مقالة منهجية

تغليف الجينات المحفزة للخلايا الجذعية باستخدام فوهة المشارك المحوري

DOI:

10.3791/52835

⸱

يوليو 2, 2015

 , 
1Center for International Research on Integrative Biomedical System, Institute of Industrial Science, The University of Tokyo

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنشأنا طريقة لتغليف الخلايا الجذعية متعددة القدرات (خلايا PS) في كبسولات هيدروجيل ألجينات باستخدام فوهة محورية مشتركة. هذا يمنع الخلايا من التراكم بشكل مفرط ويحد من إجهاد القص الذي تعاني منه الخلايا في ثقافة التعليق. هذه التقنية قابلة للتطبيق على الإنتاج الضخم لخلايا PS وكذلك البحث في مجال الخلايا الجذعية.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية متعددة القدرات (PS) هي محور الأبحاث المكثفة نظرا لدورها في الطب التجديدي وفحص الأدوية. ومع ذلك ، فإن تطوير نظام زراعة جماعي سيكون مطلوبا لاستخدام خلايا PS في هذه التطبيقات. تعد ثقافة التعليق إحدى طرق الاستزراع الواعدة للإنتاج الضخم لخلايا PS ، على الرغم من أن بعض المشكلات مثل التحكم في التجميع والحد من إجهاد القص من وسط الثقافة لا تزال دون حل. من أجل حل هذه المشاكل ، قمنا بتطوير طريقة لتغليف ألجينات الكالسيوم (Alg-Ca) باستخدام فوهة محورية مشتركة. يمكن لهذه الطريقة التحكم في حجم الكبسولات بسهولة عن طريق التدفق المشترك لغاز N2. يجب أن يكون قطر الكبسولة التي يمكن التحكم فيها أكبر من 500 ميكرومتر لأن معدل التدفق المرتفع جدا لغاز N2 يتسبب في انهيار القطرات وبالتالي الكبسولات غير المتجانسة الحجم. علاوة على ذلك ، فإن التركيز المنخفض ل Alg-Na و CaCl2 يسبب كبسولات غير كروية. على الرغم من أن كبسولة Alg-Ca بدون طلاء من Alg-PLL تذوب بسهولة مما يتيح جمع الخلايا ، إلا أنها يمكن أن تتسرب أيضا من الكبسولات التي تفتقر إلى طلاء Alg-PLL. في الواقع ، يمكن لطلاء الجينات PLL أن يمنع التسرب الخلوي ولكن يصعب أيضا كسره. يمكن استخدام هذه التقنية للبحث في مكانة الخلايا الجذعية بالإضافة إلى الإنتاج الضخم لخلايا PS لأن التغليف يمكن أن يعدل البيئة الدقيقة المحيطة بالخلايا بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية وتركيز العوامل المفرزة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (خلايا iPS) هي حاليا مصدر أبحاث مكثفة نظرا لدورها في الطب التجديدي. ومع ذلك ، هناك حاجة إلى كميات هائلة من الخلايا لتجديد الأنسجة. على سبيل المثال ما يقرب من مليار خلية بنكرياس مطلوبة لمريض السكري من النوع1 1. ومع ذلك ، فإن ثقافة الأطباق التقليدية قادرة فقط على الحصول على 1 × 105 خلايا / سم2 ، وبالتالي تتطلب 1 م2 من منطقة المزرعة للحصول على ما يكفي من خلايا البنكرياس المشتقة من الخلايا الجذعية لعلاج مريض السكري من النوع 1. لذلك فإن تطوير نظام للزراعة الجماعية للخلايا الجذعية متعددة القدرات ، مثل الناقلالدقيق 2 وثقافة التعليق مطلوب للطب التجديدي. تمثل ثقافة التعليق طريقة واعدة للثقافة الجماعية ولكن التحكم في تراكم الخلايا يمثل تحديا في ثقافات التعليق المباشر لخلايا iPS البشرية3. في الواقع ، تتعرض الخلايا العالقة لإجهاد القص ، مما يتسبب في تلف الخلايا3 أو التمايز4.

تم إجراء بحث في التغليف القائم على الهيدروجيل لحل المشكلات المرتبطة بثقافة التعليق. في كبسولات الهيدروجيل ، تتم حماية الخلايا من تدفق الوسط. وثقت التقارير السابقة استخدام أنواع مختلفة من الهيدروجيل ، بما في ذلك agarose5 و PEG6 و alginate (Alg) ، للتغليف الخلوي. يعد هيدروجيل Alg-Ca أحد أكثر المواد الهلامية المائية فائدة لتغليف الخلايا لأن هيدروجيل Alg −Ca يتكون مباشرة بعد إسقاط محلول الجينات في محلول CaCl2 ويتم هضمه بسهولة بواسطة الإنزيمات أو الكواشف المخلبة.

