يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

Mammosphere تشكيل الفحص من الثدي البشري سرطان الأنسجة وخطوط الخلايا

33.3K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52671

⸱

مارس 22, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Surgery and Cancer, Imperial College London

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يمكن لمقايسات الماموسفير العائم التحقيق في مجموعة فرعية من خلايا سرطان الثدي الشبيهة بالجذع والتي تعيش في ظروف التعليق وتظهر تكوين الأورام المحسنا عند زرعها في الفئران. يوفر هذا البروتوكول مقياسا مناسبا في المختبر لقدرة تكوين الكرة ، وهو وكيل لتكوين الأورام في الجسم الحي ، مع تسهيل تحليل مشهد النسخ المرتبط بالساق.

الملخص

وعلى غرار الأنسجة السليمة، وكثير من الدم والأورام الخبيثة الصلبة ويعتقد الآن أن يتم تنظيم هرمي، مع مجموعة فرعية من الخلايا السرطانية الشبيهة الجذعية التي تجدد الذاتي بينما مما أدى إلى سلالة أكثر متباينة. فهم واستهداف هذه الخلايا الجذعية السرطانية في سرطان الثدي، والتي قد تكون في حوزتها تعزيز chemo- والمقاومة الراديو مقارنة مع غير الجذعية للورم بكميات كبيرة، وأصبحت مساحة البحثية الهامة. علامات بما في ذلك CD44، CD24، والنشاط ALDH يمكن تقييم باستخدام مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) لعزل خلايا مستقبلي يتم عرضها تعزيز tumorigenicity عندما زرعها في الفئران المناعة: أصبح الفحص mammosphere أيضا تستخدم على نطاق واسع لقدرته على تحديد بأثر رجعي sphere- تشكيل الخلايا التي وضع من جذع واحد تشبه الخلايا المستنسخة. نحن هنا تحديد النهج لزراعة المناسبة من mammospheres من خطوط الخلايا أو عينات المرضى الأولية، والركض بها وحسابات لتقدير المجال وكفاءة orming (SFE). أولا نحن مناقشة الاعتبارات والعثرات الرئيسية في تخطيط وتفسير التجارب mammosphere المناسب.

المقدمة

وجود الأنساب الخلية السرطانية برئاسة الخلايا الجذعية السرطانية الشبيهة الجذعية قد أضاف إلى حد كبير في فهمنا للورم عدم التجانس. في حين أن بعض التنوع المظهري في الأورام لا تنشأ من ثمرة نسيلي من الحيوانات المستنسخة متميزة وراثيا، يظهر عنصر جوهري أن تنجم عن الاختلافات جينية: يمكن أن الخلايا السرطانية الانتقالية (في بعض الأحيان عكسية) بين الجذعية، والسلف، والدول المتباينة عبر تفعيل أو قمع جين معين برامج التعبير 1 - 3. قد تعكس هذه الخلية العوامل الجوهرية أو خارجي، مما يعكس برنامج التعبير الجيني يجري أعرب حاليا في زنزانة مع إشارات لها autocrine الناتجة بالتزامن مع إشارات نظير الصماوي من مرض السرطان، اللحمية أو الخلايا المناعية المجاورة تقديم عوامل تغييري، والظروف microenviromental مثل درجة نقص الأكسجة 2،4،5.

على الرغم من أن النسب تتبع النهج المبتكرة تتقدم قدرتنا على دراسة الخلايا الجذعية السرطانية في الجسم الحي المفترضة في من مكانة 6-8، تبقى المقايسات تشكيل المجال نهج شعبية ومريحة لتقدير إمكانات خلايا سرطان الثدي "تتصرف مثل الخلايا الجذعية، على الأقل وفقا للشروط الفحص المستخدمة. وكثيرا ما يستخدم جنبا إلى جنب مع أساليب بأثر رجعي للخلايا الجذعية السرطانية تنقية، من خلال التعبير عنها من علامات غشاء CD44 CD24 و9، ومستويات نشاط الإنزيم ALDH (ألدهيد نازعة) 10، علامات التي تم اقتراحها لتتوافق مع أكثر mesenchymal- والظهارية الخلايا الجذعية السرطانية موازية على التوالي 11. وقد تم تطوير هذا النهج تشكيل المجال لأول مرة كما مقايسة neurosphere، مما يتيح نمو الخلايا الجذعية المفترضة من الحيوانات المستنسخة واحدة في غير ملتصقة، ظروف خالية المصل مع إضافة عامل النمو الظهاري (EGF) 12، في وقت لاحق يجري تطبيقها بشكل مفيد إلى وضعها الطبيعي وسرطانية أنسجة الثدي.

ق ق = "jove_content"> هوية الخلية مؤسس تشكيل المجال، وأنواع الخلايا المختلطة المكونة لكتلة المجال، هي ذات الصلة لالاستدلالات التي يمكن أن تكون مصنوعة من mammo-، أو غيرها من مجال تشكيل المقايسات. الخلايا على المدى الطويل العظام هادئة الحسنة الجذعية، يعتقد للراحة في مرحلة G0، سوف لا تواجه مزيج دقيق من العوامل التي من شأنها أن صالح التنشيط في الجسم الحي. الفحص mammosphere بدلا تمكن من نمو الخلايا إما معلقا لتقسيم الإنقسامية أو تقسيم بالفعل 13. هذه الأسلاف، وإن لم يكن خلية هادئة حقا، قد يكون مرحلة الخلية التي يتكاثر مع mitogens EGF وعامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (bFGF) المستخدمة في الفحص. ومع ذلك، أنها تحتوي على مجموعة من الجذعية تنشيط الخلايا المرتبطة مسارات الإشارات 14. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معدل تكونها يتصل tumorigenicity من الأنسجة التي أخذت من، عندما تقاس قوتها في المقايسات تخفيف محدود في xenografts الماوس 2،15،16 </ سوب>.

هنا نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لعزل الخلايا واحد وتوليد mammospheres الأساسي من كل من خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية والعينات السريرية للأورام الثدي. وصفنا أيضا كيفية تنفيذ الممرات المسلسل mammospheres الأولية لتقييم التجديد الذاتي، وكيفية حساب المجال تشكيل الكفاءة التي تسمح المقارنة بين الكثافة البذر مختلفة (انظر المخطط في الشكل 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

الإجراءات أدناه وقد تمت الموافقة على أخلاقيا من قبل كلية امبريال في لندن.

1. توليد Mammospheres الابتدائية من الثدي البشري خطوط الخلية السرطانية

ملاحظة: نفذ الخطوات التالية تحت غطاء الثقافة العقيمة.

  1. إعداد Mammosphere وسائل الإعلام التي تحتوي على DMEM / F12 تستكمل مع 2 مم L-الجلوتامين، و 100 U / البنسلين مل، و 100 U / الستربتومايسين مل. إعداد وسائل الإعلام كاملة فورا قبل الاستخدام عن طريق إضافة 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة المؤتلف الإنسان (EGF، سيغما)، و 10 نانوغرام / مل عامل أساسي من حقوق الإنسان المؤتلف نمو الخلايا الليفية (bFGF، أنظمة R & D) و1X B27 الملحق.
  2. وسائل الإعلام نضح من قارورة تحتوي على MCF-7 أو MDA-MB-231 الخلايا الملتصقة (أو خط خلايا سرطان الثدي من اختيارك، 70-80٪ التقاء)، ويغسل مرتين في برنامج تلفزيوني 1X، ويعرض للتريبسين الخلايا.
  3. خلايا الطرد المركزي في 200 x ج في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. الخلايا طاف و resuspend صب في 1-5 مل من وسائل الإعلام mammosphere. ماصةصعودا وهبوطا وإذا كان استخدام الضروري 40 ميكرون الغطاء مصفاة الخلية مرشح للحصول على تعليق وحيد الخلية. استخدام عدادة الكريات لضمان وشكلت تعليق خلية واحدة (إذا لم يكن كذلك، استخدام 25 G الإبرة إلى حقنة تعليق خلية تصل إلى 3 مرات).
  4. إذا لزم الأمر عزل CD44 + CD24- فرعية الخلوية عبر FACS باستخدام مكافحة CD24-فيكوإيريترين (PE) وثيوسيانات (FITC) الاجسام المضادة 9 مكافحة CD44-فلوريسئين. بدلا من ذلك، عزل هؤلاء السكان الذين يستخدمون خلية المغناطيسي تنشيط الفرز (MACS) مع نظام مكافحة CD44 وميكروبيدات مكافحة CD24-البيوتين مجتمعة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. أداء اختيار الإيجابية باستخدام أعمدة LS، واختيار السلبية باستخدام أعمدة LD وتأكيد الظواهر من جميع الخلايا المعزولة بسبب التدفق الخلوي 17.
  5. احسب عدد خلايا قابلة للحياة لكل مل باستخدام التريبان الأزرق.
    يتم احتساب بقاء الخلية حيث بلغ عدد خلايا قابلة للحياة مقسوما على العدد الكلي للخلايا داخل شبكات على hemocy: ملاحظةtometer. وتعتبر الخلايا التي تناول الأزرق التريبان غير قابلة للحياة. يتم استخدام الإجراء التالي لتحديد بدقة نسبة خلايا قابلة للحياة.
    1. يعد حل 0.4٪ من اللون الأزرق التريبان في برنامج تلفزيوني. إضافة 0.1 مل من محلول المخزون التريبان الأزرق إلى 1 مل من الخلايا. تحميل عدادة الكريات وفحص على الفور تحت المجهر في التكبير المنخفض. حساب عدد من مجموع الخلايا وعدد الخلايا تلطيخ الزرقاء.
      خلايا قابلة للحياة = [1.00 - (عدد الخلايا الزرقاء ÷ عدد مجموع الخلايا)] × 100.
    2. لحساب عدد من خلايا قابلة للحياة في مل من الثقافة، استخدم الصيغة أدناه. تذكر أن تصحيح لعامل التخفيف.
      عدد خلايا قابلة للحياة × 10 4 × 1.1 = خلية / مل الثقافة
  6. و resuspend كمية محدد مسبقا من الخلايا في 2 مل من وسائل الإعلام mammosphere كاملة في كل بئر من 6 جيدا منخفضة للغاية لوحة ملتصقة. كثافة البذر هي عادة 500-4،000 خلية / سم 2 خلية لكل بئر. استخدام اختياريا لومرفق ث 24 لوحات بشكل جيد في حين البذر الخلايا في نفس كثافة في 0.5 مل من وسائل الإعلام.
    ملاحظة: نوصي تعظيم الاستفادة من كثافة البذر والوقت للثقافة لكل خطوط الخلايا من الفائدة.
  7. احتضان-مرفق منخفض جدا 6 لوحات جيدا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 5-10 أيام (اعتمادا على خط الخلية وحجم mammospheres) من دون إزعاج لوحات، ولا سيما خلال مرحلة النمو من 5 أيام الأولى .

2. جيل من Mammospheres الابتدائية من سرطان الثدي البشري العينات السريرية

ملاحظة: أنسجة سرطان الثدي البشرية يمكن الحصول عليها من المرضى الذين يخضعون لجراحة لإزالة أورام الثدي. متجر الأنسجة على الجليد لمدة تصل إلى 24 ساعة في 50 مل أنابيب معقمة في وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على 100 U / البنسلين مل و 100 U / مل الستربتومايسين. نفذ الخطوات التالية تحت غطاء الثقافة العقيمة.

  1. نقل العينة إلى 100 ملم الأنسجة طبق بتري مع كمية صغيرة من وسائل الاعلام. ازالتهاالبريد الأنسجة الدهنية باستخدام مقص معقم، scapel وملاقط.
  2. إضافة 2-3 مل من DMEM / F12 واللحم المفروم العينة إلى 1 ملم 3 قطع مع scapel معقم أو شفرة حلاقة حتى لا تظل القطع الكبيرة.
  3. Resuspend وقطع الأنسجة في مرحلة ما قبل درجة حرارة 10 مل DMEM التي تحتوي على الانزيمات المحللة للبروتين (3،000 U / كولاجيناز مل و 1،000 U / هيالورونيداز مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية في شاكر دوارة حتى يتم هضمها جميع أجزاء الأنسجة. عادة الهضم الكامل يأخذ الفترة من 1-3 ساعة. ضبط الوقت الهضم وفقا لأحرف المرضية للأورام. (على سبيل المثال غدية الثدي عادة ما يكون أصعب للهضم مقارنة سرطان موسينية التي هي أكثر هشاشة ويحتاج وقت أقصر الهضم). تقييم درجة الهضم كل ساعة ونصف من خلال مراقبة 20 ميكرولتر تعليق تحت عدادة الكريات.
  4. السماح للشظايا من رسوبيات لمدة 5 دقائق، ثم نقل طاف في 15 مل مخروطي أنبوب البولي بروبلين وأجهزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 10 دقيقة في غرفة تيمperature. صب بعناية من الخلايا وطاف resuspend في 1-5 مل من وسائل الإعلام mammosphere.
  5. اتبع الخطوات 1،1-1،4 المذكورة أعلاه للخطوط الخلايا للحصول على لوحة وحيدة الخلية تعليق. تمر الخلايا من خلال 25 G المحاقن بحد أقصى 2 مرات إذا لزم الأمر للحد من الخلايا الضارة.

