يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي

17.5K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52871

⸱

أبريل 21, 2015

 ,  , 
1Inflammation Research Center, VIB, 2Department of Biomedical Molecular Biology, Ghent University

في هذه المقالة

ملخص

يسمح بروتوكول الترسيب المناعي المشترك هذا بدراسة التفاعل بين البروتين النووي لفيروس الأنفلونزا A والبروتين Mx1 المضاد للفيروسات في الخلايا البشرية. يؤكد البروتوكول على أهمية N-ethylmaleimide لنجاح الترسيب المناعي المشترك للبروتين النووي لفيروس Mx1 وفيروس الأنفلونزا A.

الملخص

تعد دراسة التفاعل بين البروتينات أمرا أساسيا في فهم وظيفتها (وظائفها). تسمى الطريقة القوية جدا التي تستخدم بشكل متكرر لدراسة تفاعلات البروتينات مع الجزيئات الكبيرة الأخرى في عينة معقدة بالترسيب المناعي المشترك. يسمح بروتوكول الترسيب المناعي المشترك الموصوف بإظهار التفاعل بين بروتين مقاومة الفيروسات المخاطية 1 (Mx1) وأحد أهدافه الفيروسية ، وهو البروتين النووي لفيروس الأنفلونزا A (NP) وإجراء مزيد من التحقيق فيه. يبدأ البروتوكول بخلايا الثدييات المنقولة ، ولكن من الممكن أيضا استخدام الخلايا المصابة بفيروس الأنفلونزا A كمادة أولية. بعد تحلل الخلايا ، يتم سحب بروتين NP الفيروسي بجسم مضاد محدد ويتم ترسيب المجمعات المناعية الناتجة بحرز البروتين G. يتم الكشف لاحقا عن السحب الناجح ل NP والترسيب المناعي المشترك لبروتين Mx1 المضاد للفيروسات عن طريق النشاف الغربي. الشرط الأساسي لنجاح الترسيب المناعي المشترك ل Mx1 مع NP هو وجود N-ethylmaleimide (NEM) في المخزن المؤقت لتحلل الخلية. يؤلكل NEM مجموعات الثيول الحرة. من المفترض أن يعمل هذا التفاعل على استقرار تفاعل NP-Mx1 الضعيف و / أو العابر من خلال الحفاظ على شكل محدد ل Mx1 أو هدفه الفيروسي أو مكون ثالث غير معروف. أحد القيود المهمة لتجارب الترسيب المناعي المشترك هو السحب غير المقصود للبروتينات الملوثة ، الناجم عن الارتباط غير المحدد للبروتينات بخرز البروتين G أو الأجسام المضادة. لذلك ، من المهم جدا تضمين إعدادات التحكم لاستبعاد النتائج الإيجابية الخاطئة. يمكن استخدام بروتوكول الترسيب المناعي المشترك الموصوف لدراسة تفاعل بروتينات Mx من أنواع الفقاريات المختلفة مع البروتينات الفيروسية أو أي زوج من البروتينات أو بروتين مع جزيئات كبيرة أخرى. يجب اختبار الدور المفيد ل NEM في تثبيت التفاعلات الضعيفة و / أو العابرة لكل زوج تفاعل على حدة.

المقدمة

مقاومة فيروس مخاطي (MX) البروتينات تعد جزءا هاما من الدفاع المناعي الفطري ضد مسببات الأمراض الفيروسية. هذه البروتينات هي GTPases مثل dynamin الكبيرة التي يتم الناجمة عن النوع الأول والنوع الثالث إنترفيرون. المقابلة الجينات الإرسال المتعدد موجودة في جميع الفقاريات تقريبا في واحدة أو عدة نسخ والمنتجات الجينات، تمنع مجموعة واسعة من الفيروسات، بما في ذلك فيروسات مخاطية قويمة (على سبيل المثال، فيروس الأنفلونزا)، فيروسات ربدية (على سبيل المثال، فيروس التهاب الفم الحويصلي)، الفيروسات البنياوية (على سبيل المثال. ، LA فيروس اكروس) وRetroviridae (على سبيل المثال، فيروس نقص المناعة البشرية-1) 1-4. ومن غير الواضح كيف تعترف هذه البروتينات مثل مجموعة واسعة من الفيروسات، من دون أي تسلسل الأساسي المشترك واضح الزخارف في هذه الفيروسات. تحليل تفاعل البروتينات الإرسال المتعدد مع أهدافها الفيروسية، ويحتمل أن تنطوي على المجمعات أجل أعلى مع العوامل الخلية المضيفة الأخرى، سوف تساعد على فهم الآليات الجزيئية روقد تطورت قبعة في سباق التسلح بين الفيروسات ومضيفيهم.