هنا ، أنشأنا عملية تغليف ألجينات مستقرة لخلايا iPS باستخدام فوهة محورية مشتركة. باستخدام تدفق غاز N2 لتكوين القطرات ، من الممكن تغليف الخلايا في كبسولات موحدة دون الحاجة إلى كواشف أخرى مثل الزيت. في هذه الطريقة ، يعد معدل تدفق N2 وتركيز كل من CaCl2 والألجينات من ظروف التشغيل الرئيسية التي تؤثر على حجم الكبسولات وشكلها وتوحيدها. يوضح هذا التقرير تحسين ظروف التشغيل هذه من خلال استخدام كاميرا عالية السرعة ومجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. المواد إعداد

  1. إعداد 10 ملي HEPES العازلة. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في RT وإضافة كلوريد الصوديوم إلى 0.9٪.
  2. تحضير 5٪ محلول الجينات وحل 10 ملي EDTA عن طريق خلط المياه المالحة HEPES مخزنة أعد في 1.1. ضبط درجة الحموضة إلى 7.0 في RT.
  3. الأوتوكلاف الكواشف (1.1، 1.2) لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
  4. إعداد 60 ملم أطباق الجيلاتين المغلفة الطبقات مع 1،2-2،0 × 10 6 الماوس الخلايا الليفية الجنينية (MEF) الخلايا، والتي يتم التعامل معها على أنها الخلايا المغذية التي كتبها حضانة داخل DMEM تحتوي على 10٪ FBS ES-المؤهلة و 10 ميكروغرام / مل من ميتوميسين مئوية لمدة 90 - 120 دقيقة.
  5. الحفاظ على الماوس الناجم الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا على الطبق مع الخلايا المغذية في وجود 5 مل DMEM الجلوكوز المرتفعة تحتوي على 20٪ من ES-مؤهل FBS، 50 ميكرومتر من 2 المركابتويثانول، الأحماض الأمينية غير الأساسية، والمضادات الحيوية ( 100 وحدة / مل من البنسلين G الصوديوم، و 100 ميكروغرام / مل من كبريتات الستربتومايسين، و 250 نانوغرام / مل من amphoteriCIN B).
  6. البذور 4 × 10 5 خلايا الجذع على 60 مم طبق الجيلاتين المغلفة واحتضان لهم عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2. تغيير ثقافة المتوسط ​​كل يوم أثناء الحضانة. بعد 3-4 أيام من الثقافة، ويعرض للتريبسين الخلايا لمدة 1 دقيقة مع 500 ميكرولتر من 0.05٪ التربسين التي تحتوي على 0.02٪ EDTA عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪. بعد ذلك، فصل الخلايا عن طريق التنصت على طبق ثقافة عشر مرات.
  7. إضافة 2.5 مل من DMEM مع 10٪ من FBS والمضادات الحيوية ES-مؤهل (بعد تفكك خلايا الجذع الماوس إلى الخلايا واحد من قبل pipetting مع 1000 ميكرولتر micropipette ثلاث مرات) تعليق خلية الطرد المركزي في 160 × ز لمدة 3 دقائق وإزالة طاف وعدد الخلايا . بعد عد الخلايا، RESEED الخلايا التي جمعت على طبق الجيلاتين المغلفة واحتضان لمدة 30 دقيقة لعزل خلايا الجذع من الخلايا MEF. بعد فرز الخلايا (عادة 1-3 × 10 6 خلية / طبق يمكن جمعها)، RESEED 4 × 10 5 الجذع الخلايا علىالصحن.

2. تغليف الخلية إلى الجيني هيدروجيل كبسولات

  1. جمع الخلايا عن طريق نفس الإجراء الموضح في 1.5 و 1.6. بعد الطرد المركزي في 160 × ز لمدة 3 دقائق، ويغسل بيليه خلية الجذع مع المياه المالحة HEPES مخزنة ثلاث مرات. بعد إعادة تعليق-الخلايا في المياه المالحة HEPES مخزنة، تصفية تعليق الخلية من خلال مصفاة الخلية 40 ميكرومتر من أجل إزالة الركام الكبيرة، التي يمكن أن تسد إلا فوهة.
  2. خلط 2 مل من تعليق خلية داخل المالحة HEPES مخزنة و3 مل من 5٪ ALG-نا الحل. أخيرا 5 مل من تعليق خلية داخل 3٪ ALG-نا الحل يتم الحصول. كثافة الخلية يستحسن أكثر من 10 6 خلية / مل.
  3. بعد جمع تعليق خلية في حقنة 5 مل، تثبيت المشارك المحوري فوهة (الشكل 1A، B) على حقنة وتضعها على ضخ حقنة. تنبعث N 2 تدفق الغاز (أقل من 1L / دقيقة) من خلال إبرة الخارجية للفوهة المشارك المحوري وطرد تعليق الخلية من خلال فوهة الداخلية.
  4. جمع قطرات إلى 250 مل من 0.5٪ CaCl 2 الحل والانتظار 10-20 دقيقة للدبق مع التحريك في 60-90 دورة في الدقيقة.

3. علاج الجيني كبسولات (اختياري)

  1. احتضان كبسولات ALG-كا في 0.05٪ (وزن / حجم) بولي-L-ليسين (PLL) حل لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. بعد غسل كبسولات مع المياه المالحة HEPES مخزنة، احتضان لهم في DMEM تحتوي على 10٪ FBS من أجل تحييد الشحنات الكهربائية على سطحها. الاستفادة منها في كبسولات مغلفة (الشكل 1C).
  3. احتضان الكبسولات في المياه المالحة HEPES مخزنة التي تحتوي على 10 ملي EDTA لمدة 5 دقائق. وتستخدم الكبسولات المعالجة EDTA في كبسولات جوفاء (الشكل 1C).

4. الثقافة وجمع الخلايا في الجينات كبسولات

  1. احتضان خلايا مغلفة في 75 دورة في الدقيقة مع اهتزاز عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2لمدة 10 يوما.
  2. جمع واحتضان الكبسولات في 10 ملي EDTA عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 10 دقيقة. جمع الخلايا من كبسولات الجينات من دون علاج PLL بواسطة الطرد المركزي في 1000 × ز لمدة 3 دقائق.
  3. إذا تعامل كبسولات الجينات مع PLL، وكسر الغشاء ALG-PLL من قبل pipetting صعودا وهبوطا نحو عشرة مرات مع إبرة تعلق على حقنة وأجهزة الطرد المركزي أنه في 1000 - 5000 × ز لمدة 5 دقائق. يجب أن تكون إبرة قطرها أقل من حجم كبسولة و 25 G تستخدم (260 ميكرون) الإبر في هذه التجربة (600 ميكرون)
  4. بعد الطرد المركزي، وجمع بيليه الخلية بدقة من كسر الأغشية ALG-PLL إذا كنت ترغب في جمع عينات مرنا من الخلايا. تبقى الأغشية ALG-PLL ربما يمنع تنقية مرنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في بروتوكول 2.5، حل الجينات طرد يشكل كروية الشكل على الفور بعد طرد (الشكل 2A - H). إذا تم طرد تعليق مع معدل تدفق N 2 أقل من 1L / دقيقة، وحجم قطرات موحد (الشكل 2I). ومع ذلك، إذا كان تدفق N 2 أعلى من 1L / دقيقة، الحبرية ينهار (الشكل 2G، arrowed الأبيض) وحجم قطرات يصبح غير متجانسة (الشكل 2J). ونظرا لهذا، فإنه من الصعب إعداد قطرات أصغر من 500 ميكرون باستخدام هذا الأسلوب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويمكن مقارنة الثقافة التغليف مع الثقافات تعليق المباشرة. ثقافة تعليق هو أبسط طريقة للحصول على كميات كبيرة من الخلايا الجذعية المحفزة من أساليب التغليف. ومع ذلك، والسيطرة على تجميع الخلايا في الثقافة تعليق لا تزال صعبة. في طريقة التغليف، والتجميع الخلوية محدودة في كبسولات، وبالتالي يمكن أن تسيطر عليها بشكل جيد. وأظهر المنشور السابق أن الخلايا مغلفة شكلت مجاميع من حجم موحد، في حين ظهرت كتل زنزانة كبيرة في ثقافة خالية من التعليق 7. وعلاوة على ذلك، أظهر تقرير سابق أن ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث من قبل مشروع S-Innovation التابع للوكالة اليابانية للعلوم والتكنولوجيا (JST) ، وبرنامج الدراسات العليا لقادة الابتكار الحياتي (GPLLI) بجامعة طوكيو ، وزمالة البحث لجمعية العلماء الشباب اليابانية لتعزيز العلوم. نشكر شركة nac Image Technology Inc. على التقاط الأفلام باستخدام كاميرا عالية السرعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الخلايا الليفية لجنين الفأرCell BiolabsSNL 76/7
الخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة بالفأرRIKEN Bio مركز الارتشافiPS-MEF-Ng-20D-17
DMEM عالي الجلوكوزGIBCO11995
ES المؤهل   FBSGIBCO16141079
المضادات الحيوية المضادة للبكتيرياجيبكو15240
الأحماض الأمينية غير الأساسيةجيبكو11140
2-ميركابتو إيثانولجيبكو21985-023
ESGRO عامل مثبط لسرطان الدممرك ميليبورESG1107
التربسين / EDTAجيبكو25300
26 جم / 16 جم إبرةHoshiseido
10 مل حقنةTERUMOSS-10ESZ
صوديوم   ؛ كلوريدواكو191-01665
هيبسسيجماH4034
ألجينات الصوديومواكو194-09955
كلوريد الكالسيومواكو039-00475
بولي إل ليسين (ميغاواط = 15,000 - 30,000)SIGMAP7890
EDTADOJINDO345-01865
مضخة SylingeAS ONE
مجهرأوليمبوسIX71
مجهرلايكاDM IRB
كاميرا عالية السرعةNAC تكنولوجيا الصورMemrecam HX-3

