يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

بنقل العدوى إلى خلايا RAW264.7 مع luciferase المراسل مراسل جين

21.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52807

⸱

يونيو 18, 2015

 ,  ,  , 
1Immunity and Infection Research Centre, Vancouver Costal Health Research Institute, 2Department of Surgery, University of British Columbia, 3Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of British Columbia

في هذه المقالة

ملخص

تعداء في خط خلية البلاعم ، RAW264.7 ، صعب بسبب الاستجابة الطبيعية للخلية ضد المواد الغريبة. وصفنا هنا إجراء لطيفا ولكنه قوي لنقل جينات مراسل لوسيفيراز إلى خلايا RAW264.7.

الملخص

يعد نقل المواد الوراثية المرغوبة إلى الخلايا إجراء لا مفر منه في الدراسات البحثية الطبية الحيوية. بينما تم وصف العديد من الطرق ، فإن أنواعا معينة من الخلايا تقاوم العديد من هذه الطرق وتنتج كفاءة تعداء منخفضة1 ، مما قد يعيق البحث في تلك الأنواع من الخلايا. في هذا البروتوكول ، نقدم إجراء تعداء محسن لإدخال جينات مراسل لوسيفيراز كحمض نووي بلازميد في خط خلايا البلاعم RAW264.7. يتم وصف نوعين مختلفين من كواشف التعدي (القائمة على الدهون والبولي أمين) ، ويتم تقديم ملاحظات مهمة في جميع أنحاء البروتوكول لضمان تغيير خلايا RAW264.7 بشكل طفيف من خلال إجراء التعداء وأي بيانات تجريبية تم الحصول عليها هي النتائج المباشرة للمعالجة التجريبية. في حين أن كفاءة التعدي قد لا تكون أعلى مقارنة بطرق التعدي الأخرى ، إلا أن الإجراء الموصوف قوي بما يكفي للكشف عن إشارة لوسيفيراز في RAW264.7 دون تغيير الاستجابة الفسيولوجية للخلايا للمنبهات.

المقدمة

ترنسفكأيشن من الأحماض النووية في خلايا لديه تطبيق متنوعة في مجال البحث العلمي. ومن الأمثلة على ذلك (1) الجينات مراسل لدراسة دور العناصر الجينات المختلفة في التعبير الجيني، (2) البلازميدات التعبير البروتين إلى بإفراط البروتين من الفائدة، و (3) الصغيرة بالتدخل RNA إلى downregulate التعبير الجيني. عن طريق التلاعب في مستوى التعبير عن جينات معينة وقياس الأثر التفاضلي لهذه التلاعبات، يمكن للباحثين استدلال على وظائف الجينات في النظم البيولوجية الذي تم اختياره. ليس كل طرائق نقل توفر نفس الكفاءة ترنسفكأيشن، وحتى نفس الأسلوب ترنسفكأيشن لا transfect جميع أنواع الخلايا على قدم المساواة 1. وبالتالي، تم وضع طرائق نقل مختلفة مثل طريقة فوسفات الكالسيوم، DEAE ديكستران، الموجبة الدهون ترنسفكأيشن، الموجبة البوليمر ترنسفكأيشن غير الدهون، Electroporation لل، وnucleofection 2،3.

ترنسفكأيشن إلى الضامة هو ESPEمن الصعب السيما يرجع ذلك إلى حقيقة أن الضامة هي البالعات المهنية التي هي حساسة جدا للمواد الأجنبية بما في ذلك البكتيريا المستمدة (الميثيلي) DNA (4). إدخال DNA الخارجية ينشط مسارا-تول مثل مستقبلات 9 (TLR9) مما يؤدي إلى إنتاج السيتوكينات وأكسيد النيتريك 5،6. هذه الضامة تفعيلها قد تكون أقل استجابة للعلاج أن ينوي الباحثون إلى دراسة.

لدينا مختبر transfects بشكل روتيني خط خلية بلعم RAW264.7 مع الجينات luciferase المراسل، ونحن قد وضعت البروتوكول الذي هو قوي بما يكفي ليكون إشارة luciferase المراسل أعلى بكثير من الخلفية، ولكن أيضا لطيف بما فيه الكفاية لالضامة أن تظل في حالة الراحة الخاصة بهم. تم تقييم السلوكيات من الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل عن طريق الجينات مراسل يراعة، luciferase المراسل إيواء منطقة المروج من IκBζ (pGL3- IκBζ). وupregulated IκBζ التعبير من قبل جدار الخلية البكتيرية مكون الشفةopolyssacharide (LPS) 7،8، وdownregulated من قبل خلوى المضادة للالتهابات، انترلوكين 10 (IL-10) 8. لحساب التباين بين ترنسفكأيشن الآبار، شاركنا في transfect البلازميد التحكم التي تحتوي على Renilla luciferase المراسل الجين (على سبيل المثال، phRL-TK) لأغراض التطبيع. هو الأمثل بروتوكول صفها بعد اختبار معايير مختلفة بما في ذلك توقيت ترنسفكأيشن، نوع من الكواشف ترنسفكأيشن، وكميات من الكواشف ترنسفكأيشن وDNA البلازميد، وكذلك نسبة كاشف ترنسفكأيشن إلى البلازميد الحمض النووي. الكواشف ترنسفكأيشن اثنين الواردة في هذا البروتوكول هي (1) كاشف ترنسفكأيشن الدهون على أساس و(2) بروتين / القائم البوليامين كاشف ترنسفكأيشن.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. البلازميد DNA تنقية

  1. استخراج DNA البلازميد باستخدام طقم maxiprep وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. و resuspend DNA البلازميد في 500 ميكرولتر من TE العازلة.
  2. إجراء الفينول: الكلوروفورم: أيزو أميلي استخراج الكحول والأيسوبروبانول هطول الأمطار لإزالة الملوثات البكتيرية المتبقية. وجود LPS يتداخل مع ترنسفكأيشن 9.
    1. إضافة 500 ميكرولتر من الفينول: الكلوروفورم: كحول أيزو أميلي (25: 24: 1، ودرجة الحموضة 8) إلى DNA البلازميد ويهز بقوة لمدة 15 ثانية. الفينول يسبب حروقا جلدية شديدة وغير مخدر حتى لا يشعر حروق دائما حتى لا يكون هناك ضرر شديد. أداء الفينول: استخراج أيزو أميلي في غطاء الدخان وتوخي الحذر: الكلوروفورم.
  3. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق على RT. أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 10 دقيقة في RT. نقل 350 ميكرولتر من المرحلة المائية العليا في أنبوب جديد 1.5 مل المجموعة.
  4. إضافة 350 ميكرولتر من TE العازلة إلى الأنبوب الذي يحتوي على أقل المرحلة العضوية. هزة بقوة لمدة 15 ثانية. أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 5 دقائق على RT. نقل 350 ميكرولتر من المرحلة المائية العلوية إلى نفس 1.5 مل أنبوب جمع.
  5. إضافة 70 ميكرولتر من 3 M خلات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 5.2) وتخلط جيدا. إضافة 700 ميكرولتر من 100٪ الأيزوبروبانول. تخلط جيدا واحتضان 10 دقيقة في RT. الطرد المركزي في 13000 x ج لمدة 10 minat 4 ° C. إزالة طاف.
  6. إضافة 500 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 75٪ لبيليه. عينات دوامة لخلط وأجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. إزالة طاف. الحمض النووي هو في بيليه.
  7. فتح غطاء الأنبوب والهواء الجاف بيليه في RT ل5-10 دقيقة. وينبغي أن تصبح بيليه شفافة. إضافة 500 ميكرولتر من TE عازلة لresuspend الكرية DNA. الحرارة في 50-60 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة إلى حل بيليه DNA.
  8. قياس الامتصاصية في 260 نانومتر (A260) و 280 نانومتر (A280) مع مطياف. حساب تركيز الحمض النووي عن طريق ضرب قيمة A260 بنسبة 50 نانوغرام / ميكرولتر. تقييم نوعية الحمض النووي عن طريق calculatinز نسبة A260 / A280. DNA ذات جودة عالية يجب أن تعطي نسبة A260 / A280 من 1،8-2،0.

2. زراعة خلية والبذر

  1. خلايا RAW264.7 الثقافة في DMEM تستكمل مع 9٪ مصل العجل الجنين (DMEM / 9٪ FCS) في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة. خلال كل مرور، فصل الخلايا من لوحة من قبل pipetting المستمر باستخدام ماصة باستور. مرور الخلايا كل أيام 2، والبذور 1،5-2٬000٬000 الخلايا على طبق نسيج الثقافة 10 سم يعامل سهم. ذوبان الجليد مخزون جديد من الخلايا كل 5-6 أسابيع.
  2. في يوم ترنسفكأيشن، البذور 200،000 الخلايا لكل بئر في لوحة 24-جيدا في حجم 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان الخلايا لمدة 4 ساعات في C حاضنة 37 درجة.
  3. خلايا Transfect إما مع كاشف القائم على الدهون (الخطوة 3.1) أو كاشف يستند البوليامين البروتين / (الخطوة 3.2).

3. ترنسفكأيشن

  1. الدهون على أساس ترنسفكأيشن:
    1. الاحماء reagen ترنسفكأيشنر لRT في الظلام. الاحماء المصل خالية المتوسطة وDMEM / 9٪ FCS إلى 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 0.5 ميكروغرام من DNA البلازميد إلى 50 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة في أنبوب 1.5 مل. إضافة 2 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن مع طرف ماصة تحت سطح السائل. دوامة لمدة 6 ثانية.
    3. ترك الخليط كاشف / DNA في الظلام في RT لمدة 30 دقيقة.
    4. أثناء الحضانة 30 دقيقة، وإزالة وسائل الاعلام من البئر وإضافة 250 ميكرولتر من جديد FCS DMEM / 9٪ إلى كل بئر.
    5. بعد 30 دقيقة، إضافة 250 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS إلى خليط كاشف / DNA. مزيج جيد من قبل pipetting صعودا وهبوطا.
    6. إضافة 300 ميكرولتر من خليط المخفف إلى كل بئر. احتضان لمدة 2-4 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.
    7. إزالة الحل ترنسفكأيشن وإضافة 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان لمدة 24 - 48 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة قبل التحفيز الخلية.
  2. بروتين / القائم البوليامين ترنسفكأيشن:
    1. الاحماء المصل خاليةالمتوسطة وDMEM / 9٪ FCS إلى 37 درجة مئوية.
    2. إضافة 0.75 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن إلى 18.75 ميكرولتر من المصل خالية المتوسطة. دوامة لفترة وجيزة لخلط. في احتضان RT لمدة 5 دقائق. إضافة 0.5 ميكرولتر من 1 ميكروغرام / DNA ميكرولتر في كاشف transfected المخفف. في احتضان RT لمدة 10 دقيقة.
    3. أثناء الحضانة 10 دقيقة، وإزالة وسائل الإعلام من كل بئر من 24 لوحة جيدا وإضافة 250 ميكرولتر الطازجة DMEM / 9٪ FCS إلى كل بئر.
    4. بعد 10 دقيقة، إضافة 250 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS في خليط كاشف / DNA.
    5. إضافة 270 ميكرولتر من خليط المخفف إلى البئر. احتضان في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 حاضنة لل2-4 ساعة.
    6. إزالة الحل ترنسفكأيشن وإضافة 500 ميكرولتر من DMEM / 9٪ FCS. احتضان لمدة 24 - 48 ساعة في 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة.

4. تحفيز الخلية وluciferase المراسل الفحص

  1. استبدال وسائل الإعلام في البئر مع 250 ميكرولتر من الطازجة DMEM / 9٪ FCS.
  2. إضافة 50 ميكرولتر من LPS أو LPS + IL-10 عند التراكيز المطلوبة إلى البئر. العودة إلى لوحة 37 ° C، 5٪ CO 2 الحاضنة. تحفيز ل2-6 ساعة.
  3. إزالة حل التحفيز بواسطة الشفط، ويغسل مع الثلج الباردة PBS، وإضافة 200 ميكرولتر من 1X السلبي الاحتياطي تحلل. موسيقى الروك في RT لمدة 30 دقيقة. كشط ونقل المحللة إلى 1.5 مل أنابيب وإزالة الحطام الخلية عن طريق الطرد المركزي في 20000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
  4. نقل 40 ميكرولتر من المحللة تطهيرها (طاف) إلى الأبيض، واضح أسفل لوحة 96-جيدا لتحديد إشارات luciferase المراسل وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
  5. قراءة إشارة luciferase المراسل مع luminometer عبر ضوء كامل الطيف المرئي.

5. تحليل البيانات

  1. حساب يراعة: نسبة Renilla بقسمة القيم الفردية من يراعة luciferase من قيم Renilla luciferase المراسل من كل بئر.
  2. حساب التغير أضعاف بقسمة يراعة: نسبة Renilla من معاملة حسنة من قبلأن البئر غير المعالجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

الشكل 1 يقارن كفاءة ترنسفكأيشن من اثنين من الكواشف ترنسفكأيشن في RAW264.7. أعطى كاشف القائم على الدهون عادة معدل ترنسفكأيشن حوالي 25٪، في حين أدى ترنسفكأيشن أساس البوليامين البروتين / في حوالي 5٪ كفاءة (الشكل 1A). وقد لوحظ الفرق في الكفاءة ترنسفكأيشن أيضا في إشارات luciferase المراسل في الخلايا RAW264.7 مع transfected المروج مراسل pGL3-IκBζ (الشكل 1B). إضافة LPS لهذه الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل زادت إشارة يراعة luciferase، مؤشر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصف بروتوكول هنا لا يركز فقط على كفاءة ترنسفكأيشن، ولكن يهدف إلى تحقيق التوازن بين الكفاءة والحفاظ على الدول الفسيولوجية للخلايا. على وجه التحديد، نجحت إجراءاتنا في التقليل من سمية ترنسفكأيشن الكاشف وتعظيم إشارة luciferase المراسل.

خطوة حاسمة في البروتوكول هو صحة الخلايا. ثقافات متضخمة ليست مناسبة للترنسفكأيشن عن التغيرات علم وظائف الأعضاء، وزراعة المستمرة لخلايا RAW264.7 لفترة طويلة من الزمن يمكن أيضا تغيير النم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

تم تمويل هذه الدراسة من منحة المعاهد الكندية للبحوث الصحية (CIHR). حصلت STC على جائزة أبحاث الدكتوراه من مركز القاهرة الدولي لحقوق الإنسان ومؤسسة مايكل سميث. EYS حاصلة على منحة CIHR. كما قدم البرنامج التدريبي لزراعة الأعضاء في مركز القاهرة للدراسات العليا منحا دراسية للدراسات العليا إلى STC و EYS و SS.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
PureLink HiPure Plasmid Maxiprep KitLife TechnologiesK210007ستعمل أي مجموعة maxiprep
الفينول: الكلوروفورم: كحول الأيزوميلتقنيات الحياة15593-049البيولوجيا الجزيئية. الفينول سام لذا اعمل في غطاء الدخان ، إن أمكن. استخدم الطبقة العضوية السفلية الصافية إذا تشكلت طبقتان من السائل في الحاوية.
DMEMThermo ScientificSH30243.01دافئ في 37 درجة ؛ ج حمام مائي قبل الاستخدام.
مصل الأبقار الجنينيThermo ScientificSH30396.03معطل عند 56 درجة ؛ C حمام مائي لمدة 45 دقيقة قبل الاستخدام.
Opti-MEMLife Technologies31985-070دافئ إلى درجة حرارة الغرفة على الأقل قبل الاستخدام.
كاشف التعداء XtremeGene HP DBARoche6366236001دافئ إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
GeneJuiceEMD Millipore70967يسخن إلى درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.
5x Passive Lysis BufferPromegaE194130 مل مدرج في نظام فحص مراسل لوسيفيراز
المزدوج نظام فحص مراسل لوسيفيرازالمزدوج PromegaE1910
درجة

المراجع

  1. Maurisse, R., et al. Comparative transfection of DNA into primary and transformed mammalian cells from different lineages. BMC Biotechnol. 10 (1), 9-18 (2010).
  2. Thompson, C. D., Frazier-Jessen, M. R., Rawat, R., Nordan, R. P., Brown, R. T. Evaluation of methods for transient transfection of a murine macrophage cell line RAW 264.7. Biotechniques. 27 (4), 824-835 (1999).
  3. Kim, T., Eberwine, J. Mammalian cell transfection: the present and the future. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 397 (8), 3173-3178 (2010).
  4. Stacey, K. J., Sweet, M. J., Hume, D. A. Macrophages ingest and are activated by bacterial DNA. Journal of immunology. 157 (5), 2116-2122 (1996).
  5. Jiang, W., Reich, I. C., Pisetsky, D. S. Mechanisms of activation of the RAW264.7 macrophage cell line by transfected mammalian DNA. Cell Immunol. 229 (1), 31-42 (2004).
  6. Jiang, W., Pisetsky, D. S. The induction of HMGB1 release from RAW 264.7 cells by transfected DNA. Mol Immunol. 45 (7), 2038-2046 (2008).
  7. Hargreaves, D. C., Horng, T., Medzhitov, R. Control of inducible gene expression by signal-dependent transcriptional elongation. Cell. 138 (1), 129-147 (2009).
  8. Cheung, S. T., So, E. Y., Chang, D., Ming-Lum, A., Mui, A. L. Interleukin-10 inhibits lipopolysaccharide induced miR-155 precursor stability and maturation. PLoS One. 8 (8), e71336(2013).
  9. Weber, M., Moller, K., Welzeck, M., Schorr, J. Short technical reports. Effects of lipopolysaccharide on transfection efficiency in eukaryotic cells. Biotechniques. 19 (6), 930-940 (1995).
  10. Berghaus, L. J., et al. Innate immune responses of primary murine macrophage-lineage cells and RAW 264.7 cells to ligands of Toll-like receptors. Comp Immunol Microbiol Infect Dis. 33 (5), 443-456 (2000).
  11. Fiszer-Kierzkowska, A., et al. Liposome-based DNA carriers may induce cellular stress response and change gene expression pattern in transfected cells. BMC Mol Biol. 12 (1), 27-36 (2011).
  12. Jacobsen, L., Calvin, S., Lobenhofer, E. Transcriptional effects of transfection: the potential for misinterpretation of gene expression data generated from transiently transfected cells. Biotechniques. 47 (7), 617-626 (2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

إجراء ترنسفكشنكاشف قائم على الليبيداتكاشف قائم على البوليامينلوسيفيريز اليراعةلوسيفيريز رينيلاتحلل الخلايامقايسة مقياس اللومينومترقياس التدفق الخلوي
بنقل العدوى إلى خلايا RAW264.7 مع luciferase المراسل مراسل جين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.