يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة

10.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/52912

⸱

يوليو 3, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Radiological Protection Research and Instrumentation, Canadian Nuclear Laboratories

في هذه المقالة

ملخص

بروتوكول لتقييم التغيرات في مستويات تلف الحمض النووي وقدرة إصلاح الحمض النووي التي قد تكون ناجمة عن تشعيع الجرعة المنخفضة المزمن في الجسم الحي في الخلايا الليمفاوية في طحال الفأر ، عن طريق قياس هيستون H2AX الفسفوري ، وهو علامة على فواصل الحمض النووي المزدوج ، باستخدام قياس التدفق الخلوي.

الملخص

انخفاض جرعة التعرض للإشعاع قد تنتج مجموعة متنوعة من الآثار البيولوجية التي تختلف في كمية ونوعية من الآثار التي تنتجها جرعات عالية من الإشعاع. معالجة المسائل المتعلقة بالسلامة والصحة البيئية والمهنية والعامة بطريقة سليمة ومبررة علميا يعتمد بشكل كبير على القدرة على قياس دقيق لآثار البيولوجية للملوثات جرعة منخفضة، مثل المؤينة المواد الإشعاعية والكيميائية. الضرر وإصلاح الحمض النووي هي مؤشرات مبكرة أهم المخاطر الصحية بسبب العواقب على المدى الطويل المحتملة، مثل السرطان. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة تأثير التعرض المزمن في الجسم الحي لجرعات منخفضة من γ- وβ-الإشعاع على الحمض النووي من التلف وإصلاح في خلايا الطحال الماوس. باستخدام علامة مقبولة عموما من الحمض النووي الكسر مزدوج الحبل، مفسفر H2AX هيستون دعا γH2AX، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدامها لتقييم ليس فقط على مستوى الحمض النووي من التلف، ولكن التغييرات أيضافي قدرة إصلاح الحمض النووي المنتجة يحتمل بجرعة منخفضة في التعرض الجسم الحي. التدفق الخلوي يسمح قياس سريعة ودقيقة وموثوق بها من المسمى immunofluorescently γH2AX في عدد كبير من العينات. يمكن تقييم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر من خلال تعريض splenocytes استخراج إلى جرعة الصعبة من 2 غراي لإنتاج عدد كاف من DNA فواصل لتحريك إصلاح وعن طريق قياس يسببها (1 ساعة بعد التشعيع) والحمض النووي من التلف المتبقية (24 ساعة بعد التشعيع). أن الحمض النووي من التلف المتبقي يكون مؤشرا على إصلاح ناقصة وخطر عدم الاستقرار الجيني على المدى الطويل والسرطان. جنبا إلى جنب مع فحوصات أخرى ونقطة النهاية التي يمكن بسهولة أن يقاس في مثل هذه الدراسات المجراة (على سبيل المثال، التشوهات الكروموسومية، ترددات النويات في الشبكيات نخاع العظام، والتعبير الجيني، وما إلى ذلك)، وهذا النهج يتيح إجراء تقييم دقيق والسياقية للآثار البيولوجية من الضغوطات مستوى منخفض.

المقدمة

جدل كبير بشأن الآثار الضارة المحتملة من تناول جرعات منخفضة أو منخفضة جدا من الإشعاع والخوف الجمهور من الإشعاع، مدفوعا صورا للتفجيرات الذرية هيروشيما وناغازاكي والنادرة الحوادث محطة نووية المؤينة (التي تفاقمت بسبب وسائل الإعلام)، قد أدى إلى غاية تنظيم الحماية من الإشعاع الصارم والمعايير التي يمكن أن تكون غير مبررة علميا. في العقود الثلاثة الماضية، وقد وثقت تقارير عديدة سواء لعدم وجود ضارة وجود الآثار البيولوجية يمكن أن تكون مفيدة الناجمة عن الإشعاع جرعة منخفضة 1-4. عوامل الخطر الصحية للإشعاع الرئيسي هو احتمال السرطان، تقديرها بناء على دراسات وبائية من الناجين من القنبلة الذرية تلقي جرعات عالية أو متوسطة من الإشعاع. يستخدم الخطية استقراء هذه البيانات (ما يسمى خطية أي عتبة أو نموذج LNT) لتقدير مخاطر الإصابة بسرطان بجرعات منخفضة. ومع ذلك، لم تتلق هذا النهج القبول العلمي على مستوى العالموناقش بشكل كبير 5.

