مقالة منهجية

تحليل وظائف الخلايا الصاري في فيفو باستخدام 'الصاري خلية طرق في' الفئران

DOI:

10.3791/52753

⸱

مايو 27, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pathology, Stanford University School of Medicine, 2Department of Microbiology & Immunology, Stanford University School of Medicine

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن نصف طريقة لتوليد الخلايا الصاري المشتقة في المختبر ، وغرغرتها في الفئران التي تعاني من نقص الخلايا الصاري ، وتحليل النمط الظاهري والأرقام وتوزيع الخلايا الصارية المحتقنة في مواقع تشريحية مختلفة. يمكن استخدام هذا البروتوكول لتقييم وظائف الخلايا السارية في الجسم الحي.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الصارية (MCs) هي خلايا دموية موجودة في أنسجة مختلفة ، وهي وفيرة بشكل خاص في المواقع المعرضة للبيئة الخارجية ، مثل الجلد والمسالك الهوائية والجهاز الهضمي. اشتهر دورهم الضار في الحساسية التي تعتمد على IgE ، كما ظهرت MCs كلاعبين مهمين في الدفاع المضيف ضد السم والبكتيريا الغازية والطفيليات. يمكن أن يتأثر النمط الظاهري ووظيفة MC بالعوامل المحيطة الدقيقة التي قد تختلف وفقا للموقع التشريحي و / أو استنادا إلى نوع أو مرحلة تطور الاستجابات المناعية. لهذا السبب، ونحن وآخرون قد فضلت في نهج في الجسم الحي على أساليب في المختبر للحصول على نظرة ثاقبة وظائف MC. هنا، نقوم بوصف طرق توليد المركبات متعددة الثقافات المشتقة من نخاع العظم (BMCMCs)، ونقلها بالتبني إلى فئران ناقصة وراثيا MC، وتحليل أعداد وتوزيع MCs المنقولة بالتبني في مواقع تشريحية مختلفة. وقد استخدمت هذه الطريقة ، التي تسمى'الصاري خلية طرق في' النهج ، على نطاق واسع على مدى السنوات ال 30 الماضية لتقييم وظائف الشركات متعددة الأجهزة والمنتجات المشتقة من MC في الجسم الحي. ونناقش مزايا هذه الطريقة وحدودها، في ضوء النهج البديلة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الصارية (MCs) هي خلايا ما بين الهيماتوبوتية التي تنشأ من سلف نخاع العظم متعدد القدرات1-3. بعد خروج نخاع العظم، تهاجر السلف MCs إلى أنسجة مختلفة حيث تتطور إلى MCs ناضجة تحت تأثير عوامل النمو المحلية1-3. تقع MCs المقيمة في الأنسجة بشكل استراتيجي في واجهات البيئة المضيفة ، مثل الجلد والخطوط الجوية والجهاز الهضمي ، حيث تتصرف كخط دفاع أول ضد الإهانات الخارجية3-6. وغالبا ما تصنف الشركات متعددة الشخصيات على أساس خصائصها الظاهرية "الأساسية" ومواقعها التشريحية. في الفئران، تم وصف نوعين من MCs: "النسيج الضام من نوع" MCs (CTMCs) وMCs المخاطية (MMCs)1-3،7،8. غالبا ما تقع CTMCs حول النولس وبالقرب من الألياف العصبية ، وتقيم في تجاويف مصلية ، في حين تحتل MMCs مواقع داخل الظهارة في الأمعاء والغشاء المخاطي التنفسي1-3.

وقد طبقت منهجيات عديدة لدراسة الوظائف البيولوجية لمركبات الكربون المتعددة المركبات9-13. وقد ركزت مجموعات كثيرة على النهج في المختبر باستخدام خطوط الخلية إما (مثل خطوط MC الإنسان HMC114 أو LAD215,16), في المختبر MCs المستمدة (مثل الإنسان الطرفية المشتقة من الدم MCs17, أو نخاع العظام الماوس-MCs المستزرعة المشتقة [BMCMCs]18، MCs المستزرعة المشتقة من جلد الجنين [FSCMCs]19 و MCs المشتقة من الخلايا الصفاقية [PCMCs]20)أو MCs المعزولة من مواقع تشريحية مختلفة. وتستخدم جميع هذه النماذج على نطاق واسع لدراسة التفاصيل الجزيئية لبيولوجيا MC، مثل مسارات الإشارات المشاركة في تنشيط MC. ومع ذلك ، فإن جانبا هاما من بيولوجيا MCs هو أن خصائصها الظاهرية والوظيفية(على سبيل المثال، محتوى بروتياز الحبيبية السيتوبلازمية أو الاستجابة لمحفزات مختلفة) يمكن تحويرها حسب الموقع التشريحي والبيئة الدقيقة2،7. منذ الخليط الدقيق من هذه العوامل التي تواجهها في الجسم الحي قد يكون من الصعب إعادة إنتاج في المختبر، ونحن نفضل استخدام في نهج في الجسم الحي للحصول على رؤى في وظائف MCs9.

توجد عدة سلالات فأرة مع نقص MC الوراثي ، مثل WBB6F1المستخدم على نطاق واسع -كيت W / W-v أو C57BL /6 - كيت W-sh/W-sh الفئران. هذه الفئران تفتقر إلى التعبير و / أو نشاط KIT (CD117)، مستقبلات عامل نمو MC الرئيسي عامل الخلايا الجذعية (SCF)21،22. ونتيجة لذلك ، فإن هذه الفئران لديها نقص عميق MC ولكن لديها أيضا تشوهات إضافية فينوتيبيك تتعلق بطفراتهاc-kit (في WBB6F1-Kit W / W-v mice) أو بآثار الانعكاس الكروموسومي الكبير الذي يؤدي إلى انخفاض تعبيرc-kit (في C57BL/6 -Kit W-sh/W-sh mice)9,10,12,23. في الآونة الأخيرة ، تم الإبلاغ عن عدة سلالات من الفئران مع جعدة- المستقلة نقص MC التأسيسية24-26. وقد استعرضت مؤخرا كل هذه الفئران وبعض أنواع جديدة إضافية من الفئران MC ناقص غير قابل للانتقاص بالتفصيل9,10,13.

هنا، نقوم بوصف طرق توليد MCs المستزرعة المشتقة من نخاع العظم الماوس (BMCMCs)، ونقلها بالتبني إلى الفئران MC ناقصة، وتحليل أعداد وتوزيع MCs المنقولة بالتبني في مواقع تشريحية مختلفة. يمكن استخدام هذه الطريقة المسماة "طرق الخلايا السارية" لتقييم وظائف MCs والمنتجات المشتقة من MC في الجسم الحي. ونناقش مزايا هذه الطريقة وحدودها، في ضوء النهج البديلة التي تم تطويرها في السنوات الأخيرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد أجريت جميع عمليات العناية بالحيوانات وتجريبه وفقا للمبادئ التوجيهية للمعاهد الوطنية للصحة وبموافقة محددة من اللجنة المؤسسية لرعاية الحيوانات واستخدامها التابعة لجامعة ستانفورد.

1. توليد وتوصيف خلايا الصاري المستزرعة المشتقة من نخاع العظم (BMCMCs).

ملاحظة: يجب أن يتم إنشاء BMCMCs المانحة من خلايا نخاع العظم من نفس الخلفية الوراثية مثل الفئران المتلقية MC ناقصة. لا تصلح مراكز BMCMCs المانحة المشتقة من الذكور لرض الفئران الإناث. وستنجح البلدان المانحة المستمدة من الإناث في رعي الإناث في متلقين من الذكور والإناث على حد سواء.

  1. استخراج نخاع العظم.
    1. صب المحلول الملحي المعقم العازل بالفوسفات (PBS) في 6 لوحة ثقافة بئر (1 بئر لكل فأر) ووضعها على الجليد.
    2. نقع أدوات تشريح في الإيثانول 70٪ للتعقيم.
    3. قتل الفئران المانحة عن طريق ثاني أكسيد الكربون (CO2)استنشاق تليها خلع عنق الرحم، ثم رش الفئران مع الإيثانول 70٪ في مواقع التلاعب.
    4. استخدام أدوات التشريح العقيمة لاستخراج عظام عظم الفخذ والساق والشظية دون قطع أي epiphyses العظام.
    5. أثناء تأمين العظام مع ملقط، كشط قبالة جميع الأنسجة من العظام (وتجاهل الشظية) باستخدام مقص معقم (أو ريش مشرط). ضع العظام في برنامج تلفزيوني على الجليد حتى يتم جمع جميع العظام.
    6. تنفيذ جميع الخطوات المتبقية في غطاء محرك السيارة زراعة الأنسجة العقيمة. باستخدام أدوات معقمة، وتأمين العظام مع ملقط وقطع كل epiphyses لفضح تجويف النخاعي.
    7. باستخدام 3 مل المحاقن والإبر 30 G، والمتوسطة التنظيف البارد (Dulbecco تعديل النسر المتوسطة [DMEM] تكملها مع 10٪ مصل العجل الجنين [FCS، الحرارة معطلة]، 2 MM L-الجلوتامين، 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية، 50 ميكرومتر Β-mercaptoethanol)، دافق نخاع العظم الأحمر في طبق بيتري.
    8. استخدم نفس الحقنة للتفكك بين مجموعات خلايا نخاع العظم المتدفقة عن طريق الطموح اللطيف المتكرر والقذف.
    9. تجمع نخاع العظم الفخذي والظنبوبي من كل فأر إلى أنبوب طرد مركزي واحد 15 مل. ملء أنبوب مع الباردة التنظيف المتوسطة لغسل خلايا نخاع العظام والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية.
  2. ثقافة BMCMCs.
    1. إزالة supernatant واستعادة خلايا نخاع العظام بيليه في 10 مل من المتوسطة الثقافة (DMEM تكملها مع 10٪ مصل العجل الجنيني [FCS، الحرارة المعطل]، 2 مللي متر L-الجلوتامين، 1٪ محلول مضاد للمضادات الحيوية، 50 ميكرومتر Β-mercaptoethanol و 20٪ WEHI-3 المتوسطة مكيفة الخلية [كمصدر IL-3؛ بدلا من ذلك استخدام الماوس المؤتلف IL-3 في 10 نانوغرام /مل]).
    2. ضع خلايا في قارورة زراعة الأنسجة ذات الحجم المناسب(على سبيل المثال، T25 ل 1 فأر ، T75 للفئران 2 ، إلخ).
    3. 1-2 أيام بعد طلاء الخلايا، ونقل الخلايا المتوسطة والتعليق (ترك الحطام والخلايا الملتصقة التمسك الجزء السفلي من قارورة) إلى قارورة جديدة وإضافة متوسطة الثقافة الطازجة (10 مل / الماوس).
    4. خلال الأسابيع التالية، تغذية الخلايا كل 3-4 أيام (إضافة 10 مل من الثقافة المتوسطة لكل فأر). الحفاظ على كثافة الخلية بين 2.5 × 105-1 × 106 خلايا / مل. نقل الخلايا غير المنضمة إلى قارورة جديدة مرة واحدة في الأسبوع حتى لا توجد خلايا معتنقة في قارورة الثقافة. اختبار نضج الخلايا (انظر أدناه) قبل استخدامها في المقايسات المختبرية أو engraftment في الفئران MC ناقص.
      ملاحظة: التمايز الكامل من BMCMCs سيستغرق 4-6 أسابيع.
  3. تقييم نضج BMCMC.
    1. استخدام قياس التدفق الخلوي.
      1. غسل الخلايا (5 × 104-5 ×10 5 خلايا / شرط) مع الجليد الباردة FACS العازلة (برنامج تلفزيوني، 0.5٪ FCS) في 5 مل البوليسترين جولة أنبوب أسفل. جهاز طرد مركزي عند 400 × ز لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. أسبيرات فائقة.
      2. تمييع المضادة للفأرة CD16/32 (استنساخ 93 أو 2.4G2) الأجسام المضادة أحادية النسيلة 1:200 (2.5 ميكروغرام / مل) في العازلة FACS. إضافة 10 ميكرولتر إلى كل بيليه وإعادة الإنفاق عن طريق دوامة قصيرة. احتضان 5 دقائق على الجليد لمنع Fc ملزمة.
        ملاحظة: حماية عينات من الضوء المباشر لكافة الخطوات المتبقية.
      3. تمييع phycoerythrin (PE) اقترانها المضادة للفأرة fc εRI α (استنساخ MAR-1) 1:200 (1 ميكروغرام / مل) والفلوريسين ايزوثيوسيانات (FITC) اقترانها مكافحة الماوس كيت (CD117; استنساخ 2B8) 1:200 (2.5 ميكروغرام / مل) ("حل تلطيخ") ، أو الأجسام المضادة للتحكم في النمط المتساوي المعنية في المخزن المؤقت FACS ("حل التحكم isotype").
      4. تقسيم نصف الخلايا المحظورة من الخطوة 1.3.1.2) إلى أنبوب إضافي من أسفل جولة البوليسترين وإضافة 20 ميكرولتر من "محلول تلطيخ" في أنبوب واحد و 20 ميكرولتر من "حل عناصر التحكم متساوية النمط" في الأنبوب الآخر. احتضان 30 دقيقة على الجليد.
      5. أضف 3 مل من العازلة والطرد المركزي FACS الباردة الجليد في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. تجاهل supernatant وإعادة إنفاق بيليه في 300 ميكرولتر FACS العازلة التي تحتوي على 1 ميكروغرام / مل يوديد البروبيديوم (PI، لتحديد الخلايا الميتة). انتقل إلى تحليل قياس الخلايا التدفق (انظر الشكل 2A).
    2. باستخدام تلطيخ الأزرق التولويدين.
      1. غسل 1 × 105 خلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني عن طريق الطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم يستنشق وإعادة إنفاق الخلايا في 200 ميكروغرام من برنامج تلفزيوني.
      2. نقل تعليق الخلية إلى قناة خلوية معدة تعلق على شريحة المجهر والمضي قدما في الطرد المركزي الخلوي باستخدام جهاز الطرد المركزي الخلوي (40 × ز لمدة 5 دقائق).
      3. الهواء الجاف الشرائح لمدة 10 دقيقة ورسم دائرة الشمع حول الخلايا باستخدام قلم PAP. إضافة 0.1٪ حل الأزرق Toluidine لتغطية الخلايا. حضانة لمدة 1 دقيقة. اغسل الشرائح في مياه الصنبور الجارية لمدة دقيقة واحدة، ثم الشرائح الجافة للهواء لمدة 10 دقائق.
      4. الخلايا الأغطية باستخدام تركيب المتوسطة. انتقل إلى تحليل المجهر الخفيف (انظر الشكل 2B)

2. إنجرافتمنت من الفئران الخلايا الصاري ناقص مع BMCMCs.

  1. حقن الأذن عن طريق الحقن داخل الجلد (أي d.)
    ملاحظة: لنقل بالتبني من BMCMCs إلى بينا الأذن من الفئران MC ناقصة، نوصي بإجراء حقنتين من 1 × 106 خلايا لكل منهما (لما مجموعه 2 × 106 خلايا) لكل بينا الأذن. وقد استخدمت engraftment Intradermal من BMCMCs في بينا الأذن من الفئران MC ناقص من قبل العديد من المحققين في عدة نماذج، بما في ذلك نماذج من الحساسية المفرطة الجلدية السلبية (PCA)24،27،الدفاع المضيف ضدالسموم 28،وتفاعلات فرط الحساسية المزمنة (CHS)29،30.
    1. عد الخلايا وإعادة إنفاقها عند 4 × 107 BMCMCs /ml (1 × 106 BMCMCs / 25 ميكرولتر) في DMEM الباردة. نقل محلول BMCMCs إلى حقنة 1 مل مجهزة بإبرة 30 G. تبقي على الجليد حتى الحقن.
    2. تخدير الفئران MC-deficient 4-6 أسابيع القديمة باستخدام isoflurane (2.5٪ v/v). تحقق من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم، وضبط isoflurane إذا أشار ومواصلة رصد التنفس و إصبع القدم قرصة الاستجابة طوال العملية. ضعي مرهم العيون مع طرف Q لمنع جفاف العينين.
    3. مع السبابة، قم بإنشاء ضغط عمودي على الوجه الظهري لثنايا الأذن لفضح وتمدد الوجه البطني.
    4. إجراء حقنتين 25 ميكرولتر أي د. من محلول BMCMC في موقعين مختلفين من الوجه البطني ل بينا الأذن، الحقنة الأولى في منتصف الأذن والحقنة الثانية نحو طرف بينا الأذن. انتظر 4-6 أسابيع بعد أي زراعة قبل إجراء تجارب في الجسم الحي.
      ملاحظة: في تجربتنا، بحلول ذلك الوقت عدد MCs/mm2 من الأدمة في الجزء الأوسط من بينا الأذن عموما مماثلة لتلك الموجودة في الموقع المقابل في الفئران نوع البرية، في حين أن أعداد MCs /mm2 في محيط بيناي الأذن عادة ما تكون أقل بكثير من تلك الموجودة في الفئران نوع البريةالمقابلة 27،28. وينبغي أن يوضع هذا في الاعتبار عند تصميم التجارب مع هذه الفئران MC-engrafted(على سبيل المثال،ينبغي حقن وكلاء مع الآثار المحتملة على وظيفة MC في الجزء المركزي من بينا الأذن، وتحليل آثار مثل هذه العلاجات ينبغي أن تركز أيضا على هذا المجال).
  2. تجويف الصفاق عن طريق الحقن داخل الصفاق (أي p.)
    ملاحظة: سيتطلب النقل بالتبني ل BMCMCs إلى التجويف البريتوني للفئران الناقصة MC حقنة واحدة من 2 × 106 خلايا لكل فأر. وقد استخدمت هذه الحقن أي p. من BMCMCs في الفئران MC ناقص من قبل العديد من المجموعات لدراسة أدوار MCs الصفاق في نماذج مختلفة، بما في ذلك نماذج من الدفاع المضيف ضدالسموم 31 أو الإنتان البكتيري32،33.
    1. عد العدد المناسب من الخلايا وإعادة الإنفاق في 1 × 107 BMCMCs / مل (2 × 106 BMCMCs / 200 ميكرولتر) في DMEM الباردة. نقل حل BMCMCs إلى حقنة 1 مل مجهزة بإبرة 25 G. تبقي على الجليد حتى الحقن.
    2. إجراء حقنة واحدة من محلول BMCMCs 200 ميكرولتر في تجويف الصفاق من الفئران التي تعاني من نقص MC لمدة 4-6 أسابيع. انتظر 4-6 أسابيع بعد أي p. engraftment قبل إجراء تجارب في الجسم الحي.
  3. الإنجرافت عن طريق الحقن الوريدي (أي الوريد).
    ملاحظة: سيتطلب النقل بالتبني ل BMCMCs عن طريق حقن أي في الفئران MC ناقص حقنة واحدة من 5 × 106 خلايا لكل فأر. الحقن الوريدي (أي) من BMCMCs في الفئران MC ناقص وقد استخدمت من قبل العديد من المجموعات لدراسة أدوار MCs في نماذج مختلفة من الأمراض, بما في ذلك نماذج من عدوى المثانة34, الربو35, تليف الرئة36, والتهاب المفاصل المضادة بوساطة37.
    1. عد العدد المناسب من الخلايا وإعادة الإنفاق في 2.5 × 107 BMCMCs /ml (5 × 106 BMCMCs/200 ميكرولتر) في DMEM الباردة. نقل محلول BMCMCs إلى حقنة 1 مل مجهزة بإبرة 30 G. تبقي على الجليد حتى الحقن.
    2. تخدير الفئران MC-deficient 4-6 أسابيع القديمة باستخدام isoflurane (2.5٪ v/v). تحقق من عمق التخدير عن طريق قرصة إصبع القدم، وضبط isoflurane إذا أشار ومواصلة رصد التنفس و إصبع القدم قرصة الاستجابة طوال العملية. ضعي مرهم العيون مع طرف Q لمنع جفاف العينين.
    3. إجراء حقنة واحدة من 200 ميكرولتر من محلول BMCMC في الوريد الذيل (أو، بدلا من ذلك، الوريد المداري الرجعية) من الماوس MC ناقصة. انتظر 12 أسبوعا بعد أي زراعة قبل إجراء تجارب في الجسم الحي.

3. تحليل الفئران المنقوصة الخلايا المنقوصة.

  1. تحليل غرغرة الأذن.
    1. وفي نهاية التجربة، يقتل الفئران عن طريقاستنشاق ثاني أكسيد الكربون يليه خلع عنق الرحم.
    2. عزل بينا الأذن وإصلاح في 10٪ (vol/vol) العازلة الفورماليين بين عشية وضحاها في 4 °C. تضمين بينا الأذن الثابتة في البارافين، وقطع 4 أجزاء ميكرومتر من بينا الأذن وجبل على الشرائح الزجاجية.
    3. وصمة عار الشرائح مع حل الأزرق Toluidine 0.1٪ لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح في ماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة، ثم الشرائح الجافة للهواء لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. الشرائح Coverslip باستخدام تركيب المتوسطة، ثم عد عدد من MCs engrafted لكل أقسام pinnae باستخدام المجهر الخفيف. تقييم كفاءة الحرمان من خلال مقارنة النسبة المئوية وتوزيع MCs في جلد الأذن من الفئران المحتقنة مقابل الفئران البرية من النوع.
  2. تحليل تجويف الصفاق.
    1. تقييم عدد الخلايا الصاري في تجويف الصفاق.
      1. وفي نهاية التجربة، يقتل الفئران عن طريقاستنشاق ثاني أكسيد الكربون يليه خلع عنق الرحم. إزالة بعناية الجلد البطني للفئران دون كسر تجويف الصفاق.
      2. حقن 5 مل من البرد أو درجة حرارة الغرفة PBS في تجويف الصفاق باستخدام حقنة 5 مل مجهزة إبرة 25 G. استخدام برنامج تلفزيوني بارد للحد من خطر تنشيط الخلايا البريتونية (وهذا مهم جدا عند تقييم التججير MC الصفاق أو مستويات بعض المنتجات المشتقة من MC في السائل اللافاج الصفاق). إجراء تدليك البطن لمدة 20 ثانية لحصاد الخلايا البريتونية.
      3. يستنشق ببطء lavage البريتوني باستخدام حقنة 5 مل مجهزة إبرة 22 G. سجل حجم الحمم المهترأة (توقع استرداد ما يصل إلى 80٪ من الحجم المحقون).
      4. نقل السائل اللافاج البريتوني في أنبوب 5 مل البوليسترين جولة أسفل والطرد المركزي في 400 × ز لمدة 5 دقائق في 4 درجة مئوية. أسبيرات فائقة. استرداد بيليه في 400 ميكرولتر برنامج تلفزيوني الباردة.
      5. عد العدد الإجمالي للخلايا البريتونية باستخدام غرفة قياس الدم. استخدم نصف تعليق الخلية لتحليل قياس التدفق الخلوي (كما هو موضح في الخطوة 1.3.1)، لتقييم النسبة المئوية والتعبير عن علامة من MCs المحتشدة في تجويف الصفاق. ضرب العدد الإجمالي للخلايا البريتونية بنسبة مئوية من MCs للحصول على العدد المطلق من MCs الصفاق.
      6. إجراء الطرد الخلوي مع الخلايا المتبقية كما هو موضح في الخطوة 1.3.2.2. الهواء الجاف الشرائح لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ورسم دائرة الشمع حول الخلايا باستخدام قلم PAP.
      7. تغطية الخلايا مع محلول تلطيخ مايو غرونوالد غير المخفف لمدة 5 دقائق ، يليه الغسيل في PBS لمدة 5 دقائق ، وكلاهما في درجة حرارة الغرفة. تغطية الخلايا مع Giemsa وصمة عار المخفف 1:20 مع الماء deionized واحتضان 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح مرتين في ماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة، ثم الشرائح الجافة في الهواء.
      8. الخلايا Coverlip باستخدام تركيب المتوسطة، وحساب النسبة المئوية من MCs engrafted باستخدام المجهر الخفيف (عن طريق عد ما لا يقل عن 400 الخلايا الإجمالية). تقييم كفاءة الحرمان من خلال مقارنة النسبة المئوية لمركبات الكربون الهيدروفلورية في الحمم البريتونية للفئران المحتقنة مقابل الفئران البرية.
    2. تقييم الخلايا الصاري في النوافذ mesenteric.
      1. بعد اللافاج البريتوني الموصوف في الخطوة 3.2.1 ، قطع الغشاء البريتوني لكشف القناة المعوية للفئران. ترتيب 4 إلى 5 نوافذ mesenteric لكل ماوس على الشريحة.
      2. إصلاح الشرائح لمدة 1 ساعة في محلول Carnoy (3:2:1 vol/vol/vol من الإيثانول والكلوروفورم وحمض الخليك الجليدي) في درجة حرارة الغرفة. الشرائح الجافة الهواء وإزالة الأمعاء (ستبقى النوافذ mesenteric ثابتة تعلق على الشرائح).
      3. وصمة عار الاستعدادات لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة مع Csaba (الألسي الأزرق / صفران O) تلطيخ الحل.
        1. لجعل 500 مل من بقعة Csaba، وإعداد 500 مل من العازلة خلات عن طريق خلط 100 مل من محلول خلات الصوديوم 1 M مع 120 مل من 1 M HCl. جعل ما يصل إلى 500 مل مع الماء deionized وضبط درجة الحموضة إلى 1.42. ثم، حل 90 ملغ سافرانين [يحدد 'MCs ناضجة' باللون الأحمر]، 1.8 غرام الأزرق الألسي [يحدد 'MCs غير ناضجة' باللون الأزرق] و 2.4 غرام فيريس الأمونيوم كبريتات NH4Fe (SO4)2 إلى 500 مل من العازلة خلات.
      4. الشرائح Coverslip باستخدام تركيب المتوسطة، ثم عد عدد MCs engrafted لكل نافذة mesenteric باستخدام المجهر الخفيف. تقييم كفاءة الحرمان من خلال مقارنة النسبة المئوية وتوزيع MCs في النوافذ المتوسطة للفئران المحتقنة مقابل الفئران البرية.
  3. I.v. تحليل الحرمان.
    1. فينهاية التجربة ، والقتل الرحيم الفئران عن طريق استنشاق ثاني أكسيد الكربون تليها خلع عنق الرحم ، والأنسجة الحصاد ذات الأهمية(مثل الرئة والجلد أو الطحال) وإصلاح بين عشية وضحاها في 10 ٪ (فول / فول) الفورمالين المخزنة مؤقتا في 4 درجة مئوية.
    2. تضمين الأنسجة الثابتة في البارافين، وقطع 4 أجزاء ميكرومتر، وجبل على الشرائح الزجاجية. وصمة عار الشرائح مع حل الأزرق Toluidine 0.1٪ لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الشرائح في ماء الصنبور لمدة دقيقة واحدة، ثم الشرائح الجافة للهواء لمدة 10 دقائق.
    3. الشرائح Coverslip باستخدام تركيب المتوسطة وتقييم عدد وتوزيع MCs engrafted لكل أقسام الأنسجة باستخدام المجهر الخفيف.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويرد في الشكل 1نظرة عامة على نهج'طرق الخلايا السارية'ويشمل توليد مركبات بي إم سي إم سي، وعدد الخلايا التي ينبغي أن تكون محفورة في أي p.p. أو أي أي في الفئران MC-deficient (يمكن أن يختلف العدد إذا أشير إليها على أساس التصميم التجريبي) والفاصل الزمني بين الحرمان والتجربة اعتمادا على موقع الحقن (يمكن أن يختلف هذا الفاصل الزمني أيضا، إذا أشير إلى ذلك؛ على سبيل المثال، يزيد محتوى الوسطاء المخزنين في حبيبات MC السيتوبلازمية باطراد مع الوقت38). ويبين الشكل 2 تحليلات...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ما يقرب من 30 عاما بعد وصفها الأولي38،'الصاري خلية طرق في'النهج لا يزال يقدم معلومات قيمة حول ما يمكن أن تفعله الشركات متعددة الشخصيات أو لا يمكن القيام به في الجسم الحي. كان يعتقد منذ فترة طويلة أن وظائف MCs تقتصر على دورها في الحساسية. البيانات التي تم إنشاؤها باستخدام'الصاري خلية طرق في'النهج قد غيرت هذا الرأي, من خلال تقديم أدلة على أن MCs يمكن, من بين وظائف أخرى, تلعب أدوارا حاسمة في الدفاع المضيف ضد مسببات الأمراض معينة4,39 أوالسموم 28,31, أو حتى يمكن قمع ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

N.G. هو المستفيد من الزمالات من الفرنسية "مؤسسة من أجل Recherche Médicale FRM" ومؤسسة فيليب; R.S. تدعمها مؤسسة لوسيل باكارد لصحة الطفل وجائزة ستانفورد NIH/NCRR CTSA رقم UL1 RR025744; 20- وتحظى شهادة البكالوريوس بدعم من زمالة ماكس كادي من مؤسسة ماكس كادي والأكاديمية النمساوية للعلوم وزمالة شرودينغر من الصندوق النمساوي للعلوم: J3399-B21؛ وزمالة شرودينغر من صندوق العلوم النمساوي( FWF): J3399-B21؛ S.J.G. تعترف بدعم المعاهد الوطنية للصحة منح U19 AI104209, NS 080062 ومن برنامج أبحاث الأمراض المرتبطة بالتبغ في جامعة كاليفورنيا; L.L.R. يعترف بدعم من مؤسسة البحوث الوطنية لالتهاب المفاصل (ANRF) والمعاهد الوطنية للصحة منحة K99AI110645.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
1٪ محلول مضاد للحيوية ومضاد للفطرياتكورنينج سيلجرو30-004-Cl
3 مل حقنةفالكون309656
35 مم × 10 مم طبقكورنينج سيلجرو430588
5 مل بوليسترين أنبوب دائري القاعفالكون352058
حمض الخليك الجليديفيشر العلميA35-500
ألكيان بلو 8GXRowley Biochemical Danver33864-99-2
Allegra 6R جهاز طرد مركزيبيكمان
مضاد للفأر CD16 / 32 (استنساخ 93) علمحيويمنقى 14-0161-81
2-MercaptoethanolSigma AldrichM7522
BD 1 مل حقنة TBBDحقنة 309659
22 جم × 1 (0.7 مم × 25 مم) إبرBD إبرة انزلاقية دقيقة205155
25 جم 5/8 إبرحقنة BD305122
30 جم × 1/2 إبرBD Precision Glide305106
أزرق ماكس جونيور ، 15 مل أنبوب مخروطي من مادة البولي بروبيلينفالكون352097
كلوروفورمفيشر ScientificC298-500
Cytoseal 60 تصاعد متوسطريتشارد آلان Scientific8310-4
Cytospin3ShandonNA
Dakoقلم CytomationDakoS2002
Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM) 1xCorning cellgro15-013-CM
الإيثانولSigma AldrichE 7023-500 مل
مصل الأبقار الجنيني المعطل الحرارةسيجما ألدريتشF4135-500 مل
FITC المترافق IgG2b K التحكم في النمط المتشافي للفئرانeBioscience14-4031-82
للفأر المترافقة من الفلوريسين (FITC) (CD117 ؛ استنساخ 2B8)eBioscience11-1171-82
الفورمالديهايدفيشر ScientificF79-500
Giemsa Stain ModifiedSigma AldrichGS-1L
IsothesiaHenry Schein صحة29405
May-Grunwald StainSigma AldrichMG-1L
Multiwell 6 ألواح آبار Falcon35 3046
Olympus BX60 المجهرأوليمبوسNA
Paraplast Plus تضمين الأنسجة متوسطفيشر العلامة التجارية23-021-400
PE المترافق IgG التحكم في النمط المتشاوي للهامستر الأرمنيeBioscience12-4888-81
محلول ملحي للفوسفات (PBS) 1xCorning cellgro21-040-CV
Phycoerythrin (PE) مترافق مضاد للفأر FceRIa (استنساخ MAR-1)eBioscience12-5898-82
محلول تلطيخ يوديد البروبيديومeBioscience00-6990-50
ماوس مؤتلف IL-3Peprotech213-13
معتمد من Safranin-oقوارير زراعة الأنسجة Sigma AldrichS8884
T25 25 سم 2< / sup>353109بيكتون ديكنسون
T75 75 سم 2< / sup>بيكتون ديكنسون353110
تولويدين أزرق 1٪ مائيLabChem-IncLC26165-2
ماوس مؤتلف SCFPeprotech250-03
إلكتروني مجموعة مضادة قوارير زراعة الأنسجة

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kitamura, Y. Heterogeneity of mast cells and phenotypic change between subpopulations. Annu. Rev. Immunol. 7, 59-76 (1989).
  2. Galli, S. J., Borregaard, N., Wynn, T. A. Phenotypic and functional plasticity of cells of innate immunity: macrophages, mast cells and neutrophils. Nat. Immunol. 12, 1035-1044 (2011).
  3. Gurish, M. F., Austen, K. F. Developmental origin and functional specialization of mast cell subsets. Immunity. 37, 25-33 (2012).
  4. Abraham, S. N., St John, A. L. Mast cell-orchestrated immunity to pathogens. Nat. Rev. Immunol. 10, 440-452 (2010).
  5. Galli, S. J., Grimbaldeston, M., Tsai, M. Immunomodulatory mast cells: negative, as well as positive, regulators of immunity. Nat. Rev. Immunol. 8, 478-486 (2008).
  6. Reber, L. L., Frossard, N. Targeting mast cells in inflammatory diseases. Pharmacol. Ther. 142, 416-435 (2014).
  7. Galli, S. J. Mast cells as 'tunable' effector and immunoregulatory cells: recent advances. Ann. Rev. Immunol. 23, 749-786 (2005).
  8. Moon, T. C. Advances in mast cell biology: new understanding of heterogeneity and function. Mucosal Immunol. 3, 111-128 (2010).
  9. Reber, L. L., Marichal, T., Galli, S. J. New models for analyzing mast cell functions in vivo. Trends Immunol. 33, 613-625 (2012).
  10. Rodewald, H. R., Feyerabend, T. B. Widespread immunological functions of mast cells: fact or fiction. Immunity. 37, 13-24 (2012).
  11. Siebenhaar, F. The search for Mast Cell and Basophil models - Are we getting closer to pathophysiological relevance. Allergy. , (2014).
  12. Tsai, M., Grimbaldeston, M. A., Yu, M., Tam, S. Y., Galli, S. J. Using mast cell knock-in mice to analyze the roles of mast cells in allergic responses in vivo. Chem. Immunol. Allergy. 87, 179-197 (2005).
  13. Galli, S. J., et al. Approaches for analyzing the roles of mast cells and their proteases in vivo. Adv. Immunol. , (2015).
  14. Butterfield, J. H., Weiler, D., Dewald, G., Gleich, G. J. Establishment of an immature mast cell line from a patient with mast cell leukemia. Leuk. Res. 12, 345-355 (1988).
  15. Kirshenbaum, A. S. Characterization of novel stem cell factor responsive human mast cell lines LAD 1 and 2 established from a patient with mast cell sarcoma/leukemia; activation following aggregation of FcepsilonRI or FcgammaRI. Leuk. Res. 27, 677-682 (2003).
  16. Sibilano, R. The aryl hydrocarbon receptor modulates acute and late mast cell responses. J. Immunol. 189, 120-127 (2012).
  17. Gaudenzio, N., Laurent, C., Valitutti, S., Espinosa, E. Human mast cells drive memory CD4+ T cells toward an inflammatory IL-22+ phenotype. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 1400-1407 (2013).
  18. Tertian, G., Yung, Y. P., Guy-Grand, D., Moore, M. A. Long-term in vitro. culture of murine mast cells. I. Description of a growth factor-dependent culture technique. J. Immunol. 127, 788-794 (1981).
  19. Yamada, N., Matsushima, H., Tagaya, Y., Shimada, S., Katz, S. I. Generation of a large number of connective tissue type mast cells by culture of murine fetal skin cells. J. Invest. Dermatol. 121, 1425-1432 (2003).
  20. Malbec, O. Peritoneal cell-derived mast cells: an in vitro. model of mature serosal-type mouse mast cells. J. Immunol. 178, 6465-6475 (2007).
  21. Galli, S. J., Zsebo, K. M., Geissler, E. N. The Kit ligand, stem cell factor. Adv. Immunol. 55, 1-96 (1994).
  22. Reber, L., Da Silva, C. A., Frossard, N. Stem cell factor and its receptor c-Kit as targets for inflammatory diseases. Eur. J. Pharmacol. 533, 327-340 (2006).
  23. Grimbaldeston, M. A. Mast cell-deficient W.-sash. c-kit. mutant KitW.-sh./W.-sh. mice as a model for investigating mast cell biology in vivo. Am. J. Pathol. 167, 835-848 (2005).
  24. Lilla, J. N. Reduced mast cell and basophil numbers and function in Cpa3-Cre Mcl-1.fl/fl. mice. Blood. 118, 6930-6938 (2011).
  25. Dudeck, A. Mast cells are key promoters of contact allergy that mediate the adjuvant effects of haptens. Immunity. 34, 973-984 (2011).
  26. Feyerabend, T. B. Cre-Mediated Cell Ablation Contests Mast Cell Contribution in Models of Antibody and T Cell-Mediated Autoimmunity. Immunity. 35, 832-844 (2011).
  27. Schafer, B. Mast cell anaphylatoxin receptor expression can enhance IgE-dependent skin inflammation in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 131, 541-548 (2013).
  28. Akahoshi, M. Mast cell chymase reduces the toxicity of Gila monster venom, scorpion venom, and vasoactive intestinal polypeptide in mice. J. Clin. Invest. 121, 4180-4191 (2011).
  29. Grimbaldeston, M. A., Nakae, S., Kalesnikoff, J., Tsai, M., Galli, S. J. Mast cell-derived interleukin 10 limits skin pathology in contact dermatitis and chronic irradiation with ultraviolet B. Nat. Immunol. 8, 1095-1104 (2007).
  30. Hershko, A. Y. Mast cell interleukin-2 production contributes to suppression of chronic allergic dermatitis. Immunity. 35, 562-571 (2011).
  31. Metz, M. Mast cells can enhance resistance to snake and honeybee venoms. Science. 313, 526-530 (2006).
  32. Nakahashi-Oda, C. Apoptotic cells suppress mast cell inflammatory responses via the CD300a immunoreceptor. J. Exp. Med. 209, 1493-1503 (2012).
  33. Piliponsky, A. M. Neurotensin increases mortality and mast cells reduce neurotensin levels in a mouse model of sepsis. Nat. Med. 14, 392-398 (2008).
  34. Chan, C. Y., St John, A. L., Abraham, S. N. Mast cell interleukin-10 drives localized tolerance in chronic bladder infection. Immunity. 38, 349-359 (2013).
  35. Yu, M. Mast cells can promote the development of multiple features of chronic asthma in mice. J. Clin. Invest. 116, 1633-1641 (2006).
  36. Reber, L. L., Daubeuf, F., Pejler, G., Abrink, M., Frossard, N. Mast cells contribute to bleomycin-induced lung inflammation and injury in mice through a chymase/mast cell protease 4-dependent mechanism. J. Immunol. 192, 1847-1854 (2014).
  37. Lee, D. M. Mast cells: a cellular link between autoantibodies and inflammatory arthritis. Science. 297, 1689-1692 (2002).
  38. Nakano, T. Fate of bone marrow-derived cultured mast cells after intracutaneous, intraperitoneal, and intravenous transfer into genetically mast cell-deficient W/W-v. mice. Evidence that cultured mast cells can give rise to both connective tissue type and mucosal mast cells. J. Exp. Med. 162, 1025-1043 (1985).
  39. Malaviya, R., Ikeda, T., Ross, E., Abraham, S. N. Mast cell modulation of neutrophil influx and bacterial clearance at sites of infection through TNF-alpha. Nature. 381, 77-80 (1996).
  40. Lu, L. F. Mast cells are essential intermediaries in regulatory T-cell tolerance. Nature. 442, 997-1002 (2006).
  41. Tsai, M., Tam, S. Y., Wedemeyer, J., Galli, S. J. Mast cells derived from embryonic stem cells: a model system for studying the effects of genetic manipulations on mast cell development, phenotype, and function in vitro. and in vivo. Int. J. Hematol. 75, 345-349 (2002).
  42. Nocka, K., Buck, J., Levi, E., Besmer, P. Candidate ligand for the c-kit transmembrane kinase receptor: KL, a fibroblast derived growth factor stimulates mast cells and erythroid progenitors. EMBO J. 9, 3287-3294 (1990).
  43. Tsai, M. Induction of mast cell proliferation, maturation, and heparin synthesis by the rat c-kit ligand, stem cell. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88, 6382-6386 (1991).
  44. Ronnberg, E., Calounova, G., Guss, B., Lundequist, A., Pejler, G. Granzyme D is a novel murine mast cell protease that is highly induced by multiple pathways of mast cell activation. Infect. Immun. 81, 2085-2094 (2013).
  45. Ito, T. Stem cell factor programs the mast cell activation phenotype. J. Immunol. 188, 5428-5437 (2012).
  46. Furuta, G. T., Ackerman, S. J., Lu, L., Williams, R. E., Wershil, B. K. Stem cell factor influences mast cell mediator release in response to eosinophil-derived granule major basic protein. Blood. 92, 1055-1061 (1998).
  47. Weller, K., Foitzik, K., Paus, R., Syska, W., Maurer, M. Mast cells are required for normal healing of skin wounds in mice. FASEB J. 20, 2366-2368 (2006).
  48. McLachlan, J. B. Mast cell activators: a new class of highly effective vaccine adjuvants. Nat. Med. 14, 536-541 (2008).
  49. Reber, L. L. Contribution of mast cell-derived interleukin-1b to uric acid crystal-induced acute arthritis in mice. Arthritis Rheumatol. 66, 2881-2891 (2014).
  50. Arac, A. Evidence that Meningeal Mast Cells Can Worsen Stroke Pathology in Mice. Am. J. Pathol. 184, 2493-2504 (2014).
  51. Christy, A. L., Walker, M. E., Hessner, M. J., Brown, M. A. Mast cell activation and neutrophil recruitment promotes early and robust inflammation in the meninges in EAE. J. autoimmun. 42, 50-61 (2013).
  52. Hammel, I., Lagunoff, D., Galli, S. J. Regulation of secretory granule size by the precise generation and fusion of unit granules. J. Cell. Mol. Med. 14, 1904-1916 (2010).
  53. Martin, T. R. Mast cell activation enhances airway responsiveness to methacholine in the mouse. J. Clin. Invest. 91, 1176-1182 (1993).
  54. Tanzola, M. B., Robbie-Ryan, M., Gutekunst, C. A., Brown, M. A. Mast cells exert effects outside the central nervous system to influence experimental allergic encephalomyelitis disease course. J. Immunol. 171, 4385-4391 (2003).
  55. Wolters, P. J. Tissue-selective mast cell reconstitution and differential lung gene expression in mast cell-deficient Kit.W-sh/W-sh. sash mice. Clin. Exp Allergy. 35, 82-88 (2005).
  56. Reber, L. L. Selective ablation of mast cells or basophils reduces peanut-induced anaphylaxis in mice. J. Allergy Clin. Immunol. 132, 881-888 (2013).
  57. Hara, M. Evidence for a role of mast cells in the evolution to congestive heart failure. J. Exp. Med. 195, 375-381 (2002).
  58. Abe, T., Nawa, Y. Localization of mucosal mast cells in W/W-v. mice after reconstitution with bone marrow cells or cultured mast cells, and its relation to the protective capacity to Strongyloides ratti. infection. Parasite Immunol. 9, 477-485 (1987).
  59. Groschwitz, K. R. Mast cells regulate homeostatic intestinal epithelial migration and barrier function by a chymase/Mcpt4-dependent mechanism. Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 106, 22381-22386 (2009).
  60. Wedemeyer, J., Galli, S. J. Decreased susceptibility of mast cell-deficient Kit.W/W-v. mice to the development of 1, 2-dimethylhydrazine-induced intestinal tumors. Lab. Invest. 85, 388-396 (2005).
  61. Sawaguchi, M. Role of mast cells and basophils in IgE responses and in allergic airway hyperresponsiveness. J. Immunol. 188, 1809-1818 (2012).
  62. Piliponsky, A. M. Mast cell-derived TNF can exacerbate mortality during severe bacterial infections in C57BL/6-Kit.W-sh/W-sh. mice. Am. J. Pathol. 176, 926-938 (2010).
  63. Shelburne, C. P. Mast cells augment adaptive immunity by orchestrating dendritic cell trafficking through infected tissues. Cell Host Microbe. 6, 331-342 (2009).
  64. Michel, A. Mast cell-deficient Kit.W-sh. 'Sash' mutant mice display aberrant myelopoiesis leading to the accumulation of splenocytes that act as myeloid-derived suppressor cells. J. Immunol. 190, 5534-5544 (2013).
  65. Becker, M. Genetic variation determines mast cell functions in experimental asthma. J. Immunol. 186, 7225-7231 (2011).
  66. Abram, C. L., Roberge, G. L., Hu, Y., Lowell, C. A. Comparative analysis of the efficiency and specificity of myeloid-Cre deleting strains using ROSA-EYFP reporter mice. J. Immunol. Methods. 408, 89-100 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة