مقالة منهجية

على قناة واحدة وتحليل الكالسيوم التصوير في Podocytes من الكبيبات المعزولة حديثا

DOI:

10.3791/52850

⸱

يونيو 27, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تعد التغييرات في مستويات الكالسيوم داخل الخلايا في الخلايا البودية واحدة من أهم الوسائل للتحكم في وظيفة ترشيح الكبيبات. نوضح هنا نهجا عالي الإنتاجية يسمح باكتشاف مناولة الكالسيوم في الوقت الفعلي ونشاط القنوات الأيونية المفردة في خلايا الكبيبات المعزولة حديثا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
من المعروف >jove_content<أن الخلايا البودوية (الخلايا الظهارية الكبيبية الكلوية) تنظم نفاذية الكبيبات وتحافظ على بنية الكبيبات ؛ وقد تم تحديد دور رئيسي لهذه الخلايا في التسبب في أمراض الكلى المختلفة لأن إصابة الخلايا تؤدي إلى البيلة البروتينية ومحو عملية القدم. تم الإبلاغ سابقا عن أن العديد من العوامل الذاتية قد تسبب حمولة زائدة كبيرة في تركيز Ca2+ داخل الخلايا في الخلايا البودوية ، مما يؤدي على الأرجح إلى البيلة الزلالية ، ومن المحتمل أن يحدث هذا عبر القنوات الأيونية الموصلة للكالسيوم. لذلك ، بدا من المهم دراسة التعامل مع الكالسيوم في الخلايا البودية في ظل الظروف العادية وفي الحالات المرضية المختلفة. ومع ذلك ، ظلت الأساليب التجريبية المتاحة محدودة إلى حد ما على الخلايا المستنبتة والمتنقلة. على الرغم من أنها تمثل نموذجا أساسيا جيدا لمثل هذه الدراسات ، إلا أنها مستخرجة بشكل أساسي من البيئة الأصلية للكبيبة. نصف هنا منهجية دراسة الخلايا البودية كجزء من الكبيبة الكاملة المعزولة حديثا. يحتفظ هذا المستحضر بالإمكانيات الوظيفية للخلايا البودية ، والتي لا تزال مرتبطة بالشعيرات الدموية. لذلك ، تبقى الخلايا البودوية في البيئة التي تحافظ على الأجزاء الرئيسية من جهاز ترشيح الكبيبات. توضح هذه المخطوطة طريقتين تجريبيتين يسمحان ب 1) الكشف في الوقت الفعلي عن تغيرات تركيز الكالسيوم بمساعدة الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر النسبي ، و 2) تسجيل نشاط القنوات الأيونية المفردة في خلايا الكبيبات المعزولة حديثا. تستخدم هذه المنهجيات مزايا البيئة الأصلية للكبيبة التي تمكن الباحثين من حل التغيرات الحادة في معالجة الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لتطبيقات العوامل المختلفة ، وقياس التركيز الأساسي للكالسيوم داخل الخلايا (على سبيل المثال ، لتقييم تطور المرض) ، وتقييم توصيل الكالسيوم ومعالجته على مستوى القنوات الأيونية المفردة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكلى الحفاظ على التوازن استتبابي للمواد المختلفة وتنظيم حجم الدم في الطريقة التي يحدد مجموع ضغط الدم. الاضطرابات في الترشيح الكلوي، استيعاب أو إفراز الرصاص أو مرافقة الحالات المرضية، التي تتراوح بين المفرط أو انخفاض ضغط الدم لإنهاء مرحلة المرض الكلوي الذي يتطلب في نهاية المطاف زرع الكلى. وحدة تصفية الكلى (الكبيبة) ويتكون من ثلاث طبقات - البطانة الشعرية، الغشاء القاعدي وطبقة خلية واحدة من الخلايا الطلائية - podocytes، والتي تلعب دورا رئيسيا في الحفاظ على سلامة شق الحجاب الحاجز وظيفة 1. الخلل في تصفية الكبيبي permselective يسبب فقدان البولية من الجزيئات، مثل بروتينية. عوامل مختلفة قد تؤثر على هيكل podocytes والعمليات أقدامهم، والتي تحدد على سلامة حاجز الترشيح الكبيبات.

