Method Article

التحليل الكمي من العيوب تسلق في نموذج ذبابة الفاكهة من الاضطرابات العصبية

DOI:

10.3791/52741

⸱

June 13th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, University of Alberta, 2Montreal Neurological Institute and Hospital, McGill University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نقدم مقايسة جيوتاكس سلبية غير مكلفة وموثوقة في ذبابة الفاكهة السوداء كنموذج للاضطرابات التنكسية العصبية. نظرا لكونه أكثر حساسية للعيوب الحركية الخفيفة ، فإن هذا الاختبار سيساعد في فحص التفاعلات الجينية المحتملة والأهداف الدوائية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

عيوب الحركي الناتجة عن الاضطرابات العصبية يمكن أن يكون أحد أعراض ظهور المرض في وقت متأخر، بعد سنوات من الانحطاط تحت الإكلينيكي، والاستراتيجيات العلاجية الحالية وبالتالي ليست شافية. من خلال استخدام كامل تسلسل exome، وقد تم تحديد عدد متزايد من الجينات تلعب دورا في الحركة البشري. على الرغم من تحديد هذه الجينات، فإنه ليس من المعروف كيف أن هذه الجينات هي الحاسمة لسير قاطرة العادي. ولذلك، فإن فحص موثوق بها، التي تستخدم الكائنات نموذج لتوضيح دور هذه الجينات من أجل تحديد أهداف جديدة للالفائدة العلاجية، هناك حاجة أكثر من أي وقت مضى. لقد قمنا بتصميم نسخة توعيتهم للمقايسة انجذاب بالجاذبية السلبية التي تسمح للكشف عن العيوب أكثر اعتدالا في وقت سابق، ولديه القدرة على تقييم هذه العيوب بمرور الوقت. ويتم تنفيذ في كوب فحص تخرج اسطوانة، التي أغلقت مع فيلم الحاجز الشمع. عن طريق زيادة المسافة عتبة للتسلق إلى 17.5 جم وزيادة مدة التجربة لمدة 2 دقيقة لاحظنا وجود حساسية أكبر في الكشف عن الخلل التنقل خفيفة. ويكلف فحص فعال و لا يتطلب تدريبا مكثفا للحصول على نتائج استنساخه للغاية. وهذا يجعل من تقنية ممتازة لفحص المخدرات مرشح في المسوخ ذبابة الفاكهة مع عيوب الحركة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم التعرف على الاضطرابات العصبية المدمرة مثل مرض باركنسون والتصلب الجانبي الضموري، والشلل النصفي التشنجي وراثي على نحو متزايد. لسوء الحظ، فإن معظم هذه الاضطرابات العصبية لا تزال دون معالجة. الاستخدام السريري على نطاق واسع، الاختبارات الجينية مشاركات الجينوم على نطاق مثل كله التسلسل exome أدى إلى تزايد عدد الجينات بالتورط في الاضطرابات قاطرة الإنسان. على الرغم من هذا التقدم، والتقدم المرضي من أوائل حتى مراحل متأخرة، لا يزال بعيد المنال في هذه الاضطرابات. يوفر ذبابة الفاكهة واحدة مع الأدوات الوراثية لدراسة متطلبات الجين بطريقة المكانية والزمانية التي تسيطر عليها. بالإضافة إلى ذلك، وقد ثبت ذبابة الفاكهة مفيد في فحص المخدرات لظروف عصبية مثل الشلل الرعاش 1، 2 مرض الزهايمر أو الإعاقة الفكرية 3،4 5،6 والصرع وغيرها. كان هدفنا لتطوير فعالة من حيث التكلفةوفحص موثوق بها من شأنها أن تسمح تحليل الإنتاجية العالية التي من شأنها أن تكون لا تزال حساسة بما يكفي للكشف عن تغيرات صغيرة في الأداء الحركي.

هناك عدة فحوصات تستخدم لتحديد آثار الطفرات الوراثية و / أو الظروف البيئية على السلوك تسلق ذبابة الفاكهة. معظم المقايسات الاستفادة من الميل الطبيعي للذباب في الصعود، والمعروفة باسم انجذاب بالجاذبية السلبية، أو فحص التسلق. بنزر 7 اقترح في عام 1967 أن جهاز مكافحة الحالية المستخدمة لدراسة انجذاب ضوئي ويمكن أيضا أن تستخدم لدراسة gravitaxis. ومنذ ذلك الحين، Ganetsky 8 وغيرها الكثير 9 -12 قد بنيت على فحص الأولي. المبدأ هو وضع عدد معروف من الذباب في قارورة والاستفادة من قنينة بقوة ضد سطح صلب، مما تسبب في الذباب ان يسقط الى أسفل القارورة. كما هو سلوك فطري، فإن الذباب تحاول الصعود إلى أعلى القارورة، بدلا من الجاذبية. هذا الاختبار هو الكمي وmeasuوارتفعت الدقة كم عدد الذباب الماضي علامة على القارورة خلال فترة الوقت المحدد. أصبح قياس سرعة بدلا من العدد الكلي للذباب تسلق معلمة موثوقة وأظهرت عيوب في الحالات التي يكون فيها عدد من المعايير الذباب ليس كبيرا (13).