3. Mammosphere تشكيل الكفاءة (٪) حساب

  1. بعد فترة والثقافة، والاعتماد على mammospheres (أكبر من 40 ميكرومتر) قطر تحت المجهر في 40X التكبير. رقميا صورة 5 حقول عشوائية باستخدام كاميرا رقمية على مجهر الضوء وتحديد حجم mammospheres باستخدام برنامج الاستحواذ. استخدام أي صورة برامج التحليل.
  2. حساب Mammosphere تشكيل الكفاءة (MFE٪) باستخدام المعادلة التالية:
    MFE (٪) = (# من mammospheres لكل بئر) / (# الخلايا المصنف لكل بئر) × 100

4. الركض المسلسل من Mammospheres للتقييم الذاتي-تجديد

  1. ماصة وسائل الإعلام التي تحتوي على mammospheres من كل بئر في أنبوب 15 مل. غسل الآبار مع PBS وإضافة إلى وسائل الإعلام التي تم جمعها. أجهزة الطرد المركزي في 115 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  2. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 500 ميكرولتر من قبل تحسنت بنسبة 0.5٪ التربسين / EDTA 0.2٪. احتضان لمدة 2-3 دقيقة.
  3. إضافة 500 ميكرولتر من FCS لتحييد التربسين. أجهزة الطرد المركزي في 500 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و resuspend بيليه في 100 ميكرولتر من وسائل الإعلام mammospheres، pipetting صعودا وهبوطا إلى تفصيل المجالات.
  4. عدد الخلايا مع عدادة الكريات وتحديد ما إذا الخلايا في تعليق خلية واحدة. إذا لم تمر عبر 25 G المحاقن تصل إلى 3 مرات للحصول على خلايا واحدة. البذور الخلايا في فائقة مرفق منخفض وحة 6 جيدا جديدة في نفس الكثافة المستخدمة في الجيل الأول.
  5. بعد 5-10 أيام، عد المجالات> 40 ميكرون وحساب الكفاءة تشكيل المجال باستخدام الصيغة ذكرت من قبل.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

عينات مختلفة أو تلك التي تتعرض للعلاجات مختلفة قد تختلف في عدد mammospheres> 40 ميكرون التي تشكل بعد تطبيع للخلايا الأولية المصنف. حساب mammosphere تشكيل الكفاءة (MFE) لكل معاملة تزرع في ثلاث نسخ. وهذا يتيح التجارب مع كثافة البذر مختلفة ليتم مقارنتها. هو أفضل عرض البيانات على الرسم البياني شريط، من الناحية المثالية مع الضوابط الإيجابية والسلبية، وعرض الانحراف المعياري عبر الآبار ثلاث نسخ. باستمرار نقل الخلايا الملتصقة في لوحات غير ملتصقة بما يتراوح بين 60-80٪ التقاء. عد الخلايا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

يعتمد تقييم نجاح mammospheres الابتدائي والثانوي على الخلايا التي مطلي بكثافات منخفضة بما فيه الكفاية أن mammospheres شكل من الحيوانات المستنسخة واحدة، مع الحد الأدنى من المجال التجميع. لكن بكثافات التي هي منخفضة جدا، قليل جدا mammospheres قد شكل لتمييز تأثيرات المعالجات الإحصائية. ينبغي أن يكون الأمثل كثافة البذر لكل خط الخلية المستخدمة لأنها يمكن أن تختلف اختلافا كبيرا في مجال تشكيل كفاءتها (الذين يعبرون عن المنخفض كادهيرين E قد تشكل أقل استقرارا وأقصر فترة الثقافات mammosphere ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه لا يوجد تضارب في المصالح يمكن اعتباره يضر بحياد هذه المادة.

شكر وتقدير

ويدعم هذا العمل من قبل BRC الامبراطوري، والمعهد الوطني للبحوث الصحية، والعمل لمكافحة السرطان مع إشارة خاصة إلى هيلاري كرافت والسير دوغلاس مايرز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM / F12LonzaCC-3151
2 ملي مولار L-glutamineSigma AldrichG8540
100 U / ml البنسلين & الستربتومايسينسيجما ألدريتشP4083
20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشري المؤتلف (EGF)سيجما ألدريتشE9644
20 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية البشرية الأساسية المؤتلف (bFGF)R & أنظمة D233-FB-025
1x B27 مكملInvitrogen17504-044
محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS)12399902Thermo Scientific
0.5٪ تريبسين / 0.2٪ EDTASigma Aldrich59418C
مصل عجل الجنينFirst Link UK02-00-850
Trypan BlueSigma Aldrich93595
ألواح منخفضة التعلق 6 آبارCorningCLS3814
Collagenase type 1ASigma AldrichC9891
HyaluronidaseSigma AldrichH3506
شفرات حلاقة معقمةفيشر Scientific12443170
مشرط معقمفيشر Scientific11758353
تشريح دقيق معقم مقصسيجما ألدريتشS3146

المراجع

  1. Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Struhl, K. An epigenetic switch involving NF-kappaB, Lin28, Let-7 MicroRNA, and IL6. Cell. 139 (4), 693-706 (2009).
  2. Iliopoulos, D., Hirsch, H. a, Wang, G., Struhl, K. Inducible formation of breast cancer stem cells and their dynamic equilibrium with non-stem cancer cells via IL6 secretion. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1397-1402 (2011).
  3. Visvader, J. E., Lindeman, G. J. Cancer stem cells: current status and evolving complexities. Cell stem cell. 10 (6), 717-728 (2012).
  4. Rosen, J. M., Jordan, C. T. The increasing complexity of the cancer stem cell paradigm. Science. 324 (5935), 1670-1673 (2009).
  5. Rokavec, M., Wu, W., Luo, J. -L. IL6-mediated suppression of miR-200c directs constitutive activation of inflammatory signaling circuit driving transformation and tumorigenesis. Mol Cell. 45 (6), 777-789 (2012).
  6. Chen, J., Li, Y., et al. A restricted cell population propagates glioblastoma growth after chemotherapy. Nature. 488 (7412), 522-526 (2012).
  7. Driessens, G., Beck, B., Caauwe, A., Simons, B. D., Blanpain, C. Defining the mode of tumour growth by clonal analysis. Nature. 488 (7412), 527-530 (2012).
  8. Schepers, A. G., Snippert, H. J., et al. Lineage tracing reveals Lgr5+ stem cell activity in mouse intestinal adenomas. Science. 337 (6095), 730-735 (2012).
  9. Sheridan, C., Kishimoto, H., et al. CD44+/CD24- breast cancer cells exhibit enhanced invasive properties: an early step necessary for metastasis. Breast cancer research: BCR. 8 (5), R59(2006).
  10. Ginestier, C., Hur, M. H., et al. ALDH1 is a marker of normal and malignant human mammary stem cells and a predictor of poor clinical outcome. Cell stem cell. 1 (5), 555-567 (2007).
  11. Liu, S., Cong, Y., et al. Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts. Stem cell reports. 2 (1), 78-91 (2014).
  12. Reynolds, B. A., Weiss, S. Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system. Science. 255 (5052), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/1553558 1707-1710 (1992).
  13. Pastrana, E., Silva-Vargas, V., Doetsch, F. Eyes wide open: a critical review of sphere-formation as an assay for stem cells. Cell stem cell. 8 (5), 486-498 (2011).
  14. Dontu, G., Abdallah, W. M., et al. In vitro propagation and transcriptional profiling of human mammary stem / progenitor cells. Genes Dev. , 1253-1270 (2003).
  15. Ponti, D., Costa, A., et al. Isolation and in vitro propagation of tumorigenic breast cancer cells with stem/progenitor cell properties. Cancer Res. 65 (13), 5506-5011 (2005).
  16. Grimshaw, M. J., Cooper, L., et al. Mammosphere culture of metastatic breast cancer cells enriches for tumorigenic breast cancer cells. Breast Cancer Res. 10 (3), R52(2008).
  17. Pham, P. V., Phan, N. L. C., et al. Differentiation of breast cancer stem cells by knockdown of CD44: promising differentiation therapy. J Transl Med. 9 (1), 209(2011).
  18. Manuel Iglesias, J., Beloqui, I., et al. Mammosphere formation in breast carcinoma cell lines depends upon expression of E-cadherin. PloS one. 8 (10), e77281(2013).
  19. Coles-Takabe, B. L. K., Brain, I., et al. Don’t look: growing clonal versus nonclonal neural stem cell colonies. Stem Cells. 26 (11), 2938-2944 (2008).
  20. Stingl, J. Detection and analysis of mammary gland stem cells. J Pathol. 217 (2), 229-241 (2009).
  21. Kreso, A., Dick, J. E. Evolution of the cancer stem cell model. Cell stem cell. 14 (3), 275-291 (2014).
  22. Al-Hajj, M., Clarke, M. F. Self-renewal and solid tumor stem cells. Oncogene. 23 (43), 7274-7282 (2004).
  23. Yu, F., Yao, H., et al. let-7 regulates self renewal and tumorigenicity of breast cancer cells. Cell. 131 (6), 1109-1123 (2007).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

CD44 CD24
Mammosphere تشكيل الفحص من الثدي البشري سرطان الأنسجة وخطوط الخلايا
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.