وقد تمت دراسة التفاعل بين البروتينات الإرسال المتعدد في الثدييات والأهداف الفيروسية الأكثر نطاق واسع لMXA البشري. MXA الإنسان يمكن أن تحول دون تكرار العديد من الفيروسات، بما في ذلك orthomyxoviruses الأنفلونزا وفيروس Thogoto. MXA يربط Thogoto المجمعات بروتين نووي ريبوزي فيروس (vRNPs)، وبالتالي منع دخولهم النووي، مما يؤدي إلى كتلة من العدوى 5. وقد تجلى هذا التفاعل بين MXA وThogoto vRNPs فيروس مع زملاء الترسيب وشارك في مناعي التجارب 6-9. كيف تعيق البروتينات الإرسال المتعدد فيروسات الأنفلونزا A غير أقل وضوحا. واحد المشكلة الرئيسية هي أنه ليس واضحة لإثبات وجود التفاعل بين البروتين الإرسال المتعدد ومنتج الجين الأنفلونزا. أظهر تقرير واحد تفاعل بين MXA البشري والبروتين NP في الأنفلونزا A خلايا الفيروس 10. يمكن أن يظهر هذا التفاعل إلا من خلال التعاون immunoprecipitation إذا كان قد تعامل الخلايا مع ربط عبر dithiobis كاشف (succinimidyl بروبيونات) قبل تحلل، مما يدل على أن التفاعل هو عابر و / أو ضعيف. وقد أظهرت الدراسات الحديثة أن الفرق الإرسال المتعدد حساسية مختلفة سلالات الأنفلونزا A يتم تحديد من أصل البروتين NP 11،12. وتماشيا مع هذا، يمكن أن فيروسات الأنفلونزا A الهروب جزئيا من سيطرة الإرسال المتعدد التي تحور بقايا محددة في البروتين NP 13. وهذا يشير إلى أن الهدف الرئيسي من فيروسات الإنفلونزا A للمضيف MX هو البروتين NP، على الأرجح NP تجميعها في مجمعات vRNP. ومع ذلك، فإن أيا من هذه الدراسات الأخيرة أظهرت وجود أكثر التفاعل بين NP الإنفلونزا أو vRNPs وإما MXA البشري أو الماوس MX1.

أظهرنا مؤخرا، لأول مرة، وهو التفاعل بين أنفلونزا NP والبروتين MX1 الماوس مع الأمثل بروتوكول التعاون مناعي 14، الذي يوصف هنا بالتفصيل. في العام، وشارك في طmmunoprecipitation هي واحدة من الطرق الكيميائية الحيوية الأكثر استخداما للتحقيق تفاعلات البروتين البروتين. وغالبا ما يفضل هذه التقنية على تقنيات بديلة، على سبيل المثال، الخميرة اثنين الهجين، لأنه يسمح للتحقيق في التفاعلات البروتين البروتين في بيئتها الطبيعية. يمكن أن يتم التعاون مناعي خارجا على البروتينات وأعرب التطور الطبيعي إذا كانت الأجسام المضادة ضد البروتينات ذات الاهتمام المتاحة. بدلا من ذلك، البروتينات من الفائدة يمكن التعبير في الخلية من خلال ترنسفكأيشن أو العدوى، ويمكن استخدامه علامة التقارب. وبالإضافة إلى المزايا المذكورة أعلاه، وبروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح للكشف عن ضعف و / أو عابرة تفاعلات البروتين. المكون الرئيسي في هذا البروتوكول الأمثل هو إضافة N-ethylmaleimide (NEM) في المخزن المؤقت تحلل الخلية. NEM هو كاشف مؤلكل أن يتفاعل مع مجموعات ثيول المجانية مثل موجودة في cysteines، في الرقم الهيدروجيني من 6،5-7،5، لتشكيل مستقر ثيو استر(الشكل 1). في ارتفاع درجة الحموضة، ويمكن NEM أيضا تتفاعل مع مجموعات الأمينية أو الخضوع التحلل 15. وعادة ما تستخدم NEM لمنع الجماعات ثيول الحرة، وذلك لمنع تشكيل ثاني كبريتيد السندات أو تمنع النشاط الأنزيمي. على سبيل المثال، غالبا ما يستخدم NEM لمنع desumoylating الإنزيمات، والتي هي البروتياز السيستين. في بروتوكول التعاون مناعي وصفها، أدرج NEM في البداية في المخزن المؤقت تحلل لقد ذكر أن sumoylation من البروتينات الإنفلونزا يمكن أن تؤثر في التفاعل بين البروتينات الفيروسية 16. بشكل غير متوقع، أثبتت إضافة NEM أن يكون المفتاح لتوثيق التفاعل بين NP الإنفلونزا، والماوس MX1 التي شارك في مناعي. ومن غير الواضح لماذا إضافة NEM أمر حاسم للكشف عن التفاعل NP-MX1. ربما التفاعل هو عابر جدا و / أو ضعيف. NEM يمكن تحقيق الاستقرار في التفاعل، على سبيل المثال، من خلال الحفاظ على التشكل محدد من MX1، وهو بروتين فيروسي أو حتى كومبو الثالث غير معروفnent. وقد لوحظ مثل هذا أثر في تحقيق الاستقرار من NEM من قبل، على سبيل المثال، للتفاعل بين اختزال الريبونوكليوتيد M1 وجيمسيتابين المانع لها (F2dC) 17. MX1 وNP كلا تحتوي على بقايا السيستين متعددة والتي يمكن تعديلها من قبل NEM. على سبيل المثال، أظهرت دراسة حديثة أجرتها ريني آخرون أن stalkless MXA-البديل يحتوي على ثلاثة المذيبات بقايا السيستين يتعرض التي يمكن تعديلها من قبل iodoacetamide. تحور هذه المخلفات إلى serines لم يؤثر على النشاط الأنزيمي من MXA، ولكن منعت بوساطة ثاني كبريتيد التجميع 18. كما يتم حفظها هذه cysteines في MX1، وهذا يشير إلى أن cysteines مماثل في MX1 يمكن تعديلها من قبل NEM وعلى هذا النحو تأثير التشكل، أو الذوبان. وبالإضافة إلى ذلك، NEM قد تؤثر أيضا على النشاط GTPase من MX1، وهو أمر ضروري للنشاط مضاد للأنفلونزا من MX1، وبالتالي تحقيق الاستقرار في التفاعل بين MX1 وNP. ومع ذلك، فإن التأثير المباشر للNEM على تشغيل إشارات GTPasevity من MX1 غير المحتمل، كما هو مطلوب NEM أيضا للكشف عن التفاعل بين NP الإنفلونزا، وGTPase المسوخ غير نشطة من البروتين MX1 14. ومن الواضح أن هناك حاجة إلى مزيد من الأبحاث لكشف تأثير NEM على التفاعل NP-MX1.

وباختصار، فإن بروتوكول التعاون مناعي وصف يسمح لدراسة التفاعل بين البروتين MX1 المضادة للفيروسات وهدفه الفيروسي والأنفلونزا البروتين NP. ويمكن أيضا أن تستخدم هذا البروتوكول لدراسة أخرى التفاعلات الضعيفة أو عابرة التي تعتمد على استقرار التشكل البروتين محددة. وقد وصفت البروتين البروتين التفاعل التي تعتمد على التشكل محددة من قبل، على سبيل المثال، على البروتينات ملزم الكالسيوم مثل كالمودولين 19. وأخيرا، يمكن أن تستخدم أيضا دور الفعال لNEM في الطرق الأخرى التي تكشف عن تفاعلات البروتين البروتين، مثل فحوصات المشارك الترسيب.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: تم تأسيس بروتوكول ترنسفكأيشن وشارك في مناعي التالية لشكل طبق بتري 9 سم. صيغ أخرى ممكنة أيضا بعد توسيع نطاق البروتوكول.