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Zweigerdt, R. Large scale production of stem cells and their derivatives. Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 114, 201-235 (2009).
  2. Chen, A., Chen, X., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Critical microcarrier properties affecting the expansion of undifferentiated human embryonic stem cells. Stem cell Res. 7 (2), 97-111 (2011).
  3. Schroeder, M., et al. Differentiation and lineage selection of mouse embryonic stem cells in a stirred bench scale bioreactor with automated process control. Biotechnol. Bioeng. 92 (7), 920-933 (2005).
  4. Leung, H. W., Chen, A., Choo, A. B. H., Reuveny, S., Oh, S. K. W. Agitation can induce differentiation of human pluripotent stem cells in microcarrier cultures. Tissue Eng. Part C. 17 (2), 165-172 (2011).
  5. Dang, S. M., Gerecht-Nir, S., Chen, J., Itskovitz-Eldor, J., Zandstra, P. W. Controlled, scalable embryonic stem cell differentiation culture. Stem Cells. 22 (3), 275-282 (2004).
  6. Weber, L. M., He, J., Haskins, K., Anseth, K. S. PEG-based hydrogels as an in vitro encapsulation platform for testing controlled for testing controlled ß-cell microenvironments. Acta Biomater. 2 (1), 1-8 (2006).
  7. Horiguchi, I., Chowdhury, M. M., Sakai, Y., Tabata, Y. Proliferation, morphology, and pluripotency of mouse induced pluripotent stem cells in three different types of alginate beads for mass production. Biotechnol. Prog. 30 (4), 896-904 (2014).
  8. Rahman, N., Purpura, K. A., Wylie, R. G., Zandstra, P. W., Shoichet, M. S. The use of vascular endothelial growth factor functionalized agarose to guide pluripotent stem cell aggregates toward blood progenitor cells. Biomaterials. 31 (32), 8262-8270 (2010).
  9. Siti-Ismail, N., Bishop, A. E., Polak, J. M., Mantalaris, A. The benefit of human embryonic stem cell encapsulation for prolonged feeder-free maintenance. Biomaterials. 29, 3946-3952 (2008).
  10. Magyer, J. P., Nemir, M., Ehler, E., Suter, N., Perriard, J., Eppenberger, H. M. Mass Production of Embryoid Bodies in Microbeads. Ann. N. Y. Acad. Sci. 944, 135-143 (2001).
  11. Xu, J., Li, S., Tan, J., Luo, G. Controllable Preparation of Monodispersed Calcium Alginate Microbeads in a Novel Microfluidic System. Chem. Eng. Technol. 31 (8), 1223-1226 (2008).
  12. Sakai, M. P., Y, Development of Bioactive Hydrogel Capsules for The 3D Expansion of Pluripotent Stem Cells in Bioreactors. Biomater. Sci. 2 (176), 176-183 (2014).
  13. Chowdhury, M. M., Katsuda, T., Montagne, K., Kimura, H., Kojima, N., Akutsu, H., Ochiya, T., Fujii, T., Sakai, Y. Enhanced effects of secreted soluble factor preserve better pluripotent state of embry- onic stem cell culture in a membrane-based compartmentalized micro-bioreactor. Biomed. Microdevices. 12 (6), 1097-1105 (2010).
  14. Chowdhury, M. M., Kimura, H., Fujii, T., Sakai, Y. Induction of alternative fate other than default neuronal fate of embryonic stem cells in a membrane-based two-chambered micro- bioreactor by cell-secreted BMP4. Biomicrofluidics. 6 (1), 14117-14117-13 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EDTA

مقالات ذات صلة