وتشارك podocytes في الحفاظ على يسرقeruli ظيفة الترشيح. وقد ثبت أن تناول الكالسيوم غير لائق من قبل خلية رجلاء يؤدي إلى إصابة الخلايا ويلعب دورا هاما في تطور مختلف أشكال nephropathies 2،3. لذلك، ووضع نموذج الذي يسمح للقياس المباشر للتغيرات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا سوف يكون مفيدا للدراسات وظيفة خلية رجلاء. تم الكبيبات معزولة تستخدم سابقا في العديد من الدراسات بما في ذلك قياس معامل الانعكاس الألبومين يغير 4 و تقييم التيارات الخلوية المتكاملة في خلية كاملة الكهربية القياسات التصحيح، المشبك 5،6. في هذه الورقة وصفنا البروتوكول الذي يسمح الباحث لقياس التغيرات تركيز الكالسيوم داخل الخلايا استجابة لطلبات من وكلاء الدوائية، وتقدير مستويات القاعدية من الكالسيوم داخل الخلايا، وتقييم النشاط الفردي قنوات الكالسيوم. قياسات تركيز الكالسيوم Ratometric والتصحيح، المشبك electropاستخدمت hysiology لتحديد التغيرات في تركيز الكالسيوم داخل الخلايا ضمن النشاط خلية رجلاء وقناة، على التوالي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استخدام الحيوان ورعايته ينبغي أن تلتزم دليل المعاهد الوطنية للصحة للرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية التالية بروتوكولات مراجعتها والموافقة عليها من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي (IACUC).

1. الكلى فلوش

  1. استخدام 8-12 اسبوع الفئران الذكور القديم (المقترح هو سلالة سبراغ داولي، ومع ذلك سلالات أخرى من مختلف الأعمار والجنسين يمكن استخدامها مع التغييرات المناسبة).
  2. تخدير الحيوان وفقا للإجراءات التي يسمح بها بروتوكول IACUC. رصد عمق التخدير وفحص الحيوانات. وصف مفصل للجراحة التي يتعين القيام بها في 1،3-1،8 يمكن العثور عليها في Ilatovskaya وآخرون 7.
  3. بعد التخدير المناسب، ووضع الحيوان على طاولة الجراحة التحكم في درجة حرارته، وجعل شق خط الوسط من البطن (ما يصل الى 3 بوصات في الطول)، وكشف الوريد الأجوف والشريان الأورطي.
  4. إدراج رباط حول الاضطرابات الهضمية والمساريقي العلوي الشرايين والبطنالشريان الأبهر فوق تلك. لا ligate.
  5. بلانت تشريح الشريان الأورطي البطني تحت الشرايين الكلوية، ووضع اثنين من الأربطة المحيطة به، ولكن لا ligate، ثم تضييق الشريان الأبهر فوق الحروف المركبة وربط موضوع أقل.
  6. يقثطر الشريان الأورطي مع أنابيب البولي ايثيلين PE50 (تعلق على ضخ حقنة مليئة PBS) تحت المشبك وإصلاح القسطرة مع ربطة الثاني. إزالة المشبك، بدوره على مضخة، وligate الشريان الأورطي والشرايين المساريقي مع الاضطرابات الهضمية. جعل بسرعة شق في الوريد الكلوي لتخفيف الضغط.
  7. يبث في الشريان الأورطي مع PBS المبردة قبل لمدة 2 أو 3 دقائق بمعدل 6 مل / دقيقة.
  8. وقف نضح والرسوم وdecapsulate 7 الكلى، ووضعها على الجليد في حل PBS. الموت ببطء الحيوانية وفقا لبروتوكول التي وافق عليها IACUC.

