Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells

Q: What is the soft agar colony formation assay?

It is a method used to assess the ability of cells to grow and form colonies in a semi-solid medium, indicating tumorigenic potential.

Q: How does BB-Cl-amidine affect breast cancer cells?

BB-Cl-amidine inhibits the activity of PADI enzymes, which can reduce the tumorigenicity of breast cancer cells.

Q: What are PADI enzymes?

PADI enzymes are involved in the post-translational modification of proteins and have been linked to cancer progression.

Q: Why is colony size important in this assay?

Colony size is an indicator of cell proliferation and tumorigenic potential; larger colonies suggest enhanced growth capabilities.

Q: What implications does this study have for cancer treatment?

It suggests that targeting PADI enzymes may be a viable strategy for inhibiting breast cancer progression.

Q: Can this assay be used for other types of cancer?

Yes, the soft agar assay can be adapted to study various cancer types and their responses to different treatments.

Sachi Horibata; Tommy V. Vo; Venkataraman Subramanian; Paul R. Thompson; Scott A. Coonrod

doi:10.3791/52727

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Research Article

الاستفادة من الفحص لينة آجار مستعمرة تشكيل لالتعرف مثبطات Tumorigenicity في خلايا سرطان الثدي

DOI: 10.3791/52727

May 20, 2015

Sachi Horibata¹, Tommy V. Vo², Venkataraman Subramanian³, Paul R. Thompson³, Scott A. Coonrod¹

¹Department of Baker Institute for Animal Health,Cornell University, ²Department of Molecular Biology and Genetics,Cornell University, ³Department of Biochemistry and Molecular Pharmacology,University of Massachusetts Medical School

Cite Watch Download PDF Download Material list

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

In This Article

Summary Abstract Introduction Protocol Representative Results Discussion Disclosures Acknowledgements Materials References Reprints and Permissions

Summary

هنا ، نوثق استخدام مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة لاختبار تأثيرات مثبط إنزيم البيبتيلارجينين ديميناز (PADI) ، BB-Cl-amidine ، على أورام سرطان الثدي في المختبر.

Abstract

نظرا للصعوبات الكامنة في التحقيق في آليات تطور الورم في الجسم الحي ، تظل المقايسات القائمة على الخلايا مثل مقايسة تكوين مستعمرة الأجار الناعمة (المشار إليها فيما يلي بفحص الأجار الناعم) ، والتي تقيس قدرة الخلايا على التكاثر في مصفوفات شبه صلبة ، سمة مميزة لأبحاث السرطان. تتمثل الميزة الرئيسية لهذه التقنية على فحوصات زراعة الخلايا الكروية ثنائية الأبعاد أو ثلاثية الأبعاد في التقليد الوثيق للبيئة الخلوية ثلاثية الأبعاد لتلك التي تظهر في الجسم الحي. الأهم من ذلك ، أن اختبار الأجار الناعم يوفر أيضا أداة مثالية لاختبار تأثيرات المركبات الجديدة أو ظروف العلاج على تكاثر الخلايا وهجرتها بدقة. بالإضافة إلى ذلك ، يتيح هذا الاختبار التقييم الكمي لإمكانات تحول الخلية في سياق الاضطرابات الجينية. حددنا مؤخرا ببتييديلارجينين ديميناز 2 (PADI2) كمؤشر حيوي محتمل لسرطان الثدي وهدف علاجي. نسلط الضوء هنا على فائدة مقايسة الأجار الناعمة للدراسات المضادة للسرطان قبل السريرية من خلال اختبار تأثيرات مثبط PADI ، BB-Cl-amidine (BB-CLA) ، على ورم سرطان الأقنية البشرية في الخلايا الموضعية (MCF10DCIS).

Introduction

< p class = 'jove_content'>يمكن أن تتكاثر كل من الخلايا غير المحولة (العادية) والمحولة بسهولة في ثقافة أحادية الطبقة ثنائية الأبعاد. يختلف هذا الشكل من نمو الخلايا الملتصقة تماما عن ذلك الذي يحدث في الجسم الحي حيث ، في حالة عدم وجود تحفيز انقسامي ، لا تنقسم الخلايا في كثير من الأحيان بسرعة داخل بيئتها المكروية. من ناحية أخرى ، يختلف اختبار الأجار الناعم عن أنظمة الثقافة ثنائية الأبعاد لأنه يحدد الورم عن طريق قياس قدرة الخلية على التكاثر وتشكيل مستعمرات معلقة داخل جل الاغاروز شبه^{الصلب 1}. في هذا الإعداد ، لا تستطيع الخلايا غير المحولة التكاثر بسرعة في حالة عدم وجود مرسى في المصفوفة خارج الخلية (ECM) وتخضع لموت الخلايا المبرمج ، وهي عملية تعرف باسم anoikis. في المقابل ، تفقد الخلايا التي خضعت لتحول خبيث اعتمادها على الارتصا بسبب تنشيط مسارات الإشارات مثل فوسفاتيديلينوسيتول 3-كيناز (PI3K) / Akt و Rac / Cdc42 / PAK. لذلك ، فإن هذه الخلايا قادرة على النمو وتشكيل مستعمرات داخل مصفوفة الأجار الناعمة^{شبه الصلبة 2}.