ومن الواضح أن هناك حاجة لمزيد من الدراسات لتوضيح هذه المسألة، وربما تحسين مستويات الحماية من الإشعاع. وينبغي أن تشمل هذه الدراسات العلاجات المزمنة (أفضل تقريب التعرض للعوامل البيئية والمهنية)، في النماذج الحيوانية الجسم الحي (أفضل لاستقراء آثار للإنسان) وهذه النقاط النهائية عن معدلات الحمض النووي من التلف، وإصلاح الحمض النووي والطفرات. ومن المعروف أن الحمض النووي هو الهدف الرئيسي لإتلاف آثار الإشعاع وغير مكتملة أو سوء إصلاح قد يؤدي إلى الطفرات والسرطان تطوير 6.

DNA الكسر مزدوج الحبل (DSB) هي واحدة من أكثر أنواع ضارة من آفات الحمض النووي وربما تؤدي إلى موت الخلايا وتكون الأورام 7. ولذلك، من المهم أن تكون قادرة على موثوق ودقيق قياس مستوى DSB بعد التعرض لجرعة منخفضة من الإشعاع و / أو غيرها من الإجهاد، مثل الملوثات الكيميائية. واحدة من علامات الأكثر حساسية ومحددةمن الحمض النووي DSB غير فسفرته هيستون H2AX، ودعا γH2AX 8، ولكن قد اقترحت علامات وغيرها من الأساليب 9،10. وتشير التقديرات إلى أن الآلاف من جزيئات H2AX، في المنطقة المجاورة لجهاز تسوية المنازعات التي يسببها، ويشارك في تشكيل γH2AX تمكين الكشف عن الفردية DSB التي وصفها مناعي مع مضاد للγH2AX الأجسام المضادة ومضان المجهر 11. كانت الاستجابة سريعة جدا، حيث بلغ حده الأقصى بين 30 و 60 دقيقة. يوجد دليل على أن γH2AX يسهل إصلاح الحمض النووي DSB من خلال جذب عوامل تصليح أخرى إلى مواقع فواصل، وتعديل هيكل لونين لترسيخ نهايات الحمض النووي مكسورة وتوفير إمكانية الوصول للبروتينات تصليح أخرى (إعادة النظر في 12). عند الانتهاء من إصلاح الحمض النووي DSB، ويحصل على γH2AX إلغاء فسفرته و / أو يخضع لتدهور، والجزيئات H2AX مركبة جديدة تحل محل γH2AX في المناطق المتضررة من لونين 10. رصد تشكيل وفقدان γH2AX يمكن،لذلك، تقديم تقدير دقيق للDNA DSB حركية الإصلاح. وقد استخدم هذا النهج لدراسة إصلاح جهاز تسوية المنازعات في مختلف خطوط الخلايا السرطانية البشرية المشع مع جرعات عالية من الإشعاع ومعدل ومستويات DSB المتبقية وقد ثبت للربط مع حساسية للأشعة 13-15.