2. عزل الجرذ الكبيبات

  1. إعداد 30 مل من محلول جديدة من 5٪ BSA في RPMI 1640.
  2. باستخدام شفرة حلاقة ومقص،عزل القشرة من كل من الكليتين، ومن ثم اللحم المفروم حتى متجانسة. وقد وصفت هذا الإجراء في وقت سابق 7.
  3. دفع الأنسجة المفروم خلال الخطوة السابقة من خلال 100 شبكة المقاوم للصدأ غربال الصلب (غارقة مسبقا في 5٪ BSA / RPMI الحل) باستخدام ملعقة. جمع التدفق من خلال وبالقوة خطورة السماح للتدفق من خلال لتمرير من خلال غربال 140 شبكة.
  4. تصفية التدفق من خلال جمعها من شبكة 140 غربال باستخدام غارقة قبل 200 عيون غربال، تجاهل الترشيح، وغسل الجزء العلوي من غربال مع 10-15 مل من محلول استعداد BSA / RPMI لجمع الكبيبات أن الرواسب على غربال.
  5. وضع حل BSA / RPMI تحتوي على الكبيبات على الجليد في أنبوب 15 مل وترك الرواسب الكبيبات في الجزء السفلي من الأنبوب لمدة تصل إلى 20 دقيقة. وسوف ينظر في التركيز الكبيبات على الجزء السفلي من الأنبوب بشكل واضح. إزالة الحل الزائدة، وترك ما يقرب من 2 مل في الأنبوب.

3. على قناة واحدة التصحيح، المشبك شركةectrophysiology

  1. إعداد 5 × 5 مم رقائق الزجاج غطاء من قبل طلائها مع MW 70،000 - 150،000 بولي ʟ، ليسين، واسمحوا الجافة. استخدام حوالي 30 ميكرولتر من 0.01٪ محلول معقم التي تمت تصفيتها في الماء في غطاء زجاجي.
  2. الاحماء الحلول التجريبية لRT وملء غرفة التصحيح المشبك وماصة. لقنوات TRPC الرصد واستخدام حل حمام، في ملي: 126 كلوريد الصوديوم، 1 CaCl 2، 10 HEPES، 2 MgCl 2، 10 الجلوكوز، ودرجة الحموضة 7.4؛ ماصة: 126 كلوريد الصوديوم، 1.5 CaCl 2، 10 HEPES، 10 الجلوكوز. 7.4 درجة الحموضة.
    1. إضافة مثبطات إلى حل ماصة لمنع النشاط من القنوات المحلية، والتي هي ليست ذات صلة للدراسات (الموصى بها: 100 ميكرومتر حمض niflumic أو DIDS (لمنع الكالسيوم 2+ -activated الكلور - قنوات)، 10 ملي TEA (لكبح واسع تصرف الكالسيوم 2 + - K يعتمد + قناة)، 10 نانومتر iberiotoxin (لمنع الكالسيوم 2+ -activated K + قنوات)، 10 ميكرومتر نيكارديبين (لمنع N-نوع كا2+ قنوات)) مباشرة قبل التجربة التصحيح، المشبك.
  3. المزيج بلطف حل تحتوي على الكبيبات، ومن ثم تطبيق ما يقرب من 50 ميكرولتر من أن الغطاء المطلي رقائق الزجاج بولي ʟ-يسين. السماح للكبيبات نعلق لمدة 5 دقائق تقريبا.
  4. نقل رقائق الزجاج مع الكبيبات إلى غرفة التصحيح المشبك شغل قبل مع الحل حمام. يروي غرفة بمعدل 3 مل / دقيقة لمدة 1 دقيقة لضمان إزالة الكبيبات غير مرتبط.
  5. إجراء تجربة التصحيح، المشبك التقليدية في وضع الخلية المرفقة 7. مع ماصة الزجاج (7-10 MΩ المقاومة ماصة) شكل خاتم عالية المقاومة بين ماصة وغشاء خلية رجلاء من خلال تطبيق طيف الامتصاص (ماصة تعلق على خلية رجلاء على سطح الكبيبة معزولة في الشكل 2، على اليسار).
  6. للقياسات الخلية المرفقة، المنخفضة تمرير التيارات في 300 هرتز على فلتر من ثماني قطب بسل.
  7. Uحد ذاتها معزولة الكبيبات في تجارب التصحيح، المشبك لمدة تصل إلى 4-6 ساعة. الحفاظ على جزء الأسهم الكبيبات على الجليد.