وقد أثبت الفحص تسلق مفيدة في دراسة العديد من الاضطرابات العصبية بما في ذلك مرض باركنسون 14. ومع ذلك، لاحظنا أن العيوب قاطرة قد لا تكون قابلة للكشف في وقت حيث ينظر التنكس العصبي بالفعل في دراسات باثولوجية 14. وبالتالي، استخدام الفحص التقليدي قد تحد من القدرة على دراسة المراحل المبكرة من المرض والتسبب. ظهور عيوب قاطرة خلال مراحل لاحقة من أمراض قد تعكس مرض الذي تقدم هو متقدمة جدا لإنقاذ كاملة.

هذا يثير مشكلة محتملة مع حساسية مقايسة تسلق التقليدي. عدم القدرة المحتملة للالتقليديينtional تسلق فحص للكشف عن العيوب قاطرة خفيفة ويمكن أن يعزى إلى الارتفاع الذي يطلب فيه من الذباب في الصعود. التقليدية التدابير فحص 15،16 عدد من الذباب لتسلق بنجاح على ارتفاع 2-5 سم في 10 إلى 20 ثانية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان البحث على ذبابة الفاكهة السوداء البطن في الامتثال مع جامعة المبادئ التوجيهية للبحوث ألبرتا.

1. يطير مجموعة

  1. جمع 20 الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون 2 (ز) تخدير ووضعه في 25 ملم × 95 ملم جمع قارورة تحتوي على المواد الغذائية.
  2. مخزن قارورة تحتوي على الذباب أفقيا لتجنب محاصرة الذباب في أي السوائل التي قد تتراكم في الجزء السفلي من القارورة.
  3. احتضان الذباب للا يقل عن 21 ساعة على 22 ° C في 45٪ الرطوبة في الحاضنة لمدة ما يقرب من 15 ساعة. تعيين حاضنة مع ضوء 12 ساعة: دورة الظلام.

2. تسلق الفحص

  1. في صباح اليوم التالي، ونقل 20 الذباب من قنينة واحدة في كوب 250 مل تخرج اسطوانة. بمناسبة موقف اسطوانة ليبقيه ثابتا كل يوم. استخدام واحدة اسطوانة الزجاج في التركيب الوراثي لمنع التلوث المتبادل بين الأنماط الجينية. يغسل في نهاية كل تجربة وريال عمانياألمد لهم بين الأنماط الجينية.
    1. إجراء تجارب في الضوء المحيط (أو الضوء الأحمر إذا كان هناك خلل محتمل في رؤية) في درجة حرارة ورطوبة 22 ° C و 40٪ على التوالي. لتجنب إيقاع الساعة البيولوجية يخزي، نفذ دائما التجارب في نفس الوقت من اليوم.
  2. ختم الجزء العلوي من اسطوانة مع فيلم الحاجز (فيلم الشمع) لمنع هروب أي الذباب (الشكل 2).
  3. إعداد كاميرا الفيديو على حامل ثلاثي الأرجل. الكاميرا التركيز على خط 190 مل من 250 مل تخرج اسطوانة (17.5 سم).
  4. حساب عدد من الذباب الميت في الجزء السفلي من الاسطوانة وفي قارورة الغذاء. تسجيل هذا الرقم كما في وفيات.
  5. بخفة جدا الاسطوانة ضد سادة رغوة الخلايا المغلقة مرارا وتكرارا مع ما يكفي من القوة لإزاحة الذباب على السطح السفلي الداخلي. الاستفادة من 5-10 مرات بينما تستخدم اليد الأخرى للضغط سجل على الكاميرا.
  6. اضغط على "سجل" الموجود على الكاميرا.
  7. بدء فيدEO كاميرا تسجيل والاستفادة من اسطوانة ست مرات في نمط غير إيقاعية متميزة.
  8. إجراء كل محاكمة لمدة 2 دقيقة من الوقت الذي يتم استغلالها آخر الذباب وتسجيل عدد من الذباب عبور ارتفاع 17.5 سم (190 مل) في كل نقطة زمنية المختار (قياس كل 10 ثانية). ملاحظة: إن مل وضع علامات على اسطوانة تختلف من نموذج اسطوانة واحدة إلى أخرى اعتمادا على قطر. لتجنب الخطأ، وقياس ارتفاع على كل اسطوانة المستخدمة.
  9. وبمجرد أن المحاكمة قد انتهت، والتخلص من الذباب في الايثانول 95٪.
  10. كرر الخطوات من 2،1-2،9 حتى يتم اختبار جميع مكررات مع الذباب جديدة في كل مرة.
    ملاحظة: على الرغم من 5 مكررات قد يكون كافيا مع الطفرة التي لها تأثير قوي على الحركة، 10 مكررات البيولوجية لل20 الذباب (200 الذباب) ويوصى للكشف عن الفروق الصغيرة.
  11. عند الانتهاء من التجربة، وغسل اسطوانات في غسالة الصحون المختبر وO جاف / N لإعادة استخدامها.

تحليل 3.

  1. Analyأشرطة الفيديو زي كل تطير المحاكمة. كل 10 ثانية، وتسجيل عدد من الذباب الذي اجتياز خط المرمى.
    1. إذا ذبابة يصعد إلى أسفل أو السقوط، سجل أن يطير -1 والاعتماد الطاير المقبل لعبور خط الهدف في نفس العدد الطاير أن قفز إلى أسفل أو سقط. على سبيل المثال، إذا انخفض ذبابة ال 15 تحت خط الهدف، الطاير المقبل لعبور خط (16 تشرين تطير) تعتبر ذبابة ال 15 وليس ال 16.
  2. طرح معدل الوفيات الناجمة عن العدد الإجمالي من الذباب (20) للحصول على عدد من الذباب التي تبقى في المحاكمة. في كل نقطة زمنية، يجب الحصول على جزء من الذباب فوق خط المرمى.
  3. رسم كل نسبة في كل نقطة زمنية (انظر الشكل 3).
  4. تحليل أداء عند نقطة البيانات 120 ثانية وأداء الطالب اختبار t عند وجود 2 مجموعات أو ANOVA والاختبار البعدي للمقارنات متعددة (مع تعديل Bonferroni للتخطيط وتوكي للتعاون غير المخطط لهmparisons). وكولموجوروف-سمرنوف 17 تتم أيضا للتأكد من الوضع الطبيعي والتباين على قدم المساواة ولكن أيضا لمقارنة توزيع مجموعة متحولة إلى عنصر التحكم.
  5. لتقديم البيانات عبر الشيخوخة، ورسم النسبة المئوية للذباب تسلق في 120 ثانية مع الذباب من مختلف الأعمار (2 أيام، 1 أسبوع، 2 أسابيع) لمعرفة ما إذا كان هناك عجز التدريجي (الشكل 4).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تسلق هو سلوك قوي وقابلة للتكرار. في الواقع، في يوم من الأيام القديمة الذباب من النوع البري تصل إلى أداء تسلق مسافة الهدف بسرعة (25-30 ثانية). الذباب متحولة تمثل مجموعة من الأداء بين معتدلة (أو تأخر) لإكمال عدم القدرة على الصعود إلى الهدف. نحن لتوضيح هذا هنا مع اثنين من الأليلات الطافرة مختلفة. أول واحد هو أليل شديد في spastin الجين عن طريق الحذف الكامل للجين spastin (المنتجعات 5.75) 18. في هذا الخط (المنتجعات 5.75 مع TM6b) يوم واحد الذباب القديمة لا تصل WT أد...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد ثبت بالفعل أن تكون ذبابة الفاكهة نموذجا ممتازا في مرض 14 والظروف العصبية الأخرى 1،2 باركنسون. بالإضافة إلى الأدوات الجينية المتاحة في ذبابة الفاكهة، والحفظ جدا الجينوم من أجل الجينات المسؤولة عن الاضطرابات العصبية 19. ظهور أساليب الفحص الجيني الجينوم (بما في ذلك كله التسلسل exome) من المرجح أن تستمر في تقديم قائمة أكبر من الجينات المرشحة المرتبطة اضطرابات الحركة البشرية. فإن تطوير علاجات لهذه الظروف تتطلب النماذج الحيوانية لزي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا العمل مدعوم من قبل منحة فريق المعهد الكندي للبحوث الصحية (CIHR) للدكتور بولدوك (مشارك PI) والدكتور جاي رولو (PI). نود أن نشكر الدكتورة أوكسانا سوشوورسكي والدكتورة كاثرين تود وأعضاء نادي الذباب بجامعة ألبرتا والدكتور كلايتون ديكسون للمساعدة في تطوير الطريقة والتحليل الإحصائي.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
ذبابة الفاكهة الأسهميتم اختيار الأسهم اعتمادا على التجارب. يجب التحكم في درجة الحرارة والرطوبة في الغرفة وفي الحاضنة والتأكد من اتساقها لتجنب أن يكون الذباب ثابتا جدا أو رطبا جدا.
كاميراأي كاميرا فيديو رقمية ستفي بالغرض. تأكد من قدرتها على التركيز على كائن قريب.
اسطوانة متدرجةKimble20028Wقد يكون لنماذج مختلفة من الأسطوانة المتدرجة قطر مختلف. لذلك من الضروري قياس الارتفاع.
الكمبيوترأي نموذج سيفي بالغرض. استخدمنا الكمبيوتر لمراقبة تسلق الذباب وتسجيل عدد الذباب في كل نقطة زمنية.
فيديو