1. البذر الكلى الجنينية البشرية (HEK) خلايا 293T

  1. البذور قبل ترنسفكأيشن عند 1.2 × 10 6 خلايا في 9 سم طبق بتري في 12 مل من المتوسط ​​تعديل النسر Dulbecco لفي (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين، 2 مم L-الجلوتامين، 0.4 ملي نا-البيروفات الخلايا HEK293T يوم واحد، 0.1 ملم الأحماض الأمينية غير الأساسية، و 100 U / البنسلين مل و 0.1 ملغ / مل الستربتومايسين.
  2. تنمو الخلايا 16 ساعة على 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.
  3. بصريا تفتيش على التشكل وقابلية الخلايا مع مجهر الضوء المعكوس قبل ترنسفكأيشن. الخلايا تحتاج إلى أن تكون متكدسة الفرعية لأفضل كفاءة ترنسفكأيشن.

2. الكالسيوم فوسفات ترنسفكأيشن من خلايا HEK293T

ملاحظة: استخدام 0.5-1 ميكروغرام من pCAXL-NP أو فارغة بلازميد pCAXL في تركيبة مع 1-3 ميكروغرام من pCAXL-MX1 في 9 سم الطبق. استخدام مبلغ مساو من إجمالي DNA البلازميد في جميع العينات. ضبط مع البلازميد فارغة إذا لزم الأمر.

  1. إعداد مخازن ترنسفكأيشن التالية:
    1. إعداد تريس، EDTA (TE) مع تركيزات 1.0 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8.0 و 0.1 ملي EDTA الرقم الهيدروجيني 8.0.
    2. إعداد BS / HEPES مع تركيزات 25 ملي HEPES (5.96 غرام / L، 4- (2-هيدروكسي إيثيل) حامض -1-piperazineethanesulfonic)، 274 مم كلوريد الصوديوم (16 ز / L)، 10 ملي بوكل (0.74 جم / L)، 1.5 ملي NaHPO 4 · 12H 2 O (0.5 غرام / L) و 11.1 مم سكر العنب (2 ز / L). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.05.
    3. إعداد CaCl 2 / HEPES مع تركيزات 1.25 M CaCl 2 · 2H 2 O (183.8 جم / L) و 125 ملي HEPES (29.79 جم / لتر). ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 7.05 مع هيدروكسيد الصوديوم.
  2. تدفئة مخازن ترنسفكأيشن في 37 ° C قبل الاستخدام.
  3. إعداد العينات البلازميد التي كتبها تمييع DNA البلازميد في 600 ميكرولتر من TE.إعداد هذه الخلائط في الآبار من لوحة 6 جيدا.
  4. إضافة 150 ميكرولتر من CaCl 2 / HEPES بطريقة حكيمة قطرة للعينات البلازميد ومزيج من قبل pipetting 3 مرات صعودا وهبوطا.
  5. إعداد الحل ترنسفكأيشن قطرة مضيفا الحكمة الحل البلازميد (TE + DNA + CaCl 2 / HEPES، 750 ميكرولتر) إلى 750 ميكرولتر من العازلة BS / HEPES المنصوص عليها في لوحة 6 جيدا جديدة. توزيع الحل البلازميد بالتساوي على كامل تحتوي كذلك BS / HEPES العازلة.
  6. يهز الحل ترنسفكأيشن على لوحة شاكر لمدة 90 ثانية في 1،000 دورة في الدقيقة.
  7. احتضان الخليط لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  8. إضافة محلول ترنسفكأيشن (1.5 مل) قطرة من الحكمة أن الخلايا. استخدام ممص مكروي P1000 بالتنقيط الحل ترنسفكأيشن على الخلايا. تفريق الخليط على كامل 9 سم طبق بتري ويهز لوحة بلطف شديد.
  9. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 6 ساعة. ثم إزالة المتوسطة التي كتبها طموح واستبدال واي فوراعشر 12 مل الطازجة والمتوسطة قبل تحسنت. بلطف إضافة متوسطة جديدة للخلايا لمنع انفصال الخلية. لهذا، وعقد غيض من الماصة ضد الجانب من البئر وبلطف طرد المتوسط.
  10. احتضان الخلايا لمدة 16 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية وCO 2 5٪.

3. المشارك مناعي

ملاحظة: إجراء شارك في مناعي 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.

  1. إعداد منخفض العازلة تحلل الملح والملح العالية غسل العازلة.
    1. إعداد محلول المخزون من 2 M N-ethylmaleimide (NEM) عن طريق وزن كمية NEM وحلها في الايثانول المطلق. إعداد الأسهم حل NEM الطازجة قبل استخدامها.
      تنبيه: NEM سامة جدا، وإعداد واستخدام هذا الحل الأسهم في غطاء الدخان.
    2. إعداد منخفض الملح العازلة تحلل بتركيزات من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 150 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي حمض ethylenediaminetetraacetic (EDTA)، 1٪ NP40 وكوكتيل مثبط البروتياز (حل الجدول 1ر في 50 مل العازلة تحلل). إضافة NEM إلى تركيز النهائي من 25 ملم (أي تمييع 1:80). الحفاظ على الجليد بعد إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وNEM.
      ملاحظة: دائما إضافة مثبطات الأنزيم البروتيني وNEM الطازجة قبل استخدامها.
    3. إعداد الملح العالية العازلة يغسل بتركيزات من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 8، 500 مم كلوريد الصوديوم، 5 ملي EDTA و 1٪ NP40. لاحظ أن غسل العازلة الملح العالية لا يحتوي NEM.
  2. إعداد لست] الخلية.
    1. إزالة المتوسطة وغسل الخلايا مع 2 مل من الفوسفات الجليد الباردة مخزنة المالحة (PBS). إضافة بلطف جدا غسل العازلة، وخلايا HEK293T تنفصل بسهولة.
    2. إزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 600 ميكرولتر من الجليد الباردة منخفض العازلة تحلل الملح في 9 سم طبق بتري.
    3. احتضان لوحات لمدة 20 دقيقة على الجليد. تأكد من أن لوحات يتم الاحتفاظ الأفقي، لضمان تغطية كاملة لسطح اللوحة مع تحلل العازلة. يهز بلطف لوحات كل 5 دقائق.
    4. جمع المحللة خلية في microcentrifuge 1.5 ملأنبوب وأجهزة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 4 درجات مئوية و 16،000 x ج لتكوير جزء غير قابلة للذوبان.
    5. نقل جزء القابلة للذوبان، أي المحللة خلية إلى الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والحفاظ على الجليد. تواصل مباشرة مع بروتوكول التعاون مناعي، لمنع تفكك البروتينات التفاعل. تنفيذ كافة الخطوات التالية قدر الإمكان على الجليد أو على 4 درجات مئوية للحد من نشاط بروتين في لست].
  3. جيل من المركبات المناعية.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، البروتين من الفائدة لا بد من الأجسام المضادة المناسبة. لدراسة التفاعل NP-MX1، واستخدام الماوس لمكافحة NP وحيدة النسيلة الأجسام المضادة.
    1. لكل عينة، مزيج 135 ميكرولتر من المحللة مع 2 ميكرولتر من مكافحة NP الأجسام المضادة وحيدة النسيلة و 113 ميكرولتر من تحلل العازلة منخفضة الملح (إجمالي حجم 250 ميكرولتر). تخزين المحللة المتبقية في -20 ° C لمزيد من التحليل مثل النشاف الغربي، لتوثيق مستويات التعبير من INTERA مظنونشركاء ction في الخلايا المصابة بالعدوى بالنقل.
      ملاحظة: بدلا من ذلك، وقياس تركيز البروتين من المحللة (على سبيل المثال مع برادفورد كاشف) واستخدام كمية ثابتة من البروتين الكلي، على سبيل المثال، 400 ميكروغرام لكل المحللة.
    2. احتضان مزيج الأجسام المضادة المحللة لمدة 3 ساعة على عجلة تحول في 4 درجات مئوية. ويمكن تمديد هذه الخطوة إلى الحضانة بين عشية وضحاها.
  4. إعداد البروتين الخرز G.
    ملاحظة: يتم شحنها والخرز البروتين G وتخزينها في 20٪ من الإيثانول لحفظ. للالطين حبة يتكون عادة من 50٪ الخرز وتحتاج إلى أن تغسل هذه الخرز قبل أن يتم استخدامها لimmunoprecipitate المركبات المناعية.
    1. استخدام 50 ميكرولتر من الخرز، أي 100 ميكرولتر من حبة الطين، لكل عينة. تغسل كمية من الخرز اللازمة لجميع العينات في مقايسة شارك في مناعي في أنبوب واحد. قطع غيض من طرف ماصة 1 مل لتخفيف pipetting لمن حبة الطين.
    2. أجهزة الطرد المركزي البروتين G حبة الطين في 8،000 Xز و 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. إزالة حل الإيثانول وإضافة حجم مساو من انخفاض العازلة تحلل الملح. الطرد المركزي البروتين G حبة الطين في 8،000 x ج و 4 درجة مئوية لمدة 30 ثانية وإزالة طاف بلطف. كرر هذه الخطوة يغسل 3 مرات.
      ملاحظة: منخفض العازلة تحلل الملح تستخدم لغسل حبات ليست في حاجة لاحتواء مثبطات الأنزيم البروتيني أو NEM.
    3. تقدير حجم البروتين الخرز G وإضافة حجم مساو من انخفاض العازلة تحلل الملح لجعل الجديد 50٪ حبة الطين في انخفاض العازلة تحلل الملح.
    4. لكل عينة، ونقل 100 ميكرولتر من حبة الطين في الطازجة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge وتخزينها على الجليد حتى الاستخدام. كن حذرا لresuspend وحبة الطين قبل تقسيم، وهذه الخرز الرواسب بسرعة إلى أسفل الأنبوب.
  5. مناعي من المركبات المناعية عن طريق بروتين G الخرز وشطف بهم.
    1. قبل استخدام بروتين G الخرز لمناعي، الطرد المركزي كل 30 ثانية في أنابيب 8،000 x ج و 4 ° C وتحقق عن طريق التفتيش البصري أن هناك مبلغ مساو من الخرز موجودة في جميع العينات. إذا لزم الأمر ضبط كمية من الخرز في بعض من العينات وأجهزة الطرد المركزي مرة أخرى. تجاهل supernatants. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بروتين G حبات مكعبات.
    2. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة على المركبات المناعية (أي.، لست] مع الأجسام المضادة، 250 ميكرولتر) لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C لجمع العينة كاملة في الجزء السفلي من الأنبوب. نقل المركبات المناعية للبروتين G الخرز (50 ميكرولتر).
    3. احتضان 60 دقيقة على عجلة تحول في 4 درجات مئوية. لا احتضان هذه المركبات المناعية أطول من 75 دقيقة مع حبات للحد ملزمة انوعي من البروتينات للبروتين G الخرز.
    4. أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G (مع المربوطة المركبات المناعية) لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C وإزالة supernatants. يجب الحرص على عدم تعكير صفو بروتين G حبات مكعبات. اختياري: تخزين هذه supernatants في 4 درجات مئوية أو -20 ° C لتحليلها لاحقا،على سبيل المثال، لتقدير كمية البروتين غير منضم.
    5. غسل بروتين G الخرز لحوالي 5 دقائق مع 900 ميكرولتر من الملح العالية العازلة تحلل. تأكد من أن الخرز ومعلق تماما في غسل العازلة لغسل الأمثل. أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج و 4 ° C وتجاهل supernatants. كرر هذه الخطوة غسل 4 مرات. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الخرز بروتين G مكعبات لتجنب فقدان المواد immunoprecipitated.
    6. بعد الخطوة غسل الماضي، إضافة 50 ميكرولتر من 2X Laemmli عينة العازلة إلى الخرز وتسخين تعليق لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية إلى أزل (المشترك) البروتينات immunoprecipitated.
      1. إعداد 10 مل من العازلة 6X Laemmli مع 1 غرام من دوديسيل كبريتات الصوديوم، 3.5 مل من الجلسرين، و 3.5 مل من 1 M تريس، حمض الهيدروكلوريك درجة الحموضة 6.8 و 420 ميكرولتر من β المركابتويثانول. التكيف مع إجمالي حجم 10 مل بإضافة الماء المقطر. تمييع 3 مرات في الماء المقطر للحصول عازلة 2X Laemmli.
        تنبيه: &# 946؛ -mercaptoethanol غير سامة، وإعداد واستخدام عازلة Laemmli في غطاء الدخان.
    7. وبعد التسخين، أجهزة الطرد المركزي البروتين الخرز G لمدة 30 ثانية في 8،000 x ج وتخزين العينات في 4 درجات مئوية (قصيرة الأجل) أو -20 ° C (على المدى الطويل).

4. تحليل (المشارك) Immunoprecipitated البروتينات

  1. تصور البروتينات الموجودة في الخلايا المحللة وشطافة من شارك في مناعي من قبل SDS-PAGE 20 و غرب النشاف 21،22. تحميل عادة نصف شطافة Laemmli على هلام. يجب الحرص على عدم تعكير صفو الخرز مكعبات G البروتين عند أخذ عينات للهلام التحميل. تم الكشف عن MX1 وNP التعبير مع مضاد للMX1 ومكافحة NP الأجسام المضادة، على التوالي 14. تم الكشف عن العصابات مع لمعان كيميائي على أساس HRP ومطور فيلم الأشعة السينية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

N-ethylmaleimide هو مركب عضوي التي يمكن استخدامها لتعديل بشكل لا رجعة فيه جماعات ثيول الحرة، على سبيل المثال لمنع البروتياز السيستين (الشكل 1).

بروتين مضاد للفيروسات الأنفلونزا A MX1 يمنع تكاثر الفيروس من خلال التفاعل مع البروتين النووي الفيروسي. والأمثل بروتوكول التعاون مناعي الموصوفة هنا يسمح لدراسة هذا التفاعل NP-MX1. و transfected الخلايا HEK293T مع ناقلات التعبير عن البروتين MX1 الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

دراسة التفاعل بين البروتينات المضادة للفيروسات وأهدافها الفيروسية مهم جدا لفهم تفاصيل آلية المضادة للفيروسات من هذه البروتينات. هذا يمكن أن تعطي رؤى جديدة في كيفية الفيروسات ومضيفيهم شارك تطورت وتكون أساسا لوضع استراتيجيات المضادة للفيروسات جديدة. والأمثل بروتوكول التعاون مناعي الموصوفة هنا يسمح لدراسة التفاعل بين البروتين الماوس MX1 وهدفه الفيروسي والأنفلونزا البروتين NP. الجانب الأكثر أهمية من هذا البروتوكول هو إضافة NEM في المخزن المؤقت تحلل، والتفاعل NP-MX1 غير قابل للكشف في غ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

تعلن المؤلفين أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من قبل FWO-فلاندر، ومشروع الاحتلال IOF10 / StarTT / 027 وجامعة غنت الخاصة بحوث غرانت BOF12 / GOA / 014.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
DMEM ارتفاع الجلوكوزGibco52100-047
N-EthylmaleimideSigmaE-3876
Toxic Igepal CA-630SigmaI-30212المعروف أيضا باسم NP40
كوكتيل مثبط البروتيازRoche11 873 580 001
الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل NPالمعاهد الوطنية للصحة ومستودعموارد أبحاث العدوى الناشئةNR-4282مزيج من الاستسقاء A1 و A3
مصل متعدد النسيلة مضاد ل RNPالمعاهد الوطنية للصحة ومستودع موارد أبحاث العدوى الناشئةNR-3133موجه ضد A / Scotland / 840/74 (H3N2)
البروتين G Sepharose 4FFGE Healthcare17-0618-01
Hyperfilm ECL 18 × 24 سمGE Healthcare28-9068-36
ECL الركيزة النشاف الغربيبيرس32106

المراجع

  1. Verhelst, J., Hulpiau, P., Saelens, X. Mx proteins: antiviral gatekeepers that restrain the uninvited. Microbiol Mol Biol Rev. 77 (4), 551-566 (2013).
  2. Goujon, C., et al. Human MX2 is an interferon-induced post-entry inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 559-562 (2013).
  3. Kane, M., et al. MX2 is an interferon-induced inhibitor of HIV-1 infection. Nature. 502 (7472), 563-566 (2013).
  4. Liu, Z., et al. The interferon-inducible MxB protein inhibits HIV-1 infection. Cell Host Microbe. 14 (4), 398-410 (2013).
  5. Kochs, G., Haller, O. Interferon-induced human MxA GTPase blocks nuclear import of Thogoto virus nucleocapsids. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (5), 2082-2086 (1999).
  6. Flohr, F., Schneider-Schaulies, S., Haller, O., Kochs, G. The central interactive region of human MxA GTPase is involved in GTPase activation and interaction with viral target structures. FEBS Lett. 463 (1-2), 24-28 (1999).
  7. Kochs, G., Haller, O. GTP-bound human MxA protein interacts with the nucleocapsids of Thogoto virus (Orthomyxoviridae). J Biol Chem. 274 (7), 4370-4376 (1999).
  8. Mitchell, P. S., et al. Evolution-guided identification of antiviral specificity determinants in the broadly acting interferon-induced innate immunity factor MxA. Cell Host Microbe. 12 (4), 598-604 (2012).
  9. Patzina, C., Haller, O., Kochs, G. Structural requirements for the antiviral activity of the human MxA protein against Thogoto and influenza A virus. J Biol Chem. 289 (9), 6020-6027 (2014).
  10. Turan, K., et al. Nuclear MxA proteins form a complex with influenza virus NP and inhibit the transcription of the engineered influenza virus genome. Nucleic Acids Res. 32 (2), 643-652 (2004).
  11. Dittmann, J., et al. Influenza A virus strains differ in sensitivity to the antiviral action of Mx-GTPase. J Virol. 82 (7), 3624-3631 (2008).
  12. Zimmermann, P., Manz, B., Haller, O., Schwemmle, M., Kochs, G. The viral nucleoprotein determines Mx sensitivity of influenza A viruses. J Virol. 85 (16), 8133-8140 (2011).
  13. Manz, B., et al. Pandemic influenza A viruses escape from restriction by human MxA through adaptive mutations in the nucleoprotein. PLoS Pathog. 9 (3), e1003279(2013).
  14. Verhelst, J., Parthoens, E., Schepens, B., Fiers, W., Saelens, X. Interferon-inducible protein Mx1 inhibits influenza virus by interfering with functional viral ribonucleoprotein complex assembly. J Virol. 86 (24), 13445-13455 (2012).
  15. Brewer, C. F., Riehm, J. P. Evidence for possible nonspecific reactions between N-ethylmaleimide and proteins. Anal Biochem. 18 (2), 248-255 (1967).
  16. Wu, C. Y., Jeng, K. S., Lai, M. M. The SUMOylation of matrix protein M1 modulates the assembly and morphogenesis of influenza A virus. J Virol. 85 (13), 6618-6628 (2011).
  17. Chen, Z., Zhou, J., Zhang, Y., Bepler, G. Modulation of the ribonucleotide reductase M1-gemcitabine interaction in vivo by N-ethylmaleimide. Biochem Biophys Res Commun. 413 (2), 383-388 (2011).
  18. Rennie, M. L., McKelvie, S. A., Bulloch, E. M., Kingston, R. L. Transient dimerization of human MxA promotes GTP hydrolysis, resulting in a mechanical power stroke. Structure. 22 (10), 1433-1445 (2014).
  19. Gifford, J. L., Walsh, M. P., Vogel, H. J. Structures and metal-ion-binding properties of the Ca2+-binding helix-loop-helix EF-hand motifs. Biochem J. 405 (2), 199-221 (2007).
  20. Separating Protein with SDS-PAGE. , JoVE. Available from: http://www.jove.com/science-education/5058/separating-protein-with-sds-page (2014).
  21. Gallagher, S., Chakavarti, D. Immunoblot analysis. J Vis Exp. (16), (2008).
  22. Eslami, A., Lujan, J. Western blotting: sample preparation to detection. J Vis Exp. (44), (2010).
  23. Pavlovic, J., Haller, O., Staeheli, P. Human and mouse Mx proteins inhibit different steps of the influenza virus multiplication cycle. J Virol. 66 (4), 2564-2569 (1992).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

البروتين النووي لفيروس الإنفلونزاحبيبات البروتين Gلطخة ويسترنN-ethylmaleimideتحلل الخلاياالمعقدات المناعيةارتباط الأجسام المضادةالخلايا المنقولة جينياً
شارك في مناعي من البروتين ماوس MX1 مع الأنفلونزا من الفيروسات البروتين النووي
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.