4. القياسات Ratiometric متحد البؤر مضان من تركيز الكالسيوم داخل الخلايا في Podocytes

  1. وضع 500 ميكرولتر من الكسر الكبيبات (وصفها في 2.5) في 0.5 مل أنبوب مخروطي الشكل وإضافة الأصباغ الكالسيوم FURA الأحمر، وAM فلوو-4، AM. استخدام 2 مم و 1 تركيزات الأسهم ملي من FURA الأحمر، وAM فلوو-4، AM، على التوالي (مخزن في -20 ° C، الذائبة في DMSO) واستخدام 2.5 ميكرولتر من كل صبغة ل500 ميكرولتر من الكبيبات الكسر. مباشرة بعد إضافة الأصباغ تغطية الأنبوب بورق الألمنيوم.
  2. مكان الأنابيب على شاكر الدورية لمدة 20 دقيقة على الأقل ما يصل إلى 1 ساعة على RT.
    ملاحظة: وكلاء الدوائية ويمكن أن يضاف خلال هذه الخطوة.
  3. إعداد coverslips الزجاج، غطاء لهم مع بولي ʟ يسين والسماح التجفيف باستخدام ساخنة لوحة مجموعة إلى 70 درجة مئوية.
  4. بمجرد تحميل الأصباغ الكالسيوم الإنشائيةه، وتطبيق 100 ميكرولتر من الكبيبات التي تحتوي على حل للل coverslips المغلفة بولي ʟ-يسين والسماح لهم التمسك السطح لمدة 5 دقائق. جبل لل coverslips المرفقة الكبيبات إلى غرفة التصوير، ويروي مع الحل حمام (التي تحتوي على (مم): 145 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 2 MgCl 2، 10 HEPES، ودرجة الحموضة 7.35) بمعدل 3 مل / دقيقة لإزالة الكبيبات غير مرتبط والأصباغ المتبقية.
  5. تعيين متحد البؤر المسح بالليزر المجهر إلى 488 نانومتر الطول الموجي الإثارة والمرشحات الانبعاثات (525/25 650/25 ونانومتر لفلوو-4 و FURA الأحمر، على التوالي). تعيين برامج التصوير على التردد المطلوب والقرار.
  6. العثور على الكبيبات في brightfield ثم تتحول على الكشف عن إشارة مضان. ضبط كثافة الليزر لكل صبغ لتجنب تشبع الإشارة. اختر المستوى البؤري مع podocytes التي يعلق مباشرة على الزجاج. هذا يقلل من تأثير الناجم عن تقلص من الكبيبة ردا على المخدراتالتطبيق. المزدوج الاختيار التي الكبيبة من اختيار ويرد أيضا على الزجاج.
  7. بدء تصوير البؤري من خيار (لقطة 512 X 512 صورة مع تردد وضعت في 4 ثانية لتصور كا سريع 2+ تغيرات عابرة. استخدام 60X / NA 1.4 أو عدسة موضوعية مماثلة لصورة عالية الدقة)، وتطبيق المخدرات من الفائدة، وتسجيل استجابة.
    1. اختر المستوى البؤري المطلوب (أقرب إلى سطح الزجاج ممكن، لضمان تصوير podocytes على سطح الكبيبة). تحقق من شدة مضان على Fluo4 وقنوات FuraRed، وتأكد من أن الكبيبة وينظر بشكل واضح في brightfield.
    2. بدء التصوير. قبل تطبيق أي أدوية، سجل 1 دقيقة على الأقل من مضان خط الأساس للتأكد من أن إشارة مستقرة (لا توجد طفرات مفاجئة أو يتلاشى من إشارة).
    3. تطبيق الأدوية المطلوبة مع مساعدة من micropipette. توخي الحذر والتأكد من ان المخدرات قادرة على الانتشار بشكل جيد والوصول إلى glomerأولوس. مزيج الحل حمام بلطف إذا لزم الأمر، ومراقبة البؤري المحدد وتأكد من أنه لم يتحرك من التركيز بسبب تطبيق المخدرات.
    4. تسجيل التغيرات في كثافة مضان للإشارات Fluo4 وFuraRed. تأكد من تسجيل طويل بما فيه الكفاية، عن طريق الانتظار حتى تصل إشارة مستوى الهضبة أو تصل إلى الذروة ثم يعود الى الاساس. أداء التغيير حل أو إضافة أي أدوية أخرى إذا لزم الأمر.
    5. إيقاف التسجيل، وحفظ الملف في تنسيق أصلي من البرنامج.

