إنشاء وتوصيف UTI وCAUTI في نموذج الفأر

التهابات المسالك البولية (عدوى المسالك البولية) هي واحدة من الالتهابات البكتيرية الأكثر شيوعا ويمكن تقسيمها إلى فئتين استنادا إلى آلية الاستحواذ والمجتمع والمكتسبة بالمستشفيات المكتسبة UTI. وقد أظهرت عدوى المسالك البولية غالبا ما تحدث في النساء والدراسات الأصحاء المكتسبة من المجتمع وأن ما يقرب من 50٪ من النساء واحد على الأقل UTI في حياتهم ^1. بالإضافة إلى ذلك، تكرار مشكلة كبيرة. وقالت امرأة لديها العدوى الحادة الأولي لديه فرصة 25-40٪ من وجود عدوى الثانية في غضون ستة أشهر رغم ذلك مناسبا العلاج بالمضادات الحيوية والعديد من النساء ما زلن أن يكون تكرار متكررة ^2. البكتيريا التي تسبب هذه الالتهابات أصبحت أيضا المضادات الحيوية على نحو متزايد مقاومة المزيد من بروتوكولات العلاج التباس ^3-6. UTI تؤثر على ملايين الأشخاص في كل عام تكلف ما يقرب من 2.5 مليار دولار في النفقات المتعلقة بالرعاية الصحية في الولايات المتحدة، مما يؤكد تأثير وانتشار المرضاكتسبت 1،7 .Nosocomial عدوى المسالك البولية ترتبط أساسا مع وجود أجسام غريبة مثل القسطرة سكنى. المرتبطة القسطرة البولية (CAUTI) تبقى المكتسبة بالمستشفيات الأكثر شيوعا المكتسبة UTI، وهو ما يمثل ~ 70-80٪ من هذه الإصابات ^8. وعلاوة على ذلك، يرتبط CAUTI مع زيادة معدلات الاعتلال والوفيات وهذا هو السبب الأكثر شيوعا للالتهابات مجرى الدم الثانوية ^9.

ويعتقد UPEC المجتمع المرتبطة المكتسبة عدوى المسالك البولية أن يكون ناجما عن إدخال البكتيريا إلى المثانة من الخزانات في الجهاز الهضمي عن طريق التلاعب الميكانيكية أثناء الجماع الجنسي، وسوء النظافة أو غيرها من ديناميات السكان الميكروبية بين مضيف آخر الكوات ^10. مرة واحدة داخل المثانة، UPEC توظيف العديد من عوامل الفوعة، بما في ذلك كبسولة، ونظم الحصول على الحديد، والسموم، البلازميد الفوعة، tRNAs والجزر المرضية وعوامل الاستعمار التي ثبت أنها تلعب دورا في التسبب <سوب> 11-14. حاسمة لإنشاء UPEC الاستعمار، UPEC أيضا ترميز أنواع متعددة من كوصي اللصق فاتحة الطريق (CUP) الشعرة التي تعترف مستقبلات مع خصوصية الفراغية ^15. نوع 1 الشعرة، يميل مع adhesin FimH، يتم التعبير من قبل UPEC وربط uroplakins ¹⁶ و α-1، β-3 integrins ^17، والتي يتم التعبير عنها على سطح اللمعية كل قربة الإنسان والفأر ¹⁸ mannosylated. هذه التفاعلات بوساطة FimH تسهل الاستعمار الجرثومي وغزو الخلايا الظهارية السطحية ^19،20. مرة واحدة داخل الخلية، يمكن UPEC الهروب إلى السيتوبلازم حيث بكتيريا واحدة يمكن تقسيم بسرعة لتشكيل المجتمع البكتيريا داخل الخلايا (IBC)، التي تقوم عليها النضج، يمكن أن تحتوي على البكتيريا ~ 10 ^{4 21.} وقد تجلى تشكيل IBC في لا يقل عن ستة سلالات مختلفة الماوس، C3H / الدجاجة، C3H / HEJ، C57BL / 6، CBA، FVB / NJ وBALB / ج، ومع طائفة واسعة من مختلف تعميم التعليم الابتدائيسلالات C وغيرها المعوية ^22-24. لكن الاختلافات الزمنية والمكانية لتشكيل IBC يمكن أن تختلف تبعا لخلفية الماوس والضغط اصابة UPEC. في C3H / الفئران دجاجة مصابة UPEC تنميط سلالات UTI89 أو تشكيل CFT073، IBC يمكن تصور الكتل الحيوية كما صغيرة من البكتيريا في وقت مبكر من 3 HPI (عدوى آخر ساعة). استمر هذا المجتمع لتوسيع ويصل إلى "نقطة الوسط" للتنمية حوالي 6 HPI عندما تحتل قضيب على شكل بكتيريا نسبة كبيرة من مساحة هيولي من خلايا مظلة سطحية متباينة عضال هذه أوائل شكل الحاويات الوسيطة بطريقة متزامن نسبيا مع الأغلبية التي تظهر أبعاد مماثلة والأشكال التضاريسية. ~ 8 HPI البكتيريا في التغيير IBC من العصيات لمكورات التشكل. الحاويات الوسيطة هي عابرة في الطبيعة. وبالتالي، IBC النضج 12-18 النتائج HPI في التوسع المستمر للسكان البكتيريا، تليها filamentation وتشتيت للخروج من واي الخليةث انتشار لاحق إلى الخلايا المجاورة ^23. وبالتالي، فإن مكانة IBC يسمح لنمو البكتيريا السريع في بيئة محمية من المضيف الاستجابات المناعية والمضادات الحيوية ^25. ويلاحظ في مراحل متميزة من العدوى UPEC التي ينظر إليها في الفئران كما في البشر، مثل الحاويات الوسيطة وfilamentation، ودعم نموذج الفأر من UTI كأداة المفيدة التي يمكن استخدامها لنموذج UTI في البشر ^22،26-28.