الاستخدام الشائع لمقايسة الأجار الناعمة هو اختبار ما إذا كانت مركبات معينة ، مثل مثبطات PADI ، قادرة على قمع نمو الورم في المختبر. بشكل عام ، عدد المستعمرات أو أحجام المستعمرات هي قراءات كمية من الفحص التي يمكن مقارنتها بين مجموعات التحكم والعلاج لتقييم الاختلافات في الورم الخلوي. لذلك ، إذا وجد المرء أن تكوين المستعمرة يرتبط ارتباطا عكسيا بزيادة تركيز الدواء ، فيمكن استخلاص استنتاج مفاده أن الدواء مثبط فعال للأورام في المختبر. من ناحية أخرى ، إذا كان الدواء لا يؤثر على تكوين المستعمرة ، فإن الدواء إما ليس بالجرعة المناسبة أو أنه ليس مثبطا فعالا للأورام. بصرف النظر عن استخدام مقايسة أجار ناعمة لاختبار التأثير المضاد للورم للدواء ، يمكن أيضا استخدام هذا الاختبار لاستكشاف العلاقة بين جين معين وتكوين الأورام. على سبيل المثال ، يمكن معالجة تأثير قمع تعبير PADI2 على الورم عن طريق علاج siRNA الخاص ب PADI2.

PADIs هي إنزيمات تعتمد على الكالسيوم تقوم بتعديل البروتينات بعد الترجمة عن طريق تحويل بقايا الأرجينين موجبة الشحنة إلى سيترولين مشحونة بشكل محايد في عملية تعرف باسم citrullination أو deimination^3-5. لقد وجدنا مؤخرا أن ببتيديللارجينين ديميناز 2 (PADI2) قد يعمل كمؤشر حيوي جديد لسرطان الثدي وأن مثبطات PADI تمثل علاجات مرشحة لسرطان الثدي في المراحل المبكرة⁶. على سبيل المثال ، لقد أثبتنا سابقا أن مثبط "عموم PADI" ، Cl-amidine ، يثبط تكاثر خلايا سرطان الثدي باستخدام طبقات أحادية ثنائية الأبعاد وأن المثبط يثبط نمو الورم ثلاثي الأبعاد⁶. في هذا التقرير ، نقوم بتوسيع هذه الدراسات ، وتسليط الضوء على فائدة مقايسة الأجار الناعمة ، من خلال اختبار فعالية مثبط PADI الجديد ، BB-CLA ، في قمع نمو مستعمرات سرطان الثدي^{MCF10DCIS 7}. نلاحظ أننا استخدمنا خلايا MCF10DCIS في هذه التجربة لأنها مشتقات مسرطنة من خلايا MCF10A البشرية غير المحولة ولأنها تحتوي على مستويات عالية من بروتين PADI2⁸. نفترض أن النشاط الأنزيمي PADI2 يلعب دورا رئيسيا في الورم في هذا الخط الخلوي وأن تثبيط نشاط PADI2 بوساطة BB-CLA سيمنع تطور السرطان.

Protocol

1. إعداد 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الاغاروز

إلى الجافة زجاجة نظيفة، 100 مل، إضافة 0.9 غرام من 2-هيدروكسي إيثيل الاغاروز (الاغاروز السابع) تليها 30 مل من الماء المقطر.
الميكروويف الخليط لمدة 15 ثانية، وبلطف دوامة. كرر هذه الخطوة لا يقل عن ثلاث مرات حتى يذوب مسحوق الاغاروز تماما.
الأوتوكلاف الزجاجة التي تحتوي على حل لمدة 15 دقيقة.
السماح الحل الاغاروز ليبرد لRT قبل استخدامها مرة أخرى. تخزين الحل في RT.

2. إعداد الطبقة السفلية: 0.6٪ الاغاروز جل

قبل عدة الحارة 5 مل و 10 مل ماصات في 37 ° C حاضنة لمنع الاغاروز من التصلب في ماصة عند التعامل مع.
تخفيف جزء من غطاء زجاجة والميكروويف 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الحل الاغاروز مسبقة الصنع لمدة 15 ثانية. ثم، دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى. تحذير: كن حذرا عندما يحوم agaroالحل ذاته لأن الحل ترتفع عند تعرضها للهواء، ويمكن أن تمتد.
إذا كان هناك هلام الصلبة المتبقية في زجاجة، الميكروويف لبضع ثوان.
إبقاء زجاجة تحتوي على الحل الاغاروز في 45 ° C حمام الماء خلال الخطوات التالية لمنع الحل الاغاروز من ترسيخ قبل الأوان.
وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئ في 37 ° C حمام الماء. ملاحظة: يتكون MCF10DCIS وسائل الإعلام من DMEM / F12، 5٪ مصل الحصان، 5٪ البنسلين ستربتومايسين.
نقل 3 مل من محلول الاغاروز 3٪ باستخدام ماصات قبل تحسنت في العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
على الفور إضافة 12 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئة وعكس بلطف أنبوب مخروطي لخلط الاغاروز مع وسائل الإعلام. ليس محاولة لتشكيل أي فقاعات لأنها سوف تتداخل مع مستعمرة العد في وقت لاحق.
بلطف إضافة 2 مل من هذا الخليط في كل بئر من لوحة الثقافة 6 جيدا دون تشكيل أي فقاعات الهواء.
احتضان 6 جيدا لوحة الثقافة افقياLLY على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة للسماح للخليط ليصلب.
بعد يتصلب الخليط، ووضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. الطبقة السفلى هي الآن جاهزة للاستخدام.

3. إعداد طبقة التي تحتوي على الخلايا: 0.3٪ الاغاروز جل

خلايا يعرض للتريبسين MCF10DCIS وتمييع منهم إلى تركيز خلية من 4 × 10 ⁴ / مل.
خذ 2 مل من الاغاروز 3٪ باستخدام ماصات قبل تحسنت ونقل إلى العقيمة 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
إضافة على الفور 8 مل من MCF10DCIS وسائل الإعلام إلى أنبوب مخروطي الشكل وعكس بلطف لمزج الاغاروز مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل أي فقاعات.
خذ 2 مل من الخلايا MCF10DCIS (4 × 10 ⁴ / مل)، وعلاج مع BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
في 1: 1 التخفيف، ومزيج من الخلايا التي تحتوي على الاغاروز 0.6٪.
تأخذ 1 مل من الخليط خلية الاغاروز وإضافة بلطف على الطبقة السفلية من 6 جيدا ثقافة صفي وقت متأخر (2 × 10 ⁴ خلية / مل).
وضع لوحة ثقافة 6 جيدا أفقيا على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح الطبقة العليا ليصلب.
بعد يتصلب الخليط، ووضع لوحة في حاضنة C 37 درجة لمدة أسبوع قبل أن يضيف طبقة التغذية.

4. إعداد طبقة الطاعم: 0.3٪ الاغاروز جل

الميكروويف 3٪ 2-هيدروكسي إيثيل الحل الاغاروز مسبقة الصنع لمدة 15 ثانية. دوامة بلطف الحل والميكروويف لمدة 15 ثانية أخرى.
تتوازن الزجاجة الحل الاغاروز في حمام مائي 45 ° C.
تدفئة وسائل الإعلام MCF10DCIS في حمام مائي 37 ° C.
مزيج 1 مل من 3٪ حل الاغاروز مع 9 مل من وسائل الإعلام MCF10DCIS الدافئ في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وعكس بلطف لمزج الاغاروز مع وسائل الإعلام. تجنب تشكيل فقاعات الهواء.
علاج الخليط مع BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر).
بلطف إضافة 1 مل من هذا الخليط (بدون لمينغ فقاعات) في كل بئر من لوحة الثقافة 6 جيدا تحتوي على القاع وطبقات لينة.
وضع لوحة ثقافة 6 جيدا أفقيا على سطح مستو عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة على الأقل للسماح للخليط ليصلب.
بعد ترسخ الطبقة المغذية، وضع لوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية.
كرر هذا الإجراء أسبوعيا التغذية التي تتراكب 1 مل من 0.3٪ محلول الاغاروز / متوسطة / العلاج على طبقة المغذية الموجودة لتجديد الخلايا مع وسائل الإعلام الجديدة حتى لوحظ تشكيل مستعمرة. ملاحظة: آجار في الطبقات الناعمة والمغذية لينة جدا، وبالتالي فإن العناصر الغذائية المضافة من الطبقة المغذية منتشر بسهولة إلى الطبقة التي تحتوي على خلية للوصول إلى الخلايا.

5. جمع البيانات

بعد 2،5 أسابيع من نمو الخلايا في أجار لينة، وحساب عدد المستعمرات في كل بئر باستخدام المجهر الضوئي. لتسهيل الكمي، طباعة الشبكة على الشفافية وإرفاق شبكة للوحة 6 جيدا للمساعدة في تحديد موقع حيث كانت الخلايا أثناء الفرز. منذ حجم مستعمرة (كما كميا من قطر كل مستعمرة) سوف تختلف، تحديد مسبق حجم مستعمرة مرجعية لتحديد المستعمرات سيتم سجل. على سبيل المثال، تشمل أحجام مستعمرة من 70 ميكرون أو أكبر في تحليل البيانات.
تخزين العينات في 4 درجات مئوية لمنع المزيد من تشكيل مستعمرة والعد في المستقبل. ختم لوحة الثقافة 6 جيدا مع parafilm لمنع المواد الهلامية من الجفاف.

Representative Results

لينة أجار تشكيل مستعمرة الفحص يمكن استخدامها لمجموعة واسعة من التطبيقات توثيق tumorigenicity الخلايا السرطانية. والميزة الرئيسية لهذا الأسلوب هو أن المصفوفة شبه صلبة تفضل بشكل انتقائي من نمو الخلايا التي يمكن أن تتكاثر بطريقة-مرسى مستقل. وعرضت هذه الصفة بشكل رئيسي من قبل الخلايا السرطانية ولكن ليس عن طريق الخلايا الطبيعية. نحن نستخدم بشكل رئيسي هذه التقنية لاختبار فعالية الورم النمو المخدرات عن طريق تثبيط واختبار تأثير overexpression أو استنزاف جيناتنا المصالح، بما في ذلك الجينات PADI، على tumorigenicity خلايا سرطان الثدي. هنا، قمنا بتقييم تأثير BB-CLA على تثبيط مكون للأورام الخلايا MCF10DCIS-overexpressing PADI2 (الشكل 1 و 2).

وتبين النتائج أن BB-CLA يمنع إلى حد كبير في تشكيل MCF10DCIS المستعمرات المستمدة من الخلية. ويبين الشكل 3 أنه في وجود المانع PADI، ر كان هنا انخفاضا في كل من تشكيل مستعمرة ومستعمرة حجم بالمقارنة مع السيطرة DMSO. [ملاحظة: تم حله BB-CLA في DMSO وبالتالي، كانت تستخدم DMSO كعنصر تحكم] حجم المستعمرات لBB-CLA معاملة كانت خلايا MCF10DCIS في الغالب ضمن مجموعة من 20-100 ميكرون في حين أن حجم المستعمرات لDMSO السيطرة عرضت مجموعة أكبر من 70-150 ميكرون بعد 2.5 أسابيع من النمو.

احصي المستعمرات أكبر من 70 ميكرون وتحليلها (الشكل 4). كان هناك ما معدله 3536 المستعمرات في السيطرة DMSO في حين شوهدت فقط 1967 المستعمرات في المجموعة التي تلقت العلاج BB-CLA بعد 2.5 أسابيع من ثقافة أجار لينة. هذا يمثل انخفاضا بنسبة 44٪ في متوسط تشكيل مستعمرة في وجود من 1 ميكرومتر BB-CLA، مما يدل على تثبيط كبير مكون للأورام خلايا سرطان الثدي (خلايا MCF10DCIS) من قبل المانع PADI.

pload / 52727 / 52727fig1.jpg "/>
الشكل 1. التركيب الكيميائي للBB-CLA.

طريقة هلام الاغاروز لنمو الخلايا مع العلاج بالعقاقير ، رسم تخطيطي يوضح عملية الإعداد متعدد الطبقات.
والمغلفة الشكل 2. تخطيطي لمحة عامة عن بروتوكول لتشكيل الفحص لينة آجار مستعمرة. كل بئر من لوحات ثقافة 6 جيدا أولا مع 0.6٪ هلام الاغاروز (الطبقة السفلية). A 0.3٪ خليط agarose هلام يحتوي على خلايا MCF10DCIS وإما المانع BB-CLA (1 ميكرومتر) أو DMSO (مراقبة) ثم الطبقات العليا من هلام 0.6٪. مرة واحدة في الأسبوع، وأضاف 0.3٪ الاغاروز مزيج هلام (التي تحتوي على BB-CLA) على الجزء العلوي من طبقة لينة. بعد 2-4 أسابيع، لوحظ تشكيل مستعمرة وعدها لتحليل البيانات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

وقد نمت الشكل 3. صور من مستعمرة تشكيل خلايا في MCF10DCIS تعامل BB-CLA. MCF10DCIS الخلايا في أجار لينة في وجود (1 ميكرومتر BB-CLA) أو غياب BB-CLA (0 ميكرومتر DMSO). بعد 2،5 أسابيع، تم تصوير المستعمرات باستخدام مجهر مقلوب للصور التكبير المنخفضة والمجهر الضوئي للصور التكبير عالية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

رسم بياني شريطي يوضح عدد المستعمرات مع علاج BB-CLA ؛ 0 ميكرومتر مقابل 1 ميكرومتر، انخفاض كبير عند 1 ميكرومتر.
الشكل 4. الكمي لMCF10DCIS مستعمرة عدد بعد ما نمت الخلايا المعالجة BB-CLA. MCF10DCIS في أجار لينة بتركيزات مختلفة من BB-CLA (0 ميكرومتر (DMSO) أو 1 ميكرومتر BB-CLA). بعد 2،5 أسابيع، المستعمرات الفردية عشر أكبرتم احتساب 70 ميكرون. وتكررت التجارب 4 مرات (ن = 4). تم تحديد دلالة إحصائية من مجموع الفرق عدد خلايا بين عينات مراقبة والعلاج الطالب اختبار t-عينة اثنين و(* P <0.005).

Discussion

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Disclosures

Acknowledgements

نحن ممتنون للدكتور ريتشارد سيريوني والدكتور مارك أنتونياك وكيلي سوليفان من جامعة كورنيل لتقديم المشورة الفنية ، وللدكتورة جيرليند فان دي والي ، جامعة كورنيل ، لمشاركة مجهر أوليمبوس CKX41 المقلوب.

Materials

Zeiss Axiopot	Carl Zeiss المجهر	المجهري 1021859251
المقلوب	أوليمبوس	CKX41
DMEM / F-12	Lonza BioWhittaker	12-719F
HyClone متبرع مصل الخيول	فيشر العلمي	SH30074.03
البنسلين ستربتومايسين	لايف تكنولوجيز	15140-122
2-هيدروكسي إيثيل غاروز: النوع السابع ، درجة حرارة التبلور المنخفضة	سيجما ألدريتش	39346-81-1

References

Hamburger, A. W., Salmon, S. E. Primary bioassay of human tumor stem cells. Science. 197, 461-463 (1977).
Wang, L. H. Molecular signaling regulating anchorage-independent growth of cancer cells. Mt Sinai J Med. 71 (6), 361-367 (2004).
Vossenaar, E. R., Zendman, A. J., van Venrooij, W. J., Pruijn, G. J. PAD, a growing family of citrullinating enzymes: genes, features and involvement in disease. Bioessays. 25 (11), 1106-1118 (2003).
Horibata, S., Coonrod, S. A., Cherrington, B. D. Role for peptidylarginine deiminase enzymes in disease and female reproduction. J Reprod Dev. 58 (3), 274-282 (2012).
Mohanan, S., Cherrington, B. D., Horibata, S., McElwee, J. L., Thompson, P. R., Coonrod, S. A. Potential role of peptidylarginine deiminase enzymes and protein citrullination in cancer pathogenesis. Biochem Res Int. , 895343 (2012).
McElwee, J. L., et al. Identification of PADI2 as a potential breast cancer biomarker and therapeutic target. BMC Cancer. 12, 500 (2012).
Knight, J. S., et al. Peptidylarginine deiminase inhibition disrupts NET formation and protects against kidney, skin and vascular disease in lupus-prone MRL/lpr mice. Ann Rheum Dis. , 1-8 (2014).
Miller, F. R., Santner, S. J., Tait, L., Dawson, P. J. MCF10DCIS.com xenograft model of human comedo ductal carcinoma in situ. J Natl cancer Inst. 92, 1185-1186 (2000).
Fan, D., Morgan, L. R., Schneider, C., Blank, H., Fan, S. Cooperative evaluation of human tumor chemosensitivity in the soft-agar assay and its clinical correlations. J Cancer Res Clin Oncol. 109, 23-28 (2000).
Hamburger, A. W., White, C. P., Dunn, F. E., Citron, M. L., Hummel, S. Modulation of human tumor colony growth in soft agar by serum. Int J Cell Cloning. 1 (4), 216-229 (1983).
Anderson, S. N., Towne, D. L., Burns, D. J., Warrior, U. A high-throughput soft agar assay for identification of anticancer compound. J Biomol Screen. 12, 938-945 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request Permission

Play Video

الاستفادة من الفحص لينة آجار مستعمرة تشكيل لالتعرف مثبطات Tumorigenicity في خلايا سرطان الثدي