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Auluck, P. K., Bonini, N. M. Pharmacological prevention of Parkinson disease in Drosophila. Nature medicine. 8, 1185-1186 (2002).
  2. Bonini, N. M., Fortini, M. E. Human neurodegenerative disease modeling using Drosophila. Annual review of neuroscience. 26, 627-656 (2003).
  3. Bolduc, F. V., Bell, K., Cox, H., Broadie, K. S., Tully, T. Excess protein synthesis in Drosophila fragile X mutants impairs long-term memory. Nature neuroscience. 11, 1143-1145 (2008).
  4. McBride, S. M., et al. Pharmacological rescue of synaptic plasticity, courtship behavior, and mushroom body defects in a Drosophila model of fragile X syndrome. Neuron. 45, 753-764 (2005).
  5. Parker, L., Padilla, M., Du, Y., Dong, K., Tanouye, M. A. Drosophila as a model for epilepsy: bss is a gain-of-function mutation in the para sodium channel gene that leads to seizures. Genetics. 187, 523-534 (2011).
  6. Marley, R., Baines, R. A. Increased persistent Na+ current contributes to seizure in the slamdance bang-sensitive Drosophila mutant. Journal of neurophysiology. 106, 18-29 (2011).
  7. Benzer, S. Behavioral Mutants Of Drosophila Isolated By Countercurrent Distribution. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 58, 1112-1119 (1967).
  8. Ganetzky, B., Flanagan, J. R. On the relationship between senescence and age-related changes in two wild-type strains of Drosophila melanogaster. Experimental gerontology. 13, 189-196 (1978).
  9. Nichols, C. D., Becnel, J., Pandey, U. B. Methods to assay Drosophila behavior. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2012).
  10. Toma, D. P., White, K. P., Hirsch, J., Greenspan, R. J. Identification of genes involved in Drosophila melanogaster geotaxis, a complex behavioral trait. Nature genetics. 31, 349-353 (2002).
  11. Inagaki, H. K., Kamikouchi, A., Ito, K. Methods for quantifying simple gravity sensing in Drosophila melanogaster. Nature protocols. 5, 20-25 (2010).
  12. Gargano, J. W., Martin, I., Bhandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Experimental gerontology. 40, 386-395 (2005).
  13. Botella, J. A., et al. The Drosophila carbonyl reductase sniffer prevents oxidative stress-induced neurodegeneration. Current biology : CB. 14, 782-786 (2004).
  14. Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson's disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
  15. Chakraborty, R., et al. Characterization of a Drosophila Alzheimer's disease model: pharmacological rescue of cognitive defects. PLoS One. 6, e20799(2011).
  16. Orso, G., et al. Disease-related phenotypes in a Drosophila model of hereditary spastic paraplegia are ameliorated by treatment with vinblastine. J Clin Invest. 115, 3026-3034 (2005).
  17. Lehmann, E. L., D'Abrera, H. J. M. Nonparametrics : statistical methods based on ranks. , 1st edn, Springer. (2006).
  18. Sherwood, N. T., Sun, Q., Xue, M., Zhang, B., Zinn, K. Drosophila spastin regulates synaptic microtubule networks and is required for normal motor function. PLoS biology. 2, e429(2004).
  19. Inlow, J. K., Restifo, L. L. Molecular and comparative genetics of mental retardation. Genetics. 166, 835-881 (2004).
  20. Palladino, M. J., Hadley, T. J., Ganetzky, B. Temperature-sensitive paralytic mutants are enriched for those causing neurodegeneration in Drosophila. Genetics. 161, 1197-1208 (2002).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Climbing AssayDrosophila ModelNeurodegenerative DisordersNegative GeotaxisVideo AnalysisGlass Graduated CylinderWax Barrier FilmFly MortalityTime Point RecordingCandidate Drug Screening

Related Articles