نحن تعديل هذا المنهج التجريبي وتطبيقه على دراسة الماوس في الجسم الحي لدراسة آثار الجرعات المنخفضة من γ- المزمنة وβ-التشعيع على مستويات الحمض النووي DSB و إصلاحها (الشكل 1). أولا، علينا أن نظهر وسيلة لإجراء التعرض على المدى الطويل المزمن من الفئران إلى β-الإشعاعات المنبعثة إما عن طريق التريتيوم (هيدروجين 3) في شكل الماء معالج بالتريتيوم (HTO) أو التريتيوم ملزمة عضويا (OBT) الذائب في مياه الشرب . ومن المتوقع أن تتراكم و / أو توزيع مختلف في الجسم، وبالتالي، تنتج تأثيرات بيولوجية مختلفة الأشكال اثنين. كلا الشكلين هي الأخطار المحتملة في الصناعة النووية. هذا العلاجيقابل من جانب التعرض المزمن للγ للإشعاع بمعدل جرعة مكافئة للسماح مقارنة الصحيحة من أنواع الإشعاع اثنين، وهو أمر حاسم لتقييم فعالية البيولوجية النسبية. يتكون بيتا للإشعاع من إلكترونات، مما يجعلها تختلف كثيرا عن γ للإشعاع، الفوتونات ذات الطاقة العالية. ونتيجة لهذا الاختلاف، Β للإشعاع يمثل خطرا على الصحة في الغالب الداخلي وربما يكون لها آثار بيولوجية مختلفة مقارنة γ للإشعاع. وأسفرت هذه المضاعفات في خلافات كبيرة على تنظيم التعرض لβ-الاشعاع المنبعث من HTO. وهكذا، ومستويات تنظيمية من HTO في المياه الصالحة للشرب للجمهور تختلف من 100 بيكريل / L في أوروبا إلى 75000 بيكريل / L في أستراليا. ولذلك، من المهم للمقارنة التأثيرات البيولوجية للHTO لجرعات يعادل γ للإشعاع. ثانيا، يتم قياس معدل الحمض النووي DSB في splenocytes معزولة عند الانتهاء من التعرض المزمن باستخدام المسمى immunofluorescently γH2AX كشفإد التدفق الخلوي. وهذا يسمح للتقييم مدى التلف في الحمض النووي من قبل في الجسم الحي التعرض الواقع. ومع ذلك، فمن المنطقي أن نتوقع أن مثل هذه التعرضات مستوى منخفض قد لا ينتج أي نسب ملحوظة من الحمض النووي DSB. بدلا من ذلك، بعض التغييرات الخفية / قد يكون من المتوقع من شأنها أن تؤثر على قدرة الخلايا على إصلاح الحمض النووي من التلف الردود. هذه التغيرات، إذا وجدت، قد تكون إما المحفزة (تنتج تأثير مفيد) أو المثبطة (إحداث تأثير ضار). البروتوكول المقترح يسمح تكشف هذه التغيرات من خلال تحدي splenocytes المستخرجة مع جرعة عالية من الإشعاع التي تنتج قدرا كبيرا من الضرر (على سبيل المثال، 2 غراي إنتاج ما يقرب من 50 DNA جهاز تسوية المنازعات في خلية أو 3 - زيادة بنسبة 5 أضعاف في المستوى الإجمالي γH2AX) . وفي وقت لاحق، وتشكيل وفقدان γH2AX، مما يعكس بدء والانتهاء من إصلاح جهاز تسوية المنازعات، ويتم رصد التدفق الخلوي. بهذه الطريقة، ليس فقط القاعدية والمستويات التي يسببها العلاج من الحمض النووي DSB يمكن قياسها، ولكنأيضا تأثيره المحتمل على قدرة الخلايا على الاستجابة وإصلاح الحمض النووي من التلف الناجم عن مستويات الإجهاد أعلى من ذلك بكثير.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وينبغي لجميع إجراءات التعامل مع والعلاج الماوس الالتزام بالقواعد التي وضعتها برامج التشريعية و / أو رعاية الحيوان والتي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المحلية. تم تنفيذ جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوان المحلية.

تنبيه: كل عمل مع النشاط الإشعاعي (بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على التعامل مع التريتيوم، الخارجي γ-التشعيع، والتعامل مع الأنسجة الحيوانية المشعة والنفايات الفراش) يجب أن تلتزم القواعد المنصوص عليها من قبل السلطات التشريعية و / أو الحماية من الإشعاع وأن يقوم بها أذن الموظفين في مختبر معتمد و / أو المرفق.