في حين أن الغالبية العظمى من النساء يعانين من التهاب المسالك البولية في حياتهم، ونتيجة هذه الالتهابات يمكن أن تتراوح من الإصابة الذاتي الحد الحاد مع عدم وجود تكرار لالتهاب المثانة المتكرر بشكل متكرر. وعلاوة على ذلك، فقد أظهرت الدراسات حدوث عائلي قوي من التهاب المسالك البولية، مما يشير إلى يساهم عنصر وراثي للحساسية UTI ^29. لقد وجدنا أن نتائج UTI اختلاف ينظر في عيادات يمكن يتجلى في نتائج مختلفة من العدوى UPEC التجريبية بين السلالات الفطرية الماوس ^30. على سبيل المثال، C3H / الدجاجة، CBAوالفئران DBA، وC3H / HeOuJ عرضة، بطريقة تعتمد على الجرعة المعدية، ليدوم طويلا، التهاب المثانة المزمن يتميز المستمرة، والبكتيريا عيار عالية (> 10 ⁴ مستعمرة (كفو) / مل)، عيار عالية بكتيريا أعباء المثانة بتضحيات> 4 أسابيع بعد الإصابة (WPI)، والتهاب مزمن، ونخر الظهارة البولية. هذه الفئران أيضا عرض مستويات المصل مرتفعة من IL-6، G-CSF، KC، وIL-5 في HPI 24 الأولى التي تكون بمثابة المؤشرات الحيوية لتطوير التهاب المثانة المزمن. هذا قد يمثل بدقة المسار الطبيعي للUTI في بعض النساء، حيث أظهرت الدراسات همي أن نسبة كبيرة من النساء تعاني سوف UTI محافظة على مستويات عالية من البكتيريا في البول لعدة أسابيع بعد ظهور الأعراض الأولى من التهاب المثانة إذا لم تعط العلاج بالمضادات الحيوية ^{31 (32 عاما).} وعلاوة على ذلك، وذلك باستخدام الفئران C3H / الدجاجة، وجدنا أن تاريخ من التهاب المثانة المزمن هو عامل خطر كبير للعدوى المتكررة الشديدة اللاحقة. المتكررة UTI هو الأكثر سيالمظاهر السريرية gnificant من التهاب المسالك البولية والماوس C3H / الدجاجة حاليا النموذج الوحيد الذي يلخص درس تهيء زادت بعد التعرض السابق. ولخص A نتائج UTI الثانية في C57BL / 6 الفئران حيث الإصابة UPEC الحاد محدودة ذاتيا، مع قرار من التهاب المثانة والجرثومية غضون ما يقرب من أسبوع. ومن المثير للاهتمام، في هذا النموذج، UPEC تشكيل بسهولة الخزانات داخل الخلايا هادئة داخل أنسجة المثانة التي UPEC قادرون على الخروج من حالة سبات على بدء لUTI نشط، ويحتمل أن تشرح آلية واحدة لنفس السلالة UTI المتكرر في البشر ^{33 و 34.}

بالإضافة إلى التأثيرات الوراثية على UTI الحساسية، وإدخال قسطرة في المثانة يزيد كثيرا من احتمال وجود العدوى، وكذلك زيادة نطاق من البكتيريا قادرة على أن تسبب عدوى. وقد ثبت أن القسطرة البولية الإنسان تسبب النسيجية والتغيرات المناعية في المثانة بسبب الإجهاد الميكانيكي الذي يؤدي إلى الاستجابة الالتهابية قوية، تقشير، وذمة من الصفيحة المخصوصة وsubmucusa، ترقق الظهارة البولية، والغشاء المخاطي آفة من الظهارة البولية والكلى ^35،36. بالإضافة إلى ذلك، توفر القسطرة سطح لالتصاق البكتيريا وبالتالي خلق بيئة التي تستخدمها العديد من الأنواع أن يسبب CAUTI. في حين UPEC لا تزال مساهما رئيسيا، وحسابات المعوية البرازية عن 15٪ من هذه CAUTI ^37. E. البرازية تزداد مقاومة للمضادات الحيوية مع فانكومايسين مقاومة ظهور، مما يشكل مشكلة صحية خطيرة ^38. E. البرازية تمتلك عوامل الفوعة عديدة من بينها السموم وadhesins اللازمة لمرفق لكل من القسطرة وظهارة ^38. خلال القسطرة البولية، والمضيف هو عرضة للميكروبات التصاق والضرب ونشر في المسالك البولية ^39،40. E. faecaالدعاوى تشكل الأغشية الحيوية على القسطرة كجزء من آلية لتستمر في المثانة وتنشر على الكلى، والذي يرد في الماوس CAUTI نموذج ^41. في الآونة الأخيرة، وقد تبين أنه خلال القسطرة البولية، ويتم تحريرها الفيبرينوجين (FG) في المثانة كجزء من الاستجابة الالتهابية. FG يتراكم في المثانة، والمعاطف القسطرة، كما أنه ضروري لE. البرازية تشكيل بيوفيلم، يعمل بمثابة سقالة المرفق. في نموذج C57BL / 6 الماوس من CAUTI، اكتشفنا أن E. تشكيل بيوفيلم البرازية على القسطرة، وبالتالي استمرار في المثانة، وكان يعتمد على شعرة EBP، وتحديدا في EbpA طرف adhesin. وجدنا أن المجال N-محطة من EbpA يربط خصيصا لFG طلاء القسطرة. بالإضافة إلى ذلك، فقد وجد أن E. البرازية تستخدم FG كمصدر الأيض خلال العدوى، مما يعزز تشكيل بيوفيلم ^42.

وقد أثبتت نماذج الماوس حاسم لالفضوليةtanding وكذلك التنبؤ المظاهر السريرية للالتهاب المسالك البولية وCAUTI ^41. في هذه المقالة أن نبرهن إعداد اللقاح من التهاب المثانة UPEC عزل UTI89 والتلقيح عبر الاحليل من الفئران C3H / الدجاجة. بالإضافة إلى ذلك، علينا أن نظهر بروتوكول لإدخال القسطرة في C57BL / 6 الفئران والتلقيح من E. البرازية OG1RF سلالة. كل من هذه الأساليب تؤدي إلى التهاب المسالك البولية ثابت وموثوق بها أو CAUTI في الفئران. نحن أيضا عرض التقنيات المستخدمة لمراقبة تشكيل IBC خلال التهاب المثانة الحاد وجمع البول لتحليل التهاب المثانة المزمن أو المتكرر. وقد استخدمت الفئران C3H / الدجاجة لدراسة جوانب UPEC المرضية بما في ذلك الغزو الأولي البكتيرية، وتشكيل IBC، filamentation وتطوير التهاب المثانة المزمن ^23،33،43. كما درست هذه المعايير الفوعة في مجموعة متنوعة من الخلفيات الماوس الأخرى ^22،33. لCAUTI، وC57BL / 6 النموذج يسمح لزرع جسم غريب في المثانة مع زملاء البكتيرية لاحقاlonization، والتي لا يمكن الحفاظ عليه لمدة 7 أيام بعد الإصابة ^41. كانت هذه نماذج مفيدة لتقييم آليات الفوعة البكتيرية، والاستجابات المضيفة لالتهاب المسالك البولية وآليات لتخريب الردود المضيف، والكثير منها تم تلخيصها في وقت لاحق أو التي لوحظت في البشر السريري.

بيان الأخلاق: وافقت لجنة الدراسات الحيوان في جامعة واشنطن جميع الإصابات الماوس والإجراءات كجزء من البروتوكول رقم 20120216، الذي وافق 2013/1/11 وتنتهي 2016/01/11. وكانت الرعاية الشاملة للحيوانات بما يتفق مع دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المجلس الوطني للبحوث ودليل الموارد العناية USDA الحيوان. إجراءات القتل الرحيم تتفق مع "المبادئ التوجيهية اخر احصاء للالقتل الرحيم للحيوانات 2013 طبعة".

1. UPEC بروتوكول UTI، تلقيح إبرة إعداد (الشكل S1)

1. إزالة الغطاء من G 30 إبرة. كاتب الموضوع حوالي 1 بوصة من PE10 أنابيب على رمح من الإبرة. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم المجالس إبرة بين عشية وضحاها. الإبر القثطار يمكن تخزينها لأجل غير مسمى في لوحات بتري معقمة.

2. UPEC البكتيرية اللقاح التحضير

1. إعداد UTI89 اللقاح (تبدأ 72 ساعة قبل قائحيوم نشوئها)
   1. خط UTI89 على أحد LB (لوريا، Bertani) لوحة أجار من الأسهم المجمدة. احتضان ليلا 37 درجة مئوية. اختيار مستعمرة وذلك في تطعيم 10 مل من LB في قارورة 125 مل. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة، بشكل ثابت.
   2. تطعيم 10 ميكرولتر من الثقافة بين عشية وضحاها إلى 10 مل من LB في 125 مل الجديدة قارورة ل24 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية، بشكل ثابت.
   3. نقل 3 مل (سوف تختلف بناء على سلالة والمطلوب حجم اللقاح) لالعقيمة 1.5 مل الأنابيب وأجهزة الطرد المركزي في 7000 x ج لمدة 3 دقائق و resuspend بيليه في برنامج تلفزيوني 1X وأجهزة الطرد المركزي مرة ثانية. resuspend الكرية الجرثومي في 1 مل 1X PBS.
2. قياس الكثافة البصرية البكتيرية وضبط تركيز لكثافة اللقاح المطلوب. تركيز قياسي من اللقاح المستخدم هو 10 ⁷ البكتيريا. ومع ذلك، و يمكن أن يختلف ويرجع ذلك إلى تصميم الدراسة.

3. البكتيرية التلقيح

1. تنظيف محطة عمل مع 70٪ من الإيثانول وجعلى المنطقة مع ورقة ماصة (أو استخدام معقم غطاء تدفق).
2. رسم ما يصل الى 0.9 مل من اللقاح البكتيري مستعد في 1 مل (TB) حقنة (إزالة فقاعات الهواء). نعلق إبرة التطعيم معقمة أعدت مع PE10 أنابيب، على حقنة تحتوي على اللقاح، ثم تقليم sterilely أنابيب البولي ايثيلين.
   ملاحظة: ترك 1 ملم من الأنابيب فوق رأس الإبرة لتجنب ثقب المثانة.
3. قطع 1 بوصة قطعة مربعة من parafilm ووضع لمسة من زيوت التشحيم الجراحية (حوالي حجم فلسا واحدا) على القمة.
4. تخدير إناث الفئران C3H / الدجاجة من خلال وضعها في كوب 32 اوقية (الاونصة) جرة تحتوي على الكرة الشاي المساعد على التحلل مع كرات القطن المنقوعة مع 3 مل من الأيزوفلورين أو غرفة المرذاذ (بعد المصنوعات البروتوكول) حتى أغمي عليه ولكن لا يزال يتنفس بشكل طبيعي (1 التنفس / ثانية) .
   ملاحظة: بعض اللجان IACUC لا يوافقون على استخدام جرة أو المرذاذ. يرجى اتباع دلالة لجنة IACUC من مؤسستكم.
   ملاحظة: إذا عاء زجاجيمع الشاي الكرة و / أو مخروط الأنف مع تستخدم كرات القطن الأيزوفلورين soakd، والحيوان يجب التقيد بعناية لتجنب جرعة زائدة من مخدر والموت. وميزة استخدام غرفة المرذاذ والتخدير هو أنه يوفر إدارة الأيزوفلورين للرقابة التي يتجنب تعاطي جرعات زائدة عرضية. تنبيه: الأيزوفلورين هو مخدر الاستنشاق. استخدام في منطقة جيدة التهوية وتقليل الاستنشاق.
5. إزالة الماوس من جرة / المرذاذ ووضعه على ظهره على منشفة ورقية ونشر الساقين.
6. تغطية الأنف من الفأرة مع مخروط الأنف (أنبوب متصلة المرذاذ التي توفر جرعة تسيطر isoflurance التي تأتي مجهزة على بعض وحدات المرذاذ) أو 50 مل أنبوب مخروطي مع كرة من القطن تحتوي على كمية صغيرة (حوالي 1-2 مل ) من الأيزوفلورين.
7. يخفق بلطف المثانة للحث على التبول وضمان المثانة باطلة. مسح المنطقة حول الإحليل مع الإيثانول بنسبة 100٪ مسح. ربت على التلقيح إبرة / المحاقن، ونقطة البداية، فيزيوت التشحيم الجراحي.
8. تطعيم كل فأر مع 50 ميكرولتر من الحل البكتيريا عن طريق إدخال إبرة التطعيم transurethrally، ما يقرب من 12 ملم، والضغط على أسفل على المكبس حقنة بلطف في صرف اللقاح في المثانة بلطف (10 ميكرولتر / ثانية). إزالة إبرة التطعيم من الماوس.
   ملاحظة: العودة الفورية للاللقاح في فتح مجرى البول عند بداية لتطعيم تشير الإدراج غير لائق أو غير كاملة من الإبرة.
9. إزالة الماوس من مخروط الأنف وإعادته إلى قفصه. كرر الخطوات من 3،3-3،8 لكل الماوس. عندما / إذا تبديل الظروف اللقاح / السلالات، والتخلص من المحاقن والتلقيح الإبرة في وعاء الأدوات الحادة وافق والبدء من جديد خطوة 3.2.
   ملاحظة: التلقيح مع الكائنات uropathogenic عموما لا يسبب أعراض شديدة الألم. ومع ذلك، في حالات نادرة، وإدارة جرعات كبيرة من مسببات الأمراض قد تسبب الحمى، والحد من تناول الغذاء والماء والسلوك الشاذ. Aيجب مراقبة الصحة نيمال في كافة مراحل التجربة. إذا ظهرت أعراض الألم العلنية هي إشعار، مسكن، مثل البوبرينورفين (0،05 حتي 0،1 ملغ / كغ تحت الجلد معين)، ويمكن تطبيقها. وينبغي أن تكون الإجراءات وفقا للIACUC كل مؤسسة.

4. تحديد أعباء البكتيرية

1. إعداد منفصلة 5 مل أنابيب لكل المثانة والكلى الزوج أن تحصد. إضافة 1ml من PBS 1X / أنبوب / الماوس المثانة إلى أن تحصد. إضافة 0.8 مل من برنامج تلفزيوني 1X / أنبوب / زوج من الكلى الماوس لأن تحصد. تسمية كل أنبوب لتتوافق مع ماوس معين. إعداد لوحة 96-جيدا تحتوي على 180 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X في كل بئر ل01:10 التخفيفات التسلسلية.
2. تنظيف منطقة العمل مع الايثانول 70٪ وتغطية المنطقة مع غطاء أو ورقة ماصة منشفة.
3. تخدير الماوس مع isoflurane (انظر الخطوة 3.4) حتى يتوقف الماوس يتنفس لحوالي 1 دقيقة، ثم وضعه على غلاف أو ورقة ماصة منشفة. وسائل أخرى للeuthanaوتقبل سيا أيضا من قبل لجان IACUC، مثل ثاني أكسيد الكربون، ويمكن أن تكون بديلا عن جرعة زائدة الأيزوفلورين.
4. التضحية الماوس عن طريق خلع عنق الرحم السريع الذي يتكون من تقييد الرقبة عند قاعدة الرأس وسحب الذيل أفقيا بعيدا عن الجسم حتى يحدث التفكك.
   ملاحظة: تتطلب معظم اللجان IACUC وسيلة ثانوية للقتل الرحيم وخلع عنق الرحم هو أسلوب شائع. ومع ذلك، وسائل أخرى يمكن استخدامها إذا تمت الموافقة عليها من قبل لجنة IACUC.
5. وضع فأر ميت على ظهرها ورذاذ الايثانول 70٪ على البطن. تشريح الفأر، حصاد المثانة والكلى، في هذا النظام للحد من التلوث المحتمل من الدم بعد تشريح الكلى. وضع أجهزة مستقل في المعدة 5 مل أنابيب تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X (راجع الخطوة 4.1).
   ملاحظة: استخدم مقص مختلفة لتشريح الخارجي وللحصاد الجهاز للحد من التلوث.
6. الاستفادة من أنبوب لضمان الأجهزة هي في تيانه برنامج تلفزيوني 1X. كرر الخطوة 4،3-4،5 لكل الماوس. مقص وملقط في 70٪ من الإيثانول بعد كل فأر نظيفة.

5. البكتيرية الانتعاش

1. التجانس المثانة والكلى تحصد في 5 مل أنابيب مع الخالط الأنسجة، 15 ثانية في الكلى و30 ثانية في المثانة. شطف الخالط بشكل تسلسلي في برنامج تلفزيوني 1X، و 70٪ من الإيثانول و1X PBS بين العينات.
2. جعل المسلسل 01:10 التخفيفات إلى 10 ^-8 وطبق كل تخفيف لCFU (وحدات تشكيل مستعمرة) على لوحات أجار LB. احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل والاعتماد المستعمرات في اليوم التالي.

6. IBC التعداد

1. جو معقم و مطهر إزالة المثانة ووضعه في برنامج تلفزيوني 1X في لوحة 6 جيدا مع قاع السيليكون. لوحات يمكن إعدادها باستخدام مجموعة سيليكون المطاط الصناعي وسكب حوالي 1 سم من السيليكون في كل بئر، انظر بتصنيع التعليمات. قطع المثانة في نصف باستخدام المقص.
2. باستخدام دبابيس معدنية صغيرة وسع بلطف BLADدير بحيث تجويف المثانة تواجه التصاعدي. تأكد من وضع المسامير على حواف الخارجية من الأقسام المثانة لضمان يتعرض كمية ممكنة من الظهارة البولية.
3. بعد التفلطح، وغسل بلطف المثانة مرة واحدة مع 1X PBS. إزالة برنامج تلفزيوني 1X بواسطة الماصة. إصلاح المثانة عن طريق إضافة ما يكفي من 3٪ امتصاص العرق لتغطية المثانة مفلطحة بأكملها. تنبيه: لامتصاص العرق مسبب للسرطان. يجب ارتداء معدات الوقاية المناسبة، بما في ذلك القفازات، في جميع الأوقات. التخلص ينبغي أن يتبع المبادئ التوجيهية المؤسسية.
4. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. إزالة حل لامتصاص العرق. يغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X.
5. تغسل بمحلول غسيل LacZ (2 مم MgCl _2، 0.01٪ deoxycholate الصوديوم و 0.02٪ nonidet-p40in 1X PBS) ثلاث مرات لمدة 5 دقائق لكل يغسل.
6. إزالة محلول الغسيل وإضافة ما يكفي من LacZ وصمة عار (9.5 مل LacZ محلول الغسيل، 0.4 مل 25 ملغ / مل X-غال و 0.1 مل من 100 ملي K-فيروسيانيد / K-فيري سيانيد) لتغطية الخزانات. احتضان عند 30 ° C overniGHT محمية من الضوء.
7. إزالة قربة مفلطحة من الحاضنة ومراقبة الحاويات الوسيطة، والتي تظهر نقاط والزرقاء كما تصور مع نطاق تشريح، 40-60X التكبير.
   ملاحظة: في بعض الأحيان قد ماوس التبول قبل وضع أنبوب تحت الإحليل. في هذه الحالة، انتظر 15-20 دقيقة قبل محاولة جمع البول مرة أخرى.

7. البول كوكتيل لتجرثم كفو التعداد (لا ينطبق على CAUTI)

1. لجمع البول قبل أو إصابة آخر كبح بلطف الماوس من خلال عقد الذيل وضعه على سطح مستو مرتفع (أعلى من الماوس قفص).
2. عقد أنبوب معقم 1.5 مل تحت الإحليل الماوس. اضغط برفق على الجزء الخلفي من الماوس بالقرب من الذيل إلى ممارسة الضغط على المثانة. قبض على البول في الأنبوب 1.5 مل.
3. جعل المسلسل 01:10 التخفيفات إلى 10 ^-7 وطبق كل تخفيف على LB. مناسب احتضان لوحات عند 37 درجة مئوية خلال الليل والاعتماد المستعمرات في اليوم التالي.

8. CAUTI البروتوكول النموذجي، قسطرة إعداد إبر لCAUTI نموذج (الشكل S2)

1. إزالة الغطاء من G 30 إبرة. قطع 7 ملم قطعة من PE10 أنابيب و 5 مم قطعة من أنابيب السيليكون مثل RenaSIL. كاتب الموضوع الإبرة مع PE10 أنابيب حتى يلمس الأنابيب قاعدة الإبرة.
2. ثم إطعام 5 مم قطعة على الإبرة التي تحتوي على PE10. الأشعة فوق البنفسجية تعقيم الإبر المجالس بين عشية وضحاها.
   ملاحظة: عند تحميل أنابيب السيليكون، وترك حوالي 1 ملم من أنابيب تمتد الماضي طرف الإبرة.

9. E. البرازية OG1RF البكتيرية اللقاح التحضير

1. إعداد OG1RF اللقاح تبدأ 48 ساعة قبل يوم التلقيح. خط OG1RF الصعود إلى BHI (الدماغ القلب ضخ) لوحة من الأسهم المجمدة.
2. اختيار مستعمرة وذلك في تطعيم 10 مل من BHI وتنمو بشكل ثابت لمدة 18 ساعة على 37 درجة مئوية. أجهزة الطرد المركزي في الثقافة ويغسل بيليه (3 مرات) في 1 مل حجم العقيمة برنامج تلفزيوني 1X.
3. resuspend الكرية الجرثومي في برنامج تلفزيوني 1X. قياس الكثافة البصرية البكتيرية وضبط تركيز لحجم اللقاح المطلوب. تركيز قياسي من اللقاح المستخدم هو 10 ^7؛ ومع ذلك، و يمكن أن يختلف ويرجع ذلك إلى تصميم الدراسة

10. قسطرة زرع

1. تنظيف محطة عمل مع 70٪ من الإيثانول وتغطية المنطقة مع غطاء ماصة (أو استخدام معقم غطاء تدفق).
2. إرفاق قسطرة إبرة إلى فارغة 1 مل (TB) حقنة. قطع 1 بوصة قطعة مربعة من parafilm ووضع لمسة من زيوت التشحيم الجراحية (حوالي حجم فلسا واحدا) على القمة.
   ملاحظة: يتم استخدام اثنين من الإبر مختلفة لترسب القسطرة وللاللقاح إلى أدنى حد ممكن التلقيح العرضي بسبب التلاعب الميكانيكية اللازمة للقسطرة الزرع. وهذا يسمح أيضا لتوفير الراحة للإعداد أقل إبر التطعيم.
3. تخدير C57BL / 6 الفئران عن طريق وضعها في كوب 32 اوقية (الاونصة) جرة تحتوي على الشايالكرة -infuser مع كرات القطن المنقوعة في 3 مل من الأيزوفلورين أو غرفة المرذاذ (بعد بتصنيع البروتوكول) حتى وعيه ولكن لا يزال يتنفس بشكل طبيعي (1 التنفس / ثانية).
4. ثم وضع الماوس على ظهرها على منشفة ورقية ونشر الساقين. تغطية الأنف من الفأرة مع مخروط الأنف أو 50 مل أنبوب مخروطي مع كرات القطن تحتوي على كمية صغيرة (حوالي 1-2 مل) من الأيزوفلورين.
   تنبيه: الأيزوفلورين هو مخدر الاستنشاق. استخدام في منطقة جيدة التهوية وتقليل استنشاق من قبل الباحث.
5. يخفق بلطف المثانة للحث على التبول وضمان المثانة باطلة. مسح المنطقة حول الإحليل مع الإيثانول بنسبة 100٪ مسح.
6. تطهير المنطقة حول الإحليل مع 10٪ محلول البوفيدون اليود باستخدام قضيب من القطن طرف. ربت على التلقيح إبرة / المحاقن، ونقطة البداية، في مواد التشحيم الجراحي.
   ملاحظة: يتم استخدام Povidine اليود لزرع القسطرة، وهو حل العقيم أقوى من الكحول. يتطلب زرع قسطرةالمزيد من التلاعب الميكانيكية لادخال القسطرة، وبالتالي إمكانية أكبر للتلوث.
7. إدراج قسطرة في فتح مجرى البول. مرة واحدة في، واستخدام الملقط لدفع (7 ملم PE10) قطعة طويلة نحو المثانة، وبالتالي دفع (5 ملم السيليكون) القسطرة الصغيرة وإيداعها في المثانة. إزالة الإبرة، مع 7 مم الأنابيب لا تزال تعلق على الفور.

11. البكتيرية التلقيح

1. متابعة بروتوكول التلقيح البكتيرى في الباب 3، باستخدام اللقاح المحضر من قسم 9. إزالة الماوس من مخروط الأنف وإعادته إلى قفصه

12. في كل مرة نقطة النحر

1. إعداد 5 مل أنابيب لالمثانة والكلى (للأجهزة اتبع الخطوة 4.1) و 1.5 مل إيبندورف أنبوب القسطرة ل. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني 1X إلى 1.5 مل إيبندورف أنبوب للعينات القسطرة
2. اتبع الخطوات 4،3-4،5. تشريح الفأر، حصاد المثانة والكلى والقسطرة، جيش التحرير الشعبى الصينىالوراثة والأنسجة بشكل مستقل إلى 5 مل أنابيب تحتوي على برنامج تلفزيوني 1X والقسطرة في 1.5 مل إيبندورف (راجع الخطوة 12،1).
   ملاحظة: استخدم مقص مختلفة لتشريح الخارجي وللحصاد الجهاز واسترجاع القسطرة للحد من التلوث
3. ثم اتبع الخطوة 4.6.

13. البكتيرية الانتعاش

1. لأجهزة، اتبع الخطوات 5.1 و 5.2. لاسترداد البكتيرية من القسطرة، دوامة في أقصى سرعة لمدة 30 ثانية، يصوتن العينات القسطرة لمدة 5 دقائق باستخدام sonicator الحمام، ثم دوامة في أقصى سرعة لمدة 30 ثانية إضافية.
2. جعل المسلسل 01:10 التخفيفات إلى 10 ^-8 وطبق كل تخفيف لCFU التعداد على لوحات BHI. احتضان لوحات على 37 درجة مئوية خلال الليل والاعتماد المستعمرات في اليوم التالي.

نماذج من داخل المثانة غير معقدة والقسطرة UTI المرتبطة توفر منصات مرنة لتوضيح الآليات الجزيئية المرضية البكتيرية، وتأثير هذه الأمراض على الأنسجة المضيف، وتطوير واختبار نهج جديدة لإدارة هذه العدوى المشتركة والمكلفة. اعتمادا على سلالة الماوس والممرض، التلقيح إينترفسكل يمكن استخدامها لدراسة التفاعلات المضيف الممرض لتوضيح العوامل اللازمة لبدء أو تحوير الحادة (الشكل 1 و 3)، المزمن أو المتكرر (الشكل 2) التهاب المثانة. البيانات هو مبين في الشكل 1 هي تمثيلية من المرحلة الحادة (24 HPI) المسالك البولية الاستعمار من قبل UPEC التهاب المثانة تنميط عزل UTI89 44. بعد التلقيح، ويسمح للالتهابات لتطوير لمدة 24 ساعة وعندها يتم التضحية الفئران والمثانة والكلى النسيج المتجانس. والخليط الأنسجة هي مخفف متسلسلإد ومطلي لتعداد البكتيريا استعمار. يمكن أن تنشأ الاستعمار UPEC المزمن والتهاب المثانة والحفاظ في بعض خطوط الماوس (لا سيما C3H / الدجاجة) في جرعة المعدية وممرض لجهاز البول بطريقة تعتمد. ويعرف التهاب المثانة المزمن كما المستمرة الجرثومية عيار عالية (> 10 4 CFU / مل)، والتهاب المثانة وعيار ارتفاع أعباء المثانة البكتيرية (> 10 4 CFU / المثانة) في التضحية 33. البيانات هو مبين في الشكل 2 هي CFUs التمثيلية التي تحدث 4 أسابيع بعد التلقيح من الفئران C3H / الدجاجة مع 2 × 10 7 CFUs من UTI89. في ظل هذه الظروف التجريبية، 20-50٪ من الفئران المصابة تطوير التهاب المثانة المزمن في حين أن الباقي 50-80٪ من الفئران حل العدوى. وهذه الازدواجية في النتيجة تعتمد على نقطة تفتيش المضيف الممرض الذي قرر داخل HPI 24 الأولى. تفعيل (أو لا) النتائج نقاط التفتيش في توزيع النسقين لوحظ من التتر البكتيرية، والتي تبدأ في إظهار فيالبول في 3 نقطة في البوصة (أيام من العدوى آخر) والمثانة في التضحية 28 نقطة في البوصة (الشكل 2) 33. الفئران الذين لديهم تاريخ من التهاب المثانة المزمن وميالا إلى حد كبير في التهاب المثانة المزمن المتكرر على التحدي بعد يتم مسح العدوى الأولية مع العلاج بالمضادات الحيوية 33. وبالمثل، فإن تاريخ UTI هو أحد عوامل الخطر المعروفة لالتهاب المسالك البولية المتكررة في البشر. وهكذا، وهذا هو النموذج الوحيد المعروف تستخدم لدراسة التسبب في التهاب المسالك البولية المتكررة. عندما النمذجة تجريبيا UTI في الخلفيات الماوس بديلة، من المهم تحديد ما إذا كانت سلالة الفأر هو عرضة لالتهاب المسالك البولية، التهاب المسالك البولية المتكررة أو CAUTI، بالنظر إلى أن بعض السلالات هي أكثر أو أقل مقاومة لتطوير هذه المتلازمات 33.

لقياس إضافية من التهاب المثانة الحاد IBC التعداد. يقتصر تشكيل IBC للخلايا مظلة سطحية متباينة عضال. IBC الكمي هو إجراء بالمعلومات من عبء البكتيرية خلال الكيس الحاديتيس ومستويات عالية من الحاويات الوسيطة ترتبط مع خطر الاصابة التهاب المثانة المزمن 21. تشكيل IBC يحدث إلا في المراحل الحادة من المرض. بعد تقشير الخلايا السطحية مظلة، الحاويات الوسيطة لم تعد الملاحظة. في نموذج UTI C3H / الدجاجة، الحاويات الوسيطة يمكن قياسها 6 ساعات بعد بتلقيح ~ 1 × 10 7 CFU من UTI89 في المثانة transurethrally. ومفلطحة قربة مع المسامير المعدنية على لوحات السيليكون وملطخة للتعبير عن LacZ. LacZ، β غالاكتوزيداز، هو الإنزيم البكتيري أعرب عادة أن يشق الربط بين β الجلاكتوز والسكريات الأخرى. هذا الإنزيم يمكن استخدامها للكشف عن البكتيريا عن طريق توريد X-غال، والتماثلية β-غالاكتوزيد، التي تنتج اللون الأزرق على الانقسام. بعد التلوين، يتم تصوير قربة تحت المجهر تشريح مع الحاويات الوسيطة كما تظهر punctae الزرقاء / نقاط الأرجواني على الظهارة البولية والحاويات الوسيطة يمكن حصرها عن طريق حساب النقاط (الشكل 3A). في حين بلغ عدد IBCS شكلت لكل حيوان يختلف، في C3H / الخلفية الدجاجة في المتوسط ​​~ 50 الحاويات الوسيطة وينظر في المثانة (الشكل 3B). زيادة الحاويات الوسيطة بطريقة تعتمد على الجرعة. عدد الحاويات الوسيطة التي تشكل ما بين UPEC وسلالات خلفية الماوس. على سبيل المثال، في C57BL / 6، وهو اللقاح من ~ 1 × 10 7 UTI89 النتائج في تشكيل عدة مئات من الحاويات الوسيطة في المثانة.

ما وراء المجتمع غير معقدة المكتسبة UTI غرار أعلاه، الرعاية الصحية المرتبطة عدوى المسالك البولية تمثل عبئا كبيرا على نظام الرعاية الصحية. عدوى المسالك البولية تمثل حوالي 40٪ من جميع حالات العدوى المصاحبة للرعاية الصحية، وتصل إلى 95٪ من جميع خدمات الرعاية الصحية المرتبطة عدوى المسالك البولية هي القسطرة المرتبطة 45. نحن هنا يبرهن على وجود نموذج الفأر المثانة زرع من CAUTI التي تمثل نظاما قويا للتحليل التجريبي لهذه المشكلة السريرية الصعبة. البيانات المقدمة في الشكل 4 هي تمثيلية من 24 ساعة العدوى مع نموذج E. البرازية الصورة تدريب OG1RF. عندما 1 × 10 7 CFU من OG1RF يتم تلقيح intravesically إلى المثانة unimplanted، يبدأ العدوى إلى اضحا بنسبة 24 HPI (الشكل 4A) وبنسبة 3 نقطة في البوصة وحل إصابة 41. على العكس، تلقيح OG1RF إلى نتائج زرع المثانة في استعمار كل من القسطرة والمثانة، مع 10 أضعاف أعلى مستويات المثانة الاستعمار في 24 HPI من تلك التي لوحظت في قربة unimplanted (الشكل 4A و 4B). بالإضافة إلى ذلك، يتم الاحتفاظ هذه العدوى في> 10 6 كفو في المثانة حتى فقدان القسطرة حوالي 7 نقطة في البوصة 41. جميع النماذج التجريبية وصفها قابلة للدرجة عالية من المرونة التجريبية، بما في ذلك ولكن ليس حكرا على الطرق المختلفة لتصوير العيانية والمجهرية في الأنسجة والأسطح المصابة، والأحجام اللقاح تغيير والأوقات المرض، العدوى تنافسية، واستضافة التحاليل المناعية .

الشكل 2: 28 يوم المسالك البولية الاستعمار أنثى، 7-8 الاسبوع C3H القديم / الفئران دجاجة تم تلقيح transurethrally مع ~ 2 × 10 7 CFU UTI89. كان البول تتجمع في المشار إليه عدوى أيام آخر (نقطة في البوصة) ومطلي لCFU التعداد. كما يتم عرض تمثيلية المثانة 28 يوما والكلى التتر، ن يرمز = 8. البول كفو الحد الأدنى من الكشف (1000 خلية / مل) من خلال خط متقطع. تمثيلا خط منقطنهاية الخبر الحد الأنسجة أقل من الكشف، 20 CFU / الأنسجة.

الرقم 3: IBC تعداد أنثى، 7-8 الاسبوع C3H القديم / الفئران دجاجة تم تلقيح transurethrally مع ~ 1 × 10 7 CFU UTI89. تم حصاد قربة 6 HPI ومفلطحة لIBC تلطيخ. (A) صورة المثانة مفلطحة بعد LacZ تلطيخ. يتم تمثيل الحاويات الوسيطة كنقاط الزرقاء. الصورة أقحم هو التكبير الرقمي للقسم من الصورة في مربع أسود. (B) أرقام التمثيلية للالحاويات الوسيطة التي تشكلت في الفئران C3H / الدجاجة 6 HPI، ن = 10.

الرقم 4: E. البرازية المرتبطة القسطرة UTI. C57BL / تم تلقيح 6 الفئران مع أو بدون القسطرة مع ~ 1 × 10 7 CFU لل (A) E. البرازية الاستعمار المثانة في وجود أو عدم وجود القسطرة. (B) E. البرازية القسطرة الاستعمار. وقد استخدم مان ويتني U اختبار للتجارب الماوس، اعتبر p <0.05 دلالة إحصائية. **، p <0.005.

الرقم S1: UTI إعداد التلقيح إبرة يعرض مخطط التلقيح خطوات إعداد إبرة بما في ذلك المواد اللازمة (1)، خيوط من القسطرة إلى إبرة (2) وتقليم الأنبوب قبل التلقيح (3).

الرقم S2: CAUTI إعداد التلقيح إبرة يعرض رسم بياني إعداد المواد التلقيح إبرة الحاجة (1)، خيوط للقسطرة التلقيح (2) وغرس قسطرة فيإلى الإبرة (3).

تعلن الكتاب أنه ليس لديهم المصالح المالية المتنافسة.