5. تحليل الصور لقياس الكالسيوم

  1. لتحليل الصورة مع يماغيج البرمجيات مفتوحة مجهزة المساعد المساعدة ND التي تسمح باستيراد الصور في شكل ND2 الأصلي.
  2. استيراد تسلسل الصور. تأكد لتقسيم القنوات واستخدام وضع hyperstack الرمادي.
  3. اتبع → أدوات → مسار مدير تحليل العائد على الاستثمار في البرمجيات يماغيج لسالقلم نافذة مدير ROI. اختر العديد من المناطق ذات الاهتمام (podocytes) باستخدام أداة التحديد البيضاوي و "إضافة (ر)" وظيفة في إدارة العائد على الاستثمار. كما ROI الماضي، تحديد منطقة في الخلفية. حفظ رويس المحدد (المزيد → حفظ).
  4. تسليط الضوء على الإطار الذي يحتوي على القناة المحددة للتحليلات. استخدام المزيد → متعددة الوظائف قياس في إدارة ROI، بمناسبة "صف واحد لكل شريحة" مربع في الحوار أن الملوثات العضوية الثابتة، ومن ثم انقر فوق موافق. وسيتم عرض النتائج في شكل يمكن أن تقام في إطار النتائج: الدخول في نتائج خيار القائمة → مجموعة القياسات، حدد "يعني قيمة الرمادية" وحساب قيم الكثافة بكسل لكل ROI، والتي سوف يتم عرضها في نتائج نافذة في أعمدة منفصلة لكل ROI.
  5. نسخ قيم الكثافة قياس العائد على الاستثمار لكل قناة (فلوو-4 و FURA الأحمر) في فضل برمجيات تحليل البيانات؛ طرح قيم الكثافة الخلفية من كل داتنقطة.
  6. لكل نقطة زمنية حساب نسبة كثافة من فلوو-4 إلى قنوات FURA الأحمر. مؤامرة مبعثر / خط التغييرات في الوقت نقطة من الكالسيوم 2+ عابرة لكل ROI. حساب القيم متوسط ​​/ SE للكبيبات المحدد.
    ملاحظة: يجب تعيين عمود وقت وفقا لتردد التصوير المحدد عند 4.5.

6. داخل الخلوية الحسابات تركيز الكالسيوم عن طريق فلوو-4 الإسفار الإشارة

  1. أخذ عينة من الكبيبات وتنفيذ بروتوكول تجريبي تصل إلى الخطوة 4.7. بعد تسجيل مضان الخلفية إضافة Ionomycin (تركيز النهائي في غرفة الحمام يجب أن تكون 10 ميكرومتر) إلى حل حمام، وسجل مضان زيادة كثافة. عند بلوغ كثافة الأقصى ويبدأ تسوس، إضافة MnCl 2 (يجب أن يكون التركيز النهائي 5 ملم) لإرواء مضان 8.
  2. تحليل البيانات التي تم الحصول عليها في 6.1. نسخ القيم كثافة ROI فلوو-4 إشارة التي تم الحصول عليها وفقالبروتوكول صفها في 5،1-5،5 بواسطة برنامج التحليل المفضل.
  3. حساب تركيز الكالسيوم داخل الخلايا (في نانومتر) في خلية رجلاء المقابلة لROI باستخدام الصيغة:
    figure-protocol-1
    حيث K د هو التفكك محدد مسبقا المستمر لفلوو-4 (345 نيوتن متر)، F هو كثافة في timepoint التي تقوم بحساب تركيز الكالسيوم ل(خط الأساس)، وF دقيقة وF ماكس هي القيم كثافة في نقطة الحمل الأقصى الكالسيوم (بعد تطبيق ionomycin) وبعد التبريد من مضان (مع MnCl 2)، على التوالي (انظر الشكل 3).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا تعالج مشكلة قياس التغيرات الحادة في مستويات الكالسيوم في podocytes الشكل 1 يدل على تمثيل تخطيطي للبروتوكول تجريبي تصميمها من أجل أداء عالية الدقة التصوير متحد البؤر مضان الحية وحيدة القناة الايونية التسجيلات النشاط في podocytes من الطازجة الكبيبات القوارض معزولة. لفترة وجيزة، بعد مخدرة الفئران، يجب غسل الكلى مع برنامج تلفزيوني واضحة لهم من الدم. ثم، يتم استئصال الكلى وdecapsulated، ويتم عزل الكبيبات من قشرة الكلى عن طريق النخل التفاضلي. يمكن أن يؤخذ جزء من...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

النهج وصفها هنا يسمح لتحليل التعامل مع الكالسيوم من قبل podocytes من الكبيبات القوارض. هذا الأسلوب يسمح تطبيق التصحيح، المشبك الكهربية واحد قناة ومضان التصوير متحد البؤر ratiometric. ومع ذلك، كلا النهجين يمكن استخدامها بشكل منفصل، من تلقاء نفسها. البروتوكول المقترح عدة خطوات بسيطة نسبيا، بما في ذلك الاحمرار 1) الكلى. 2) عزل الكبيبات التي كتبها النخل التفاضلي. 3) إجراء التصحيح، المشبك التجارب الكهربية، أو حضانة الكبيبات مع الفلورسنت الأصباغ وضع العلامات الكالسيوم للتصوير متحد البؤر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

فإن الكتاب أود أن أشكر غلين سلوكم (كلية الطب في ويسكونسن) وكولين A. لافين (نيكون الآلات، وشركة) للحصول على المساعدة الفنية ممتازة مع التجارب المجهري. ومن المسلم به غريغوري بلاس لتصحيح التجارب المطبعية نقدية للمخطوطة. وأيد هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للHL108880 منحة الصحة وجمعية السكري الأميركية منح 1-15-BS-172 (إلى AS)، وJ. زمالة بن Lipps البحوث من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى (لDVI).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Fluo4 AMLife TechnologiesF14217500 µl في DMSO
FuraRed AMLife TechnologiesF-3020
Poly-ʟ-lysineSigma-AldrichP4707
Pluronic acidSigma-AldrichF-68محلول
IonomycinSigma-AldrichI3909-1ML
مدور أنابيبMiltenyi Biotec GmbH130-090-753ألمانيا
مجهر كونفوكالي Nikon (مقلوب)NikonNikon A1Rإثارة الليزر 488 nm. مرشحات الانبعاث 500-550 nm و 570-620 nm
عدسة شيئيةNikonPlan Apo 60x/NA 1.4 Oil
غطاء زجاجيThermo Scientific6661B52
شحم مفرغ عاليDow Corningمركب سيليكون
برنامجNikonNikon NIS-Elements
غرفة تسجيل/ترويةWarner InstrumentsRC-26
مضخم تثبيت الرقعةMolecular DevicesMultiClamp 700B
نظام الحصول على البياناتMolecular DevicesDigidata 1440Aنظام Axon Digidata®
مرشح تمرير منخفضWarner InstrumentsLPF-88 pole Bessel
شعيرات زجاجية من البوروسيليكاتWorld Precision Instruments1B150F-4
جهاز سحب الماصات الدقيقةSutter Instrument CoP-97جهاز سحب ماصات دقيقة من نوع الحرق/Brown
جهاز تشكيل دقيق (Microforge)NarishigeMF-830اليابان
متلاعب دقيق بمحركSutter Instrument CoMP-225
مجهر مقلوبNikonEclipse Ti
طاولة عزل الاهتزازات الدقيقةTMCمجهزة بقفص فاراداي
نظام تروية بصمامات متعددة القنواتAutoMake ScientificValve Bank II
غرفة تسجيل/ترويةWarner InstrumentsRC-26
برنامجMolecular DevicespClamp 10.2
NicardipineSigma-AldrichN7510
IberiotoxinSigmaI5904-5UG
Niflumic acidSigma-AldrichN0630
DIDSSigma-AldrichD3514-25MG
TEA chlorideTocrisT2265
RPMI 1640Life Technologies11835030بدون مضادات حيوية
BSASigma-AldrichA8327محلول ألبومين 30%
طاولة جراحية محكومة الحرارةMCW coreللقوارض
مناخل فولاذية:#100 (150 μm), 140 (106 μm)
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO200Fisher Sci50-871-316
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO270Fisher Sci50-871-318
Gilson, Inc SIEVE 3 SS FH NO400Fisher Sci50-871-320
mesh 200Sigma-Aldrichs4145منخل لـ CD-1
مجهر ثنائي العينينNikonEclipse TS100
مجهر ثنائي العينينNikonSMZ745
نظام تروية يعتمد على مضخة حقنةHarvard Apparatus
أنابيب بولي إيثيلينSigma-AldrichPE50
تخدير Isofluoranefigure-materials-1 VetEquip, Inc.911103
كواشف أساسية أخرىSigma-Aldrich

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Machuca, E., Benoit, G., Antignac, C. Genetics of nephrotic syndrome: connecting molecular genetics to podocyte physiology. Hum. Mol. Genet. 18, R185-R194 (2009).
  2. Haraldsson, B., Nystrom, J., Deen, W. M. Properties of the glomerular barrier and mechanisms of proteinuria. Physiol. Rev. 88, 451-487 (2008).
  3. Patrakka, J., Tryggvason, K. New insights into the role of podocytes in proteinuria. Nat. Rev. Nephrol. 5, 463-468 (2009).
  4. Savin, V. J., Sharma, R., Lovell, H. B., Welling, D. J. Measurement of albumin reflection coefficient with isolated rat glomeruli. J. Am. Soc. Nephrol. 3, 1260-1269 (1992).
  5. Gloy, J., et al. Angiotensin II depolarizes podocytes in the intact glomerulus of the Rat. J. Clin. Invest. 99, 2772-2781 (1997).
  6. Nitschke, R., et al. Angiotensin II increases the intracellular calcium activity in podocytes of the intact glomerulus. Kidney Int. 57, 41-49 (2000).
  7. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol Biol. 998, 355-369 (2013).
  8. Snitsarev, V. A., McNulty, T. J., Taylor, C. W. Endogenous heavy metal ions perturb fura-2 measurements of basal and hormone-evoked Ca2+ signals. Biophys. J. 71, 1048-1056 (1996).
  9. Fukuda, A., Fujimoto, S., Iwatsubo, S., Kawachi, H., Kitamura, K. Effects of mineralocorticoid and angiotensin II receptor blockers on proteinuria and glomerular podocyte protein expression in a model of minimal change nephrotic syndrome. Nephrology (Carlton). 15, 321-326 (2010).
  10. Abramowitz, J., Birnbaumer, L. Physiology and pathophysiology of canonical transient receptor potential channels). FASEB J. 23, 297-328 (2009).
  11. Heeringa, S. F., et al. A novel TRPC6 mutation that causes childhood FSGS. PLoS ONE. 4, e7771(2009).
  12. Zhang, X., Song, Z., Guo, Y., Zhou, M. The novel role of TRPC6 in vitamin D ameliorating podocyte injury in STZ-induced diabetic rats. Mol. Cell. Biochem. 399, 155-165 (2015).
  13. Bohrer, M. P., et al. Mechanisms of the puromycin-induced defects in the transglomerular passage of water and macromolecules. J. Clin. Invest. 60, 152-161 (1977).
  14. Olson, J. L., Rennke, H. G., Venkatachalam, M. A. Alterations in the charge and size selectivity barrier of the glomerular filter in aminonucleoside nephrosis in rats. Lab. Invest. 44, 271-279 (1981).
  15. Schiessl, I. M., Castrop, H. Angiotensin II AT2 receptor activation attenuates AT1 receptor-induced increases in the glomerular filtration of albumin: a multiphoton microscopy study. Am J Physiol Renal Physiol. 305, F1189-F1200 (2013).
  16. Ilatovskaya, D. V., Levchenko, V., Ryan, R. P., Cowley, A. W., Staruschenko, A. NSAIDs acutely inhibit TRPC channels in freshly isolated rat glomeruli. Biochem. Biophys. Res. Commun. 408, 242-247 (2011).
  17. Peti-Peterdi, J. Calcium wave of tubuloglomerular feedback. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 291, F473-F480 (2006).
  18. Peti-Peterdi, J., Warnock, D. G., Bell, P. D. Angiotensin II directly stimulates ENaC activity in the cortical collecting duct via AT(1) receptors. J. Am. Soc. Nephrol. 13, 1131-1135 (2002).
  19. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305, C1050-C1059 (2013).
  20. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidney Int. 305, C1050-C1059 (2014).
  21. Schaldecker, T., et al. Inhibition of the TRPC5 ion channel protects the kidney filter. J. Clin. Invest. 123, 5298-5309 (2013).
  22. Roshanravan, H., Dryer, S. E. ATP acting through P2Y receptors causes activation of podocyte TRPC6 channels: role of podocin and reactive oxygen species. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 306, F1088-F1097 (2014).
  23. Anderson, M., Roshanravan, H., Khine, J., Dryer, S. E. Angiotensin II activation of TRPC6 channels in rat podocytes requires generation of reactive oxygen species. J. Cell. Physiol. 229, 434-442 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة