مقالة منهجية

طريقة لقياس آخر من Deubiquitinating الانزيمات في خطوط الخلايا وعينات الأنسجة

DOI:

10.3791/52784

⸱

مايو 10, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Neuroscience, University of Minnesota, 2Institute for Translational Neuroscience, University of Minnesota, 3Department of Obstetrics, Gynecology, and Women’s Heath, University of Minnesota, 4Masonic Cancer Center, University of Minnesota

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البروتوكول الحالي تفاصيل طريقة لقياس نشاط الانزيمات وظيفيا deubiquitinating مثلي. تحقيقات متخصصة تعديل تساهميا الانزيم وتسمح للكشف. يحمل هذا الأسلوب القدرة على تحديد أهداف علاجية جديدة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم مؤخرا تورط النظام بتحول-proteasome وفي أمراض مختلفة منها أمراض الاعصاب والسرطان. في ضوء ذلك، وتقنيات لدراسة آلية تنظيمية لهذا النظام ضرورية لتوضيح العمليات الخلوية والجزيئية للأمراض المذكورة أعلاه. استخدام راصة دموية المستمدة تحقيقات بتحول والواردة في هذه الورقة بمثابة أداة قيمة لدراسة هذا النظام. تفاصيل هذه الورقة الطريقة التي تمكن المستخدم من إجراء فحوصات التي تعطي رؤية مباشرة من deubiquitinating نشاط انزيم. الانزيمات Deubiquitinating تتحكم تدهور proteasomal وتبادل التماثل الوظيفي في مواقعهم النشطة، والتي تسمح للمستخدم للتحقيق في نشاط الأنزيمات متعددة في فحص واحد. ويتم الحصول لست] من خلال طيف تمزيق الخلايا الميكانيكية وحضنت مع موقع نشط تحقيقات توجيهات. يتم تمييزها الانزيمات وظيفية مع تحقيقات في حين تبقى الأنزيمات الخاملة غير منضم. بواسطة المدىنينغ هذا الاختبار، يحصل المستخدم على معلومات حول كل من النشاط والتعبير المحتمل لعدة إنزيمات deubiquitinating بطريقة سريعة وسهلة. الأسلوب الحالي بشكل ملحوظ أكثر فعالية من استخدام الأجسام المضادة الفردية لتوقع مائة deubiquitinating الإنزيمات في الخلايا البشرية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نظام بتحول-proteasome و(UPS) بمثابة واحد من مسارات التحلل الرئيسية في خلايا الثدييات. ركائز متجهة الى تدهور في proteasome ويتم تمييزها تساهميا مع البوليمرات من بتحول (UB) 1. قبل الركيزة المستهدفة تدخل proteasome وللتدهور، يجب إزالة علامة بولي بتحول. وهناك فئة من الإنزيمات المعروفة باسم deubiquitinating الأنزيمات (يصف) هي المسؤولة عن إزالة وإعادة تدوير جزيئات اليوبيكويتين 2. وقد توقع عليه من الجينوم البشري أن هناك ما يقرب من مائة يصف العمل في الخلية 3. مع هذا العدد الكبير من يصف السيطرة على العمليات الخلوية يو بي بوساطة، ودراسة هذه الإنزيمات يمثل تحديا منذ تقنيات مرنا لا تعطي معلومات عن النشاط والنشاف الغربي يعطي معلومات عن مستويات التعبير فقط.

استخدام راصة دموية الإنفلونزا (HA) الموسومة، يو بي المستمدة من الموقع موجه تحقيقات نشطة يسمح لوزارة الدفاع التساهميةification من يصف الوظيفي، وبالتالي يعطي رؤية مباشرة لنشاط هذه الإنزيمات على لطخة غربية 4. تحقيقات لديها مجموعة رد الفعل ثيول-C المحطة التي هي بمثابة الركيزة الانتحار لموقع نشط السيستين بقايا 5. مع هذه التحقيقات، فمن الممكن لدراسة النشاط والتعبير المحتمل للكثير من يصف في إطار كل من الحالات المرضية والفسيولوجية للخلية.

قد تورطت التغيرات في النشاط DUB في مجموعة من الحالات المرضية مثل الشلل الرعاش والزهايمر، وفقر الدم والسرطانات المختلفة 10/06. وتوفر هذه التقنية أداة قوية لدراسة المرض. في هذه الورقة، نقدم لك مجموعة من تطبيق هذه التقنية في خلايا هيلا وM17 التي تم هي lysed باستخدام الخرز الزجاجي. بالإضافة إلى ذلك، فإننا الخطوط العريضة لكيفية استخدام هذا الأسلوب في الماوس الحبل الشوكي عينات الأنسجة. المعلومات التي تم الحصول عليها من هذه التقنية يمكن أن تستخدم كنقطة انطلاق لتحديدالأهداف العلاجية فضلا عن وضع نماذج لدراسة الحالات المرضية المختلفة. الأداة المساعدة الحقيقية لهذه التقنية تكمن في قدرتها على تقديم معلومات عن يصف متعددة في فحص واحد.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد تحلل العازلة

  1. حل السكروز في منزوع الأيونات (DI) الماء لصنع محلول المخزون 2 M. تصفية 2 M حل السكروز باستخدام فراغ مدفوعة 0.22 ميكرون فلوريد البولي فينيل (PVDF) التصفية.
  2. حل dithiothreitol (DTT) في المياه DI لتقديم 500 ملي حل الأوراق المالية ومخزن تحت الظروف اللاهوائية. حل كلوريد المغنيسيوم (MgCl 2) في الماء DI لجعل حل الأسهم 100 ملم. حل الأدينوزين ثلاثي الفوسفات (ATP) ثنائي هيدرات في مياه DI لجعل حل الأسهم 50 ملم.
  3. تشكل حلا تريس عند pH 7.4 عن طريق إذابة Trizma هيدروكلوريد في الماء DI وضبط درجة الحموضة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم (هيدروكسيد الصوديوم).
  4. الجمع بين أجزاء من الحلول الأسهم في المياه DI لجعل منطقة عازلة تحلل مع تركيز السكروز من 250 ملم، تركيز DTT من 1 ملم، تركيز MgCl 2 من 5 ملم، وهو تركيز ATP من 1 ملم وتركيز تريس 50 ملم . على سبيل المثال، مزيج 535.3 ميكرولتر من تريس، 500 ميكرولتر من MgCl 2، 1.25 مل من السكروز، 20 ميكرولتر من DTT و 200 ميكرولتر من ATP و7.4947 مل من الماء DI لجعل 10 مل من تحلل العازلة. هذا ويمكن استخدام ما يقرب من 20 تجربة.

2. خلايا التثقيف للتجربة

  1. جعل وسائل الإعلام من قبل aliquoting 30 مل من DMEM + 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل.
  2. نقل الخلايا M17 أو هيلا المجمدة من تخزين النيتروجين السائل إلى دورق صغير مع الماء الفاتر.
  3. نقل الخلايا إلى أنبوب مخروطي 50 مل. لأول مرة، وإضافة بعض وسائل الإعلام إلى القارورة الخلية. ثم نقل الخلايا معلق في 5 ثانية من الذوبان.
  4. الطرد المركزي تعليق خلية في 450 x ج لمدة 5 دقائق للحصول على بيليه الخلية. إضافة 20 مل من وسائل الإعلام في قارورة T75.
  5. إزالة وسائل الإعلام من الخلايا باستخدام الشفط. إضافة 5 مل من وسائل الإعلام الجديدة لبيليه الخلايا و resuspend.
  6. نقل تعليق 5 مل الخلية إلى 20 مل من وسائل الإعلام في قارورة T75 واحتضان عند 37 ° C. الفصلأنجي وسائل الإعلام كل 3 أيام.

حصاد 3. خلية

  1. إزالة وسائل الإعلام عن طريق الشفط، والحرص على عدم لمس الخلايا.
  2. غسل الخلايا مع 5 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). إزالة PBS باستخدام الشفط.
  3. إضافة 3 مل من التربسين ethylenediaminetetraacetic حمض (EDTA) إلى قارورة T75 واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
  4. إضافة 6 مل من وسائل الإعلام الجديدة إلى القارورة وresuspend الخلايا.
  5. نقل تعليق لأنبوب مخروطي 15 مل وأجهزة الطرد المركزي في 290 × ز لمدة 5 دقائق.
  6. إزالة طاف وإضافة 5 مل من برنامج تلفزيوني. اضغط برفق الجزء السفلي من أنبوب لتفريق بيليه. أجهزة الطرد المركزي في 290 x ج لمدة 5 دقائق.
  7. كرر الخطوة 3.6 ثلاث مرات.
  8. إزالة برنامج تلفزيوني و resuspend الخلايا في 1 مل من برنامج تلفزيوني جديد. نقل إلى أنبوب إيبندورف (1.5 مل). تدور في 290 x ج لمدة 5 دقائق.

4. خلية تحلل

  1. قياس حجم تقريبي من بيليه باستخدام ماصةد تزن من الخرز الزجاجي في كتلة: نسبة حجم 1: 1. إضافة مرتين حجم الكرية في تحلل العازلة.
    ملاحظة: إضافة العازلة قبل إضافة الخرز الزجاجي.
  2. ليز الخلايا في الأنبوب إيبندورف في أقصى الانفعالات لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية قبل vortexing في غرفة باردة.
  3. لفترة وجيزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 30 ثانية ليستقر الخرز. جمع طاف.
  4. إضافة نفس الحجم من الخرز الزجاجي كما كان من قبل لطاف.
  5. دوامة مرة أخرى في أقصى الانفعالات لمدة 30 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  6. لفترة وجيزة الطرد المركزي في 200 x ج لمدة 30 ثانية لتسوية الخرز الزجاجي. جمع طاف.
  7. أجهزة الطرد المركزي في 5030 x ج لمدة 5 دقائق لإزالة النوى، والأغشية والخلايا غير منقطعة. جمع طاف، وهو المحللة الخلية.

5. الأنسجة التجانس

  1. جعل كتلة: حجم 1: 9 حل الماوس أنسجة الحبل الشوكي إلى تحلل العازلة.
    ملاحظة: هذه الطريقة تنطبق على مجموعة متنوعة من تختلفعينات الأنسجة الأنف والحنجرة.
  2. تجانس الأنسجة باستخدام إعداد مستوى 2 على الخالط لمدة 30 ثانية لضمان عدم وجود أي قطع المتبقية.
  3. تدور باستمرار في 5030 x ج لمدة 3 دقائق لإزالة النوى، والأغشية والخلايا غير منقطعة.
  4. جمع طاف، وهو المحللة.

6. عينة اشتقاق

  1. إجراء حمض bicinchoninic (BCA) في تحليل لوحة 96-جيدا لتحديد تركيز البروتين في الأنسجة المحللة باستخدام اللونية قارئ لوحة 96-جيدا كما هو محدد من قبل بيرس BCA فحص البروتين بروتوكول عدة.
  2. وضع قسامة الموافق 20 ميكروغرام من البروتين الكلي إلى 50 ميكرولتر باستخدام (DI) المياه غير المتأينة.
  3. إضافة 2 ميكرولتر من 1.35 ميكرومتر من HA-UB-فينيل سلفون (VS) إلى حل واحتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية. هذا ينتج 20 ميكروغرام من المحللة إلى 50 نانومتر من التحقيق في خليط التفاعل النهائي. وهذا هو ما يزيد المولي كبيرة لضمان وضع علامات على يصف الوظيفي.
  4. أناncubate العينة في عينة العازلة Laemmli لمدة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية. ل52 ميكرولتر رد فعل استخدام حجم 26 ميكرولتر من عينة العازلة 2X، 4X 13 ميكرولتر من عينة عازلة أو 8.87 ميكرولتر من 6X عينة العازلة.
  5. تبرد على الجليد قبل تحميل هلام.

7. الغربية وصمة عار

  1. تحميل 12-جيدا 4-20٪-تريس جليكاين هلام مع 40 ميكرولتر من العينة مستعدة
  2. تشغيل هلام في 95 V حتى تصل الجبهة أيون القاع.
  3. إجراء نقل بين عشية وضحاها من هلام على غشاء البولي فينيل difluoride (PVDF).
  4. احتضان الغشاء في اميدو وصمة عار سوداء ومسح membane للحصول على صورة تظهر كمية البروتين في كل حارة.
  5. يزيل اللون الغشاء ويحضن في الحليب 5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 1 ساعة لمنع.
  6. احتضان الغشاء في الابتدائي مكافحة HA الأجسام المضادة بتركيز 1: الحليب 10000 في 5٪ في برنامج تلفزيوني إما بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو 4 ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  7. أداء 3 يغسل وأو 5 دقائق لكل منهما في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ توين-20 المنظفات.
  8. احتضان الغشاء في الغلوثانيون الماوس الفجل بتركيز 1: الحليب 10000 في 5٪ في برنامج تلفزيوني لمدة لا تقل عن 2 ساعة.
  9. أداء 3 يغسل لمدة 5 دقائق كل في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ توين-20 المنظفات.
  10. أداء 1 يغسل لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
  11. احتضان الغشاء في كشف كاشف chemiluminescent لمدة 10 دقيقة وكشف باستخدام كاشف chemiluminescent. استخدام إعداد التعرض التلقائي على الجهاز.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكان حصاد الخلايا M17 وهيلا مثقف باستخدام طريقة تفصيله في (حصاد ​​خلية 3.) بروتوكول والأنسجة الماوس الحبل الشوكي تم الحصول عليها. وضعت / نسيج الحبل الشوكي بيليه الخلية في أنبوب مع تحلل العازلة الموضحة في قسم إعداد كاشف. وهي lysed الكريات الخلايا باستخدام الخرز الزجاجي (الشكل 1A) والفأر الحبل الشوكي عينات الأنسجة والمتجانس باستخدام الخالط (الشكل 1B). بعد تحلل أو التجانس، ثم طرد العينة في 5030 x ج لإزالة الخرز الزجاجي و / أو الأغشية وعضيات دون انقطا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

منذ ubiquitination هو النشاط الخلوي الأساسي، وفهم آليات تنظيمية يمكن أن يكون المفتاح لنبش عمليات الأمراض وعلم الأمراض. استخدام HA الموسومة UB المستمدة من الموقع موجه تحقيقات نشطة ذكرت هنا يوفر وسيلة سهلة، ولكن ينطبق إلى حد كبير لدراسة UB بوساطة تدهور البروتين. هذا الأسلوب هو أسرع وأقل تكلفة من دراسة كل واحدة من يصف بشكل فردي.

في هذه الطريقة، يتم تحقيق تحلل الخلايا عبر وسائل ميكانيكية - باستخدام الخرز الزجاجي. هذه...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نود أن نشكر مختبر لي من جامعة مينيسوتا لتقديم الماوس في العمود الفقري عينات الأنسجة الحبل التي تم استخدامها. وأيد هذا العمل من قبل وزارة الدفاع برنامج سرطان المبيض البحوث (OCRP) OC093424 لMB، من صندوق أبحاث السرطان والجماعة راندي آلة الحلاقة لMB ومينيسوتا سرطان المبيض التحالف (موكا) إلى ميغا بايت. كان الممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتحليلها، قرار نشر أو إعداد المخطوطة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PowerGen 125 (الخالط) مرشحاتFischer Scientific14-261-02P
تعمل بالفراغ 0.22 وميكرو ؛ مBPV2210
حبات زجاجية ، مغسولة بالحمض و le. 106 وميكرو ؛ م (~ 140 غربال أمريكي)Sigma-aldrichG4649-10G
السكروزفيشر ScientificS6-212
DL-dithiothreitolSigma-AldrichD0632
كلوريد المغنيسيومSigma-AldrichM8266
الأدينوزين 5'-ثلاثي الفوسفات ملح الصوديوم هيدراتسيجما-ألدريتشA26209
تريزما هيدروكلوريدSigma-AldrichT3253
النسر المتوسطة المعدلة من Dulbecco11965-092
تقنيات الحياة المالحة المخزنة بالفوسفات10010-023
قارورة زراعة الأنسجة 75 سم 2< / sup> مع كوب فلتر 250 مل 120 / csCellstarT-3001-2
0.05٪ Trypsin-EDTA (1x)Life Technologies25300-054
HI FBSLife Technologies16140-071
الجسم المضاد أحادي النسيلة المضاد ل HA المنتج في الفأرSigma-AldrichH9658
Ubiquitin فينيل سلفون (HA-tag)Enzo Life SciencesBML-UW0155-0025
Laemmli's SDS-Sample Buffer (4x ، مخفض)Boston BioProductsBP-110R
Pierce BCA Protein طقم الفحصالحراري العلمي23225
تقنيات

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ovaa, H., Kessler, B. M., Rolén, U., Galardy, P. J., Ploegh, H. L., Masucci, M. G. Activity- based ubiquitin-specific (USP) profiling of virus-infected and malignant human cells. Proc Natl Acad Sci USA. 101 (8), 2253-2258 (2004).
  2. Wilkinson, K. D. Ubiquitination and deubiquitination: Targeting of proteins for degradation by the proteasome. Semin Cell Dev Biol. 11 (3), 141-148 (2000).
  3. Ziad, M. E., Wilkinson, K. D. Regulation of proteolysis by human deubiquitinating enzymes. Biochim Biophys Acta. 1843 (1), 114-128 (2014).
  4. Rolén, U., et al. Activity Profiling of Deubiquitinating Enzymes in Cervical Carcinoma Biopsies and Cell Lines. Mol Carcinog. 45 (4), 260-269 (2006).
  5. Borodovsky, A., et al. Chemistry-Based Functional Proteomics Reveals Novel Members of the Deubiquitinating Enzyme Family. Chem Biol. 9 (10), 1149-1159 (2002).
  6. Andersson, F. L., et al. The effect of Parkinson’s-disease-associated mutations on the deubiquitinating enzyme UCH-L1. J Mol Biol. 407 (2), 261-272 (2011).
  7. Poon, W. W., et al. β-Amyloid (Aβ) oligomers impair brain-derived neurotrophic factor retrograde trafficking by down-regulating ubiquitin C-terminal hydrolase UCH-L1. J Biol Chem. 288 (23), 16937-16948 (2013).
  8. Nijman, S. M., et al. The deubiquitinating enzyme USP1 regulates the Fanconi anemia pathway. Mol Cell. 17 (3), 331-339 (2005).
  9. Stevenson, L. F., Sparks, A., Allende-Vega, N., Xirodimas, D. P., Lane, D. P., Saville, M. K. The deubiquitinating enzyme USP2a regulates the p53 pathway by targeting Mdm2. EMBO J. 26 (4), 976-986 (2007).
  10. Coughlin, K., et al. Small-molecule RA-9 inhibits proteasome-associated DUBs and ovarian cancer in vitro and in vivo via exacerbating unfolded protein responses. Clin Cancer Res. 20 (12), 3174-3186 (2014).
  11. Colla, E., et al. Endoplasmic Reticulum Stress Is Important for the Manifestations of α-Synucleinopathy In. Vivo. J Neurosci. 32 (10), 3306-3320 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PVDF

مقالات ذات صلة