونتيجة لذلك، فإن رد فعل PCR تضخيم أنواع فرعية أخرى من الإنترفيرون α17، وبالتالي تستهلك نسبة كبيرة من الكواشف PCR وloweriنانوغرام اتساع إشارة مضان من التحقيق محدد لIFN-α17. تحديا إضافيا نحو تصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص حساسة ومحددة لجينات مشابهة إلى حد كبير مثل IFN هو إمكانية أن تسلسل المشروح في قاعدة بيانات بنك الجينات قد لا تكون كاملة أو شاملة في وقت التصميم. مرة أخرى، كان هذا تحديا لIFN-α17، التي متواليات المشروح حديثا لا تتفق تماما مع إصدار تسلسل في قاعدة البيانات في وقت التصميم. لذلك، عند تصميم العلاقات العامة / الرصاص يحدد الجينات التي لم يتم دراستها بشكل مكثف، فإنه من الحكمة أن تحقق بشكل دوري على أحدث تسلسل المشروح من الجين المستهدف. وأخيرا، لا بد من التأكد من أن مجموعات العلاقات العامة / الرصاص لا تضخيم الكاذبة التي يمكن نسخها ولكن لا تترجم.

بعد تصميم مجموعات العلاقات العامة / الرصاص، فإن التحدي التالي هو الأمثل الظروف PCR من سبعة عشر مختلف العلاقات العامة / الرصاص يضع على واحد لوحة 384 جيدا. المعايير هي نسخة المجمدةتانت في اختبار خصوصية مجموعة العلاقات العامة / الرصاص وتصبح ضرورية لمواءمة الظروف QRT-PCR العديد من ردود الفعل PCR مختلفة. اختبار مجموعة العلاقات العامة / الرصاص ضد معايير النص يؤسس كفاءتها وحساسية. البلازميدات التي تعبر عن الكاذبة مماثلة للغاية قد تكون ضرورية لضمان أن العلاقات العامة / الرصاص ضبط يقيس بشكل انتقائي نسخ من الجين وظيفية. كما توفر معايير النص وسيلة الكمية للتحليل (عدد النصوص)، بالإضافة إلى تحليل نسبة شبه الكمية لجين التدبير المنزلي (ΔCq).

الروبوتية pipetting لمتعددة من لوحة مصدر 96-جيدا الى عدة 384-جيدا لوحات فحص يحسن من دقة واتساق النتائج المشترك بين لوحة. ويستخدم الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية (SSDNA) باعتبارها الناقل أن تستقر ويحافظ على مجموعات العلاقات العامة / الرصاص للتخزين على المدى الطويل، وكذلك تجفيف الكواشف الاستغناء في لوحات. تجفيف لوحات أيضا يقلل من حجم رد الفعلالضرورة من أجل تحقيق النتائج استنساخه، والذي بدوره يحافظ على عينات الثمينة ويقلل من استخدام الكواشف مكلفة. من خلال هذه الخطوات، يتم تجميع دفعات من لوحات التي توفر الدقة والاتساق لأكثر من ستة أشهر.

وبعد إعداد لوحة، وتدابير مراقبة الجودة حاسمة للتحقق من اتساق مجموعة من لوحات. لهذا الغرض، يتم تشغيل على أربع مجموعات إضافية من المعايير على طبق من ذهب. لوحة "المعيار 5X" مسارات الأداء ويخلق مجموعة من البيانات التي تتم مقارنة معايير لوحة الفرد. في حين تستخدم عشرة التخفيفات 10 أضعاف من كل معيار خلال تصميم الفحص، تتطلب اعتبارات المساحة التي أربع نقاط وتستخدم لمنحنى قياسي على كل لوحة الفحص، وبالنسبة للوحة القياسية 5X. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي أن تدرج تحكم إيجابية على كل لوحة لضمان صحة اللوحة.

عادة، فإنه يأخذ 3-4 ساعة لإعداد ست لوحات فحص من أحد العلاقات العامة / الرصاص الصورةلوحة ource. فمن الممكن لإعداد اثني عشر لوحات في يوم واحد في مختبر الأبحاث. لأن كل لوحة IFN النوع الفرعي فحص الإنسان تدرس سبعة عشر مجموعات العلاقات العامة / الرصاص ويمكن أن تستوعب خمسة عشر العينات التجريبية، يوم واحد من التجمع تنتج مجموعة من لوحات لديها القدرة على توليد ما يصل إلى 3،060 نقاط البيانات التجريبية. يمكن معالجة البيانات الخام من منصة QRT-PCR وتجميعها باستخدام البرامج النصية البرمجة في برنامج تطبيق جدول لملء قالب تحليل المصممة مسبقا تلقائيا. هذا الأسلوب يقلل التدريب العملي على إدخال البيانات، وبالتالي منع أخطاء النسخ ويسمح للمحقق للتركيز على تحليل البيانات بدلا من تجميع البيانات. كما هو موضح هنا، وهذا QRT-PCR فحص عالية الإنتاجية يمكن تطبيقها لقياس التعبير عن الأنواع الفرعية فيروسات في عينات المكاك البشري أو هندي صغير ويمكن أن تتكيف مع استخدام لأنواع أخرى أو مجموعات الجينات المتماثلة. المرونة في تخطيط لوحة تسمح للمستخدم لتغيير التمهيدي / مسبار يحدد لتكييف جيناتالفائدة نحو نوع من الخلايا معين أو نظام نموذجي. هذا الاختبار يمكن تطبيقها لقياس IFN التوقيعات التعبير في نماذج ثقافة الخلية دراسة مسببات الأمراض أو في عينات من المرضى في سياق نماذج المرض لتوضيح آليات إشارات تشارك في الاستجابة المناعية.

الإفصاحات

VPM و RLR هما مخترعان مشاركان للتكنولوجيا لقياس التعبير عن الأنواع الفرعية IFN و IFN والحصول على دخل الإتاوة منها. يعلن المؤلفون الباقون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل CBER / FDA-NIAID / NIH المشتركة بين الوكالات اتفاق YI-AI-6153-01، وصناديق جماعية FDA / CBER، ومبادرة المضادة الطبية FDA. TCT، MNB، VPM، LMS، وتم دعم KDK التي كتبها موعد لبرنامج المشاركة البحوث في مركز التقييم البيولوجي والأبحاث من قبل معهد أوك ريدج للتربية والعلوم تدار من خلال اتفاق بين الوكالات بين الأقسام الأدبية الطاقة في الولايات المتحدة والولايات المتحدة إدارة الغذاء والدواء.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
0.2 مل شرائط أنبوب PCR Eppendorf (Westbury ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)E0030 124 286
ماصة إلكترونية معادل 384 ذات 12 قناة ، 0.5-12.5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)14-387-139*
ماصة إلكترونية معادل 384 متوقفة 12 قناة ، 1-30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)14-387-137
ماصة إلكترونية متوقفة من 12 قناة ، 5-250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)14-387-118* أنبوب
الطرد المركزي الصغير 2.0 مل ،Celltreat العلمية المعقمة (شيرلي ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)229446
ماصة إلكترونية ذات 8 قنوات ، 15-1250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)14-387-115
الكاشف التي تستخدم لمرة واحدة متوقفة   ؛VWR International (رادنور ، بنسلفانيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)89094-668خزانات 25 مل مع 2 فواصل
E-CentrifugeWealtec Corp. (سباركس ، نيفادا ، الولايات المتحدة الأمريكية)1090003
حقيقيات النواة 18S rRNA (18S) الأنظمةالحيوية التطبيقية (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)Hs99999901_s1Rhesus HKG التمهيدي / المسبار
ثابتة السرعة الدوامة الصغيرةالحرارية فيشر العلمية (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)02-215-360
ختم لوحة لاصقة نفاذة للغازThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)AB-0580ختم لوحة يمكن التخلص منه يستخدم أثناء عملية تحضير اللوحة   ؛
نازعة هيدروجين الجلسرالديهايد -3-فوسفات (GAPDH)FBR (سيلفر سبرينج ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية)طلب مخصصHuman HKG التمهيدي / مجموعة المسبار
جلسرالديهايد -3-فوسفات نازعة هيدروجين (GAPDH) الأنظمةالحيوية التطبيقية (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)Rh02621745_g1Rhesus HKG التمهيدي / مجموعة المسبار
Hudson Solo ماصة أوتوماتيكية متعددة القنوات   ؛Hudson Robotics (سبرينغفيلد ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)800200معدلة مع 384 بئر تبريد
بلازميدات خطية (جينات IFN)Aldevron (Fargo ، ND ، الولايات المتحدة الأمريكية) بندالطلبالمخصص 3000 ، 3580 ؛ تستخدم لمعايير الفحص   ؛
مثبطات LNAExiqon (Woburn ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)عنصر الطلب المخصص500100
LNA ProbesSigma-Proligo (سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية)طلب مخصصرقم المادة VC00023
نصائح ماصة مصفاة مصفوفة ، 12.5 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)14-387-193
نصائح ماصة مصفاة مصفوفة ، 30 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)14-387-196
نصائح ماصة ممتدة الطول من Matrix TallTip ، 1،250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)14-387-160
Matrix TallTip Extended Length Pipepet Tips ، 250 ulThermo-Fisher Scientific (Waltham ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)14-387-152
MicroAmp Optical 384-Well Reaction Plate معأنظمة حيوية تطبيقية للباركود (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)4309849
MicroAmp Optical 96-Well Reaction PlateApplied Biosystems (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)N8010560
MicroAmp Optical Adhesive FilmApplied Biosystems (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)4311971فيلم لاصق يستخدم لإغلاق اللوحة قبل تشغيل qRT-PCR   ؛
جدول بيانات Microsoft Excel 2010Microsoft (Redmond ، WA ، الولايات المتحدة الأمريكية)  لغة برمجة Office 2010Visual Basic 
MixMate Vortex MixerEppendorf (ويستبري ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)5353 000.014جهاز دوامة لوحة ثنائية الأبعاد
مجسات منارة جزيئيةFBR (سيلفر سبرينغ ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية)مبرد PCR مخصص للطلب
، نظام تخزين بارد بدون ثلج ل 96 لوحة بئر وأنابيب PCREppendorf (ويستبري ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)Z606634-1EA
مجفف الألواح (مشعب)تصنيع التصميم الميكانيكي والكهربائي ، مكتب المعاهد الوطنية للصحة لخدمات الأبحاث (بيثيسدا ، ماريلاند ، الولايات المتحدة الأمريكية)للطلب
المخصص FBR (سيلفر سبرينغ ، دكتوراه في الطب ، الولايات المتحدة الأمريكية)طلب
pUC57 البلازميد DNAGenescript (بيسكاتواي ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)SD1176
1.5 مل خالية من رناز أنابيب الطردالدقيقة تقنيات الحياة (جراند آيلاند ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)AM12400
DNase خال من RNase مجموعة (50)Qiagen (فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)79254
RNase HNew England Biolabs (Ipswitch ، MA ، الولايات المتحدة الأمريكية)M0297L
RNeasy Mini Kit (250)Qiagen (فالنسيا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)74106
نصائح روبوت (طرف شفاف أطراف ماصة معقمة مسبقا)Hudson Robotics (سبرينغفيلد ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)800350-S
محلول الحمض النووي للحيوانات المنوية السلمونInvitrogen (كارلسباد ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)15632-011
SoftLinx الإصدار VHudson Robotics (سبرينغفيلد ، نيوجيرسي ، الولايات المتحدة الأمريكية)طلب مخصصلبرمجة خطوات سحب العينات
TaqMan Fast Universal PCR Master Mix (2x) ، no AmpErase UNGLife Technologies (Grand Island ، نيويورك ، الولايات المتحدة الأمريكية)4352042
أختام الألواح اللاصقة ABgene   ؛  Thermo-Fisher Scientific (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)AB0580
Ubiquitin C (UBC) الأنظمةالحيوية التطبيقية (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)Hs01871556_s1HKG التمهيدي / المسبار
تخليق Verso cDNAThermo-Fisher Scientific (والثام ، ماساتشوستس ، الولايات المتحدة الأمريكية)AB1453B
ViiA 7 نظام PCR في الوقت الحقيقيالأنظمة الحيوية التطبيقية (فوستر سيتي ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية)4453536
Water-Ultra PureQuality Biological ، INC. (Gaithersburg ، MD ، الولايات المتحدة الأمريكية)351-029-101
Zipvap 384 (عنصر تسخين مجفف الألواح)Glas-Col LLC (Terre Haute ، IN ، الولايات المتحدة الأمريكية)مجفف الألواح384-109A
* منتجات * خزانات مجموعة مجموعة مجموعات التمهيدي مخصصبرنامج مجموعة البشرية مجموعة

المراجع

  1. Yan, N., Chen, Z. J. Intrinsic antiviral immunity. Nature. 13, 214-222 (2012).
  2. Pestka, S., Krause, C. D., Walter, M. R. Interferons, interferon-like cytokines, and their receptors. Immunological reviews. 202, 8-32 (2004).
  3. Baum, A., Garcia-Sastre, A. Induction of type I interferon by RNA viruses: cellular receptors and their substrates. Amino acids. 38, 1283-1299 (2010).
  4. Kotenko, S. V., et al. IFN-lambdas mediate antiviral protection through a distinct class II cytokine receptor complex. Nature. 4, 69-77 (2003).
  5. Hardy, M. P., Owczarek, C. M., Jermiin, L. S., Ejdeback, M., Hertzog, P. J. Characterization of the type I interferon locus and identification of novel genes. Genomics. 84, 331-345 (2004).
  6. Cheon, H., et al. IFNbeta-dependent increases in STAT1, STAT2, and IRF9 mediate resistance to viruses and DNA damage. The EMBO journal. 32, 2751-2763 (2013).
  7. Schneider, W. M., Chevillotte, M. D., Rice, C. M. Interferon-stimulated genes: a complex web of host defenses. Annual review of immunology. 32, 513-545 (2014).
  8. Hiscott, J., Nguyen, T. L., Arguello, M., Nakhaei, P., Paz, S. Manipulation of the nuclear factor-kappaB pathway and the innate immune response by viruses. Oncogene. 25, 6844-6867 (2006).
  9. Alcami, A., Symons, J. A., Smith, G. L. The vaccinia virus soluble alpha/beta interferon (IFN) receptor binds to the cell surface and protects cells from the antiviral effects of IFN. Journal of virology. 74, 11230-11239 (2000).
  10. Huang, J., et al. Inhibition of type I and type III interferons by a secreted glycoprotein from Yaba-like disease virus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104, 9822-9827 (2007).
  11. Bidwell, B. N., et al. Silencing of Irf7 pathways in breast cancer cells promotes bone metastasis through immune escape. Nature medicine. 18, 1224-1231 (2012).
  12. Di Domizio, J., Cao, W. Fueling autoimmunity: type I interferon in autoimmune diseases. Expert review of clinical immunology. 9, 201-210 (2013).
  13. Crow, Y. J., Casanova, J. L. STING-Associated Vasculopathy with Onset in Infancy - A New Interferonopathy. The New England journal of medicine. , (2014).
  14. Bermel, R. A., Rudick, R. A. Interferon-beta treatment for multiple sclerosis. Neurotherapeutics : the journal of the American Society for Experimental NeuroTherapeutics. 4, 633-646 (2007).
  15. Kingham, J. G., et al. Treatment of HBsAg-positive chronic active hepatitis with human fibroblast interferon. Gut. 19, 91-94 (1978).
  16. Heathcote, J., Main, J. Treatment of hepatitis C. Journal of viral hepatitis. 12, 223-235 (2005).
  17. Donnelly, R. P., Dickensheets, H., O'Brien, T. R. Interferon-lambda and therapy for chronic hepatitis C virus infection. Trends in immunology. 32, 443-450 (2011).
  18. Castaigne, S., et al. Interferon alpha in the treatment of hairy cell leukemia. Cancer. 57, 1681-1684 (1986).
  19. Kumar, L., Basade, M., Gulati, S. C. Role of interferon-alpha in chronic myeloid leukemia. The Journal of the Association of Physicians of India. 3, 26-32 (1995).
  20. Dai, C., et al. Interferon alpha on NZM2328.Lc1R27: Enhancing autoimmunity and immune complex-mediated glomerulonephritis without end stage renal failure. Clinical immunology (Orlando, Fla.). 154, 66-71 (2014).
  21. Maeda, S., et al. Interferon-alpha Acts on the S/G2/M Phases to Induce Apoptosis in the G1 Phase of an IFNAR2-Expressing Hepatocellular Carcinoma Cell Line. The Journal of biological chemistry. , (2014).
  22. Xia, C. Q., et al. Increased IFN-alpha-Producing Plasmacytoid Dendritic Cells (pDCs) in Human Th1-Mediated Type 1 Diabetes: pDCs Augment Th1 Responses through IFN-alpha Production. Journal of immunology. 193, 1024-1034 (2014).
  23. Hervas-Stubbs, S., et al. Conventional but not plasmacytoid dendritic cells foster the systemic virus-induced type I IFN response needed for efficient CD8 T cell priming. Journal of immunology. 193, 1151-1161 (2014).
  24. Manry, J., et al. Evolutionary genetic dissection of human interferons. The Journal of experimental medicine. 208, 2747-2759 (2011).
  25. Chen, J., Baig, E., Fish, E. N. Diversity and relatedness among the type I interferons. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 24, 687-698 (2004).
  26. Fox, B. A., Sheppard, P. O., O'Hara, P. J. The role of genomic data in the discovery, annotation and evolutionary interpretation of the interferon-lambda family. PloS one. 4, e4933(2009).
  27. Hillyer, P., et al. Expression profiles of human interferon-alpha and interferon-lambda subtypes are ligand- and cell-dependent. Immunology and cell biology. 90, 774-783 (2012).
  28. Schramm, L. M., et al. High-throughput quantitative real-time polymerase chain reaction array for absolute and relative quantification of rhesus macaque types I, II, and III interferon and their subtypes. Journal of interferon & cytokine research : the official journal of the International Society for Interferon and Cytokine Research. 32, 407-415 (2012).
  29. Wang, Q., Chen, L., Long, Y., Tian, H., Wu, J. Molecular beacons of xeno-nucleic acid for detecting nucleic acid. Theranostics. 3, 395-408 (2013).
  30. Little, S., et al. Amplification-refractory mutation system (ARMS) analysis of point mutations. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines ... [et al.]. 9 (Unit 9 8), (2001).

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تعبير النمط الفرعي للإنترفيرونمسابير الحمض النووي المقفلمسابير المنارة الجزيئيةتنسيق لوحة ذات 384 بئراًالسحب الآلي متعدد القنواتبروتوكول تجفيف اللوحةتحليل إنترفيرون النوع الأولتحليل إنترفيرون النوع الثالثتوصيف التعبير الجيني
عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.