1. العمل الحيوان

  1. التجمع الحيوان
    1. إذا الفئران يصلون من مؤسسة خارجية، تأقلم الحيوانات لمدة 10 يوما على الأقل في منشأة الحيوان. إذا تضمنت الدراسة مجموعة العلاج متعددة، تأكد من أن المورد الحيوان يمكن أن ترسل آلالحيوانات لتر كما دفعة واحدة.
    2. عشوائيا تخصيص الفئران إلى مجموعات العلاج من 10 الفئران في المجموعة. في حالة استخدام ذكور الفئران من سلالة C57BL / 6، لدينا المورد الحيوان قبل ترتيب العشوائي من C57BL صغيرة جدا / 6 ذكور في تسهيلهم للتخفيف من قضايا العدوان.
  2. التعرض المزمن من الفئران إلى داخلي β-الإشعاع
    1. إعداد تركيزات العمل من التريتيوم (10 كيلو بيكيريل / L و 1 من mbq / L) في الماوس مياه الشرب عن طريق تمييع المخزون الأصلي من HTO وOBT (خليط من البرولين معالج بالتريتيوم، ألانين والأحماض الأمينية الجلايسين) الحلول.
    2. التحقق من صحة تركيزات النهائي من التريتيوم في مياه الشرب من خلال قياس النشاط الإشعاعي باستخدام عداد التلألؤ السائل. ضبط تركيز، إذا لزم الأمر.
    3. علاج الحيوانات لمدة شهر واحد من خلال توفير بالمال وبالشهرة أيضا وصول الإعلان إلى الماء التريتيوم. إذا وصل الماء إلى العلاج منخفضة خلال فترة أسبوعين، إضافة المزيد من الماء. خلاف ذلك، تغيير الزجاجات على أسبوعين.
    4. علاج الشام المشع السيطرةالفئران مماثل. الاحتفاظ بها في غرفة منفصلة "نظيفة" أو على رف منفصل "نظيف" تحت ضغط الهواء الإيجابي لتجنب التريتيوم انتقال التلوث من الجو.
  3. التعرض المزمن من الفئران لالخارجي γ من الإشعاع
    ملاحظة: مرفق γ-تشعيع / المعدات تختلف تبعا للموقع.
  4. باستخدام الوسائل المتاحة من قياس الجرعات، وتحديد المسافات من مصدر γ للإشعاع التي تحتوي على حقول الإشعاع إنتاج معدلات الجرعة المطلوبة. ضمان تجانس مجالات الإشعاع داخل المناطق التي تغطي أقفاص الحيوانات.
    ملاحظة: 1.7 μGy / ساعة، أي ما يعادل نسبة الجرعة التي تنتجها 1 من mbq / L التريتيوم في الجسم.
  5. تعرض الفئران عن طريق وضع أقفاص الماوس على مسافات تحديدها في الخطوة 1.3.1 لمدة شهر واحد. تقليل انقطاع يومي للγ-التشعيع لمدة 30 دقيقة. استخدام مقاييس الجرعات معان بالحرارة لقياس مجموع الجرعات الممتصة.

2. التضحيات وأخذ العينات

  • إعداد الأدوات الجراحية المعقمة، 60 مم أطباق بتري مع إدراج مصافى خلية 70 ميكرون، 15 مل و 1.5 مل أنابيب، ووسائل الإعلام RPMI تستكمل مع المصل 5٪ بقري جنيني (FBS) ومكان كل ما في خزانة السلامة البيولوجية. ضمان عقم العمل أمر بالغ الأهمية.
  • الاستغناء عن 5 مل من وسائل الاعلام RPMI في كل 60 مم طبق بتري.
  • التضحية الفئران باستخدام أسلوب معتمد من قبل لجنة رعاية الحيوان المحلية. خلع عنق الرحم هو خيار جيد للعمل خلية طحالية الموصوفة في هذا البروتوكول. ومع ذلك، إذا كانت هناك حاجة عينات الدم لفحوصات أخرى (على سبيل المثال، لmFISH، والنواة الصغرى كتلة مثبط حركة الخلايا أو غيرها من المقايسات genetoxicity شيوعا)، واستخدام ثقب داخل القلب بعد التخدير مع isoflurane.
  • وضع الحيوان في الاستلقاء الظهري، مع رئيس لافتا بعيدا عنك. رش الماوس لأسفل مع الايثانول 70٪. باستخدام ملقط، والاستيلاء على الجلد الأمامية لفتح مجرى البول وإجراء شق صغير مع مقص في منطقة العجان.
  • من هذا الشق، وقطع على طول خط الوسط بطني إلى تجويف الصدر، والحرص على قطع فقط الجلد وليس الجدار العضلي تحتها. تشريح الجلد بعيدا عن خط الوسط.
  • فهم جدار البطن مع ملقط وقطع على طول محور وسيطة من الجدار العضلي لفتح تجويف البطن.
  • استئصال الطحال تجتاح بخفة مع ملقط معقم وبلطف سحب على أنه في حين خفض في وقت واحد بعيدا عن النسيج الضام مع مقص.
  • قطع قطعة صغيرة من الطحال (حوالي 1/10 من الطحال) ووضعها في أنبوب 1.5 مل. المفاجئة تجميد في النيتروجين السائل لتخزين اللاحق في -80 ° C لفحوصات تكميلية.
  • وضع ما تبقى من الطحال إلى مصفاة الخلية داخل طبق بتري 60 ملم مع 5 مل من وسائل الإعلام الاستغناء قبل RPMI.
  • انتقل إلى الماوس المقبل.
    يمكن الاحتفاظ المستخلصة والطحال في 60 ملم الأطباق مع وسائل الإعلام (لمدة تصل إلى 2 ساعة) في حين أن بقية الفئران هي التضحيه: مذكرةأد. اعتمادا على عدد من الناس المشاركة، ما بين 5 و 15 الفئران يمكن معالجتها في يوم واحد.

    • 3. التحضير للثقافات خلية طحالية

    1. التجانس الطحال تنميق داخل مصفاة الخلية مع ملقط معقم مع نهاية منحنية.
    2. إزالة مصفاة الخلية وجمع تعليق خلية تصفيتها من 60 مم طبق في أنبوب 15 مل.
    3. شطف مصفاة الخلية مع 5 مل من وسائل الإعلام لجمع ما تبقى من الخلايا.
    4. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    5. طاف صب وإعادة تعليق بيليه في 10 مل من RPMI.
    6. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على RT.
    7. طاف صب وإعادة تعليق بيليه في 5 مل من RPMI.
    8. نقل 4 مل من التعليق الخلية إلى ثقافة قارورة 25 مل الأنسجة وإزالة لحاضنة CO 2 (37 ° C، 5٪ CO 2، الرطوبة 80٪)

    4. تحدي الإشعاع وإصلاح

    1. نقلالمتبقية 1 مل من تعليق الخلية من الخطوة 3.8 في أنبوب 1.5 مل على الجليد وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. والحمض النووي من التلف تقاس في هذه العينة تمثل كل من الأضرار التي يسببها العلاج ور = 0 بيانات نقطة لبناء منحنى إصلاح الحمض النووي.
    2. نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS العازلة (20 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 150 مم كلوريد الصوديوم، و 2.7 ملي بوكل).
    3. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 300 ميكرولتر من TBS.
    4. في حين أن الاختلاط في دوامة في سرعة منخفضة، إضافة 700 ميكرولتر من -20 ° C الإيثانول بنسبة 100٪. إغلاق الغطاء وعكس عدة مرات لخلط.
    5. تخزين العينات في -20 ° C. Splenocytes ثابتة في الإيثانول يمكن تخزينها في -20 درجة مئوية لمدة 12 شهرا على الأقل بدون أي خسارة ملحوظة في إشارة γH2AX.
    6. أشرق الثقافات خلية طحالية من الخطوة 3.8 مع تحديا γ-راد جرعة ينتقم من 2 غراي في ≥ معدل الجرعة 200 mGy / دقيقة باستخدام جهاز تشعيع المتاحة.
      ملاحظة: إن الغرض من هذا الإشعاع هو للحث على الحمض النووي DSB للطعن في آلية إصلاح. ويمكن أيضا الأشعة السينية يمكن استخدامها لهذا الغرض.
    7. العودة فورا الثقافات إلى CO 2 الحاضنة.
    8. 1 ساعة بعد التحدي 2 غراي التشعيع، وإزالة الثقافات من الحاضنة لمجلس الوزراء السلامة البيولوجية. لجمع عينة تمثيلية قسامة، بلطف اعادة تعليق الخلايا باستخدام pipettor ونقل 1 مل من تعليق خلية إلى أنبوب 1.5 مل على الجليد. العودة الثقافات الخلية إلى CO 2 الحاضنة.
    9. أنابيب الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. نضح بعناية طاف باستخدام مضخة فراغ. بلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS.
    10. كرر الخطوات من 4،3-4،5.
    11. 24 ساعة بعد التحدي 2 غراي γ-التشعيع، والحصاد وإصلاح في = 24 ساعة العينة كما هو موضح في الخطوة 4،8-4،10.
    TLE "> 5. مناعي وصفها مع لمكافحة γH2AX جسم

    ملاحظة: عادة، 15-30 عينات يوميا يمكن أن توصف immunofluorescently ويعاير بواسطة التدفق الخلوي في شوط واحد. لضمان إجراء مقارنة دقيقة بين مجموعات العلاج، وتشمل العينة (ق) من كل مجموعة. انظر أيضا مرجع 16 لمزيد من التفاصيل.

    1. إعداد مجموعة المسمى أنابيب لعدد من العينات التي سيتم تجهيزها ومكان على الجليد. استخدام 12 × 75 ملم أنابيب زجاجية لم يسبق لهم اللعب. غير مطلوب العقم لهذا العمل. وتشمل العينة الضابطة واحدة إضافية تاريخية لوضع العلامات مع الأجسام المضادة الثانوية فقط ("2 أب فقط"). استخدام هذه العينة السيطرة التاريخية في كل التدفق الخلوي تشغيل ضمن دراسة.
    2. إضافة 0.5 مل من TBS الجليد الباردة إلى كل أنبوب.
    3. إزالة splenocytes الثابتة من -20 ° C، دوامة لمدة 5 ثوانى ونقل 0.5 مل قسامة إلى أنابيب مستعدة مع TBS. وضع ما تبقى من عينات مرة أخرى إلى -20 ° C تخزين والحفاظ على عينة احتياطية.
    4. splenocytes أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من الجليد الباردة TBS تحتوي على 1٪ FBS
    5. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من تجارة الرقيق عبر الأطلسي العازلة (0.05٪ تريتون X-100، 2٪ FBS في TBS). احتضان لمدة 20 دقيقة على الجليد.
    6. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من الابتدائي مكافحة γH2AX الأجسام المضادة المخفف 1: 150 العازلة في تجارة الرقيق عبر الأطلسي. استخدام 200 ميكرولتر من تجارة الرقيق عبر الأطلسي ل"2 أب فقط" العينة الضابطة.
    7. أنابيب موقف على شاكر الدورية في زاوية من 45 - 60 درجة ويهز لمدة 1.5 ساعة عند 300 x ج في RT.
    8. في حين أنابيب تحتضن، وإعداد حجم كاف (200 ميكرولتر / عينة) من الماعز لمكافحة فأر الضد الثانوية مترافق مع اليكسا-488 في 1: 200 التخفيف العازلة في تجارة الرقيق عبر الأطلسي.
      ملاحظة: كل عمل يستدعي اليكسا-488وينبغي أن يتم الضد مترافق (الخطوات 5،10-5،16 أدناه) في ظل ظروف الإضاءة الخافتة ويجب حماية العينات وصفت من الضوء من خلال التفاف الأنابيب في رقائق الألومنيوم.
    9. وبمجرد الانتهاء من 1.5 ساعة الحضانة، إضافة 1 مل من TBS الجليد الباردة التي تحتوي على 2٪ FBS إلى كل أنبوب وأجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق على 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS تحتوي على 2٪ FBS.
    10. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 200 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية من الخطوة 5.8.
    11. احتضان العينات على منصة تهتز لمدة 1 ساعة كما في الخطوة 5.7.
    12. إضافة 1 مل من TBS الجليد الباردة التي تحتوي على 1٪ FBS.
    13. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 1 مل من TBS الجليد الباردة.
    14. أجهزة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. صب طاف وبلطف اعادة تعليق بيليه في 0.5 مل من TBS تحتوي على 50 ميكروغرام / مليوديد propidium.
    15. احتضان لمدة 5 دقائق على RT محمية من الضوء.
    16. تحليل العينات على تدفق عداد الكريات باستخدام بروتوكولات أداة محددة 16. قراءة لا يقل عن 10،000 الخلايا لكل عينة.

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    النتائج

    ويبين الشكل 2 أمثلة من التدفق الخلوي الرسوم البيانية المتوقعة لsplenocytes أعدت باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. هي بوابات الخلايا أولا على أساس <الإلكترونية مبعثر الجانب حجم> مؤامرة مبعثر (الشكل 2A و 2D، حجم الإلكترونية ما يعادل مبعثر إلى الأمام). FL3 / propidium رسوم بيانية اليود (الشكل 2B و2E) تؤكد العادي توزيع دورة الخلية. يعني إشارة γH2AX حسابها باستخدام قناة FL1 يؤكد زيادة> 2 أضعاف في الحمض النووي DSB...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المناقشة

    بروتوكول الواردة في هذه الورقة هو مفيد لإجراء الماوس على نطاق واسع في الدراسات المجراة دراسة الآثار السامة للجينات من مستويات منخفضة من مختلف العوامل الكيميائية والفيزيائية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة. منشأتنا الحيوانات خالية من مسببات الأمراض محدد فريدة من نوعها مجهزة GammaBeam 150 irradiator و30 متر قاعة التشعيع طويلة تسمح بإجراء الدراسات مدى الحياة التي تنطوي على irradiations معدل جرعة منخفضة أو منخفضة جدا على مئات أو حتى آلاف من الفئران. يمكن تعيين مرافق أش...

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    الإفصاحات

    يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية متنافسة معروفة.

    شكر وتقدير

    يود المؤلفان أن يعرب عن تقديرهما لمساهمة زملائنا ساندرين روش لوفيفر وإريك غريغوار من معهد الحماية الإشعاعية والسلامة النووية (باريس، فرنسا). ودعم هذا العمل برنامج العلم والتكنولوجيا التابع لحكومة كندا في المختبرات النووية الكندية (نهر تشالك ، أونتاريو ، كندا) ، ومجموعة مالكي CANDU (تورنتو ، أونتاريو ، كندا) ، ولجنة السلامة النووية الكندية ، ومعهد الحماية الإشعاعية والسلامة النووية (باريس ، فرنسا).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    المواد

    قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
    الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
    HTO: ماء متراهي ، [3H]يتم الحصول عليه محليا من مفاعل نووي   ؛نشاط المخزون 3.7 جيجابايت / مللي لرغونفي ؛ يمكن استبداله ب HTO من Perkin Elmer
    OBT: Alanine ، L- [3-3H]: التريتيوم المرتبط عضويا (OBT) بيركينإلمرNET348005MC1 ملي سي / مل (185 ميجابايت في المل
    OBT: الجلايسين ، [2-3 ساعات]: تريتيوم مرتبط عضويابيركين إلمرNET004005MC1 ملي سي / مل (185 ميجابايت في المq)
    OBT: البرولين ، L- [2،3-3 ساعة]: التريتيوم المرتبط عضويا (OBT) بيركينإلمرNET323005MC1 ملي Ci / مل (185 ميجابايت في مليون)
    ماء متريت ، [3 ساعات] (HTO)بيركين إلمرNET001B005MCبديل ل HTO من أصل محلي   ؛  
    GammaBeam 150 irradioللطاقة الذرية الكندية المحدودةالمصنعة محليابمصدر إشعاع g آخر ذو نشاط منخفض بما فيه الكفاية  
    Tween-20Sigma AldrichP1379-500ML
    RPMIFisher ScientificSH3025501Hyclone RPMI 1640 مع L-Glutamine و HEPES 500 مل
    مصل الأبقار الجنينيSigma AldrichF1051-100ML
    الأجسام المضادة ل gH2AX ، استنساخ JBW301Millipore05-636
    Alexa fluor-488 الماعز المضاد للأجسام المضادة للفأرLife Technologies (سابقا Invitrogen)A21121
    بروبيديوم اليودسيجما ألدريتشP4864-10ML1 مجم / مل
    الإيثانولالكحول التجاريP006-EAANزجاجات 500 مل أنابيب الإيثانول المطلق
    1.5 ملأنابيب فيشر Scientific2682550الطرد المركزي
    الدقيقة 15 مل أنابيبفيشر ساينتفيك05-539-5أنابيب طرد مركزي بولي بروبيلين معقمة
    النيتروجين السائلLindeP110403
    12 × 75 مم أنابيب زجاجية غيرفيشر ساينتفيكK60B1496126أنابيب زجاجية من البورسليكات يمكن التخلص منها مع نهاية عادية
    T25 قواريرVWRCA15708-120nunc tisue ثقافة 25 مل قارورة (رقم المورد 156340)
    مقصالعلوم الدقيقة14068-12مقص فاغنر 12 سم ملقط حاد / حاد
    ، أدوات العلوم الدقيقةالمستقيمة 11008-13ملقط سيمكين 13 سم ،
    ملقط مستقيم ، أدواتالعلوم الدقيقة11003-12ملقط نمط ضيق 12 سم ، أطباق بتري منحنية
    60 ممVWRCA25382-100BD طبق زراعة أنسجة الصقر 60 × 15 مم
    مصافي خلايا ، 70 ممفيشر ساينتفيك08-771-2مصافي خلايا الصقر 50 / علبة
    وصفة PBS: 1 قرص مذاب في 200 مل من الماء منزوع الأيونات ، اضبط درجة الحموضة على 7.4 إذا لزم الأمر.Sigma AldrichP4417-100TABأقراص ملحية مخزنة بالفوسفات وصفة
    TBS: لعمل 10x مخزون
    30 جم TRIS HClSigma AldrichT3253-1KGTrizma hydrochloride
    88 جم كلوريد الصوديوم NaClFisher ScientificS271-500كلوريد الصوديوم
    2 جم KClFisher ScientificP217-500كلوريد
    البوتاسيومقم بإذابة 1 لتر من الماء منزوع الأيونات ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4
    )يمكن استبدال أجهزة مغطاة أدوات المنحنية

    المراجع

    1. Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
    2. Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res. 138 (Suppl 1), S9-12 (1994).
    3. Wiencke, J. K., Afzal, V., Olivieri, G., Wolff, S. Evidence that the [3H]thymidine-induced adaptive response of human lymphocytes to subsequent doses of X-rays involves the induction of a chromosomal repair mechanism). Mutagenesis. 1 (5), 375-380 (1986).
    4. Mitchel, R. E. The dose window for radiation-induced protective adaptive responses. Dose-Response. 8 (2), 192-208 (2010).
    5. Tubiana, M., Feinendegen, L. E., Yang, C., Kaminski, J. M. The linear no-threshold relationship is inconsistent with radiation biologic and experimental data. Radiology. 251 (1), 13-22 (2009).
    6. Gent, D. C., Hoeijmakers, J. H., Kanaar, R. Chromosomal stability and the DNA double-stranded break connection. Nat Rev Genet. 2 (3), 196-206 (2001).
    7. Jackson, S. P. Sensing and repairing DNA double-strand breaks. Carcinogenesis. 23 (5), 687-696 (2002).
    8. Rogakou, E. P., Pilch, D. R., Orr, A. H., Ivanova, V. S., Bonner, W. M. DNA double-stranded breaks induce histone H2AX phosphorylation on serine 139. J Biol Chem. 273 (10), 5858-5868 (1998).
    9. Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks. J Cell Biol. 151 (7), 1381-1390 (2000).
    10. Kinner, A., Wu, W., Staudt, C., Iliakis, G. Gamma-H2AX in recognition and signaling of DNA double-strand breaks in the context of chromatin. Nucleic Acids Res. 36 (17), 5678-5694 (2008).
    11. Sedelnikova, O. A., Rogakou, E. P., Panyutin, I. G., Bonner, W. M. Quantitative detection of (125)IdU-induced DNA double-strand breaks with gamma-H2AX antibody. Radiat Res. 158 (4), 486-492 (2002).
    12. Yuan, J., Adamski, R., Chen, J. Focus on histone variant H2AX: to be or not to be. FEBS Lett. 584 (17), 3717-3724 (2010).
    13. Taneja, N., et al. Histone H2AX phosphorylation as a predictor of radiosensitivity and target for radiotherapy. J Biol Chem. 279 (3), 2273-2280 (2004).
    14. Olive, P. L., Banath, J. P., Sinnott, L. T. Phosphorylated histone H2AX in spheroids, tumors, and tissues of mice exposed to etoposide and 3-amino-1,2,4-benzotriazine-1,3-dioxide. Cancer Res. 64 (15), 5363-5369 (2004).
    15. Banath, J. P., Klokov, D., MacPhail, S. H., Banuelos, C. A., Olive, P. L. Residual gammaH2AX foci as an indication of lethal DNA lesions. BMC Cancer. 10, 4(2010).
    16. Blimkie, M. S., Fung, L. C., Petoukhov, E. S., Girard, C., Klokov, D. Repair of DNA double-strand breaks is not modulated by low-dose gamma radiation in C57BL/6J mice. Radiat Res. 1815 (5), 548-559 (2014).
    17. Runge, R., et al. Fully automated interpretation of ionizing radiation-induced gammaH2AX foci by the novel pattern recognition system AKLIDES(R). Int J Radiat Biol. 88 (5), 439-447 (2012).
    18. Jucha, A., et al. FociCounter: A freely available PC programme for quantitative and qualitative analysis of gamma-H2AX foci. Mutat Res. 696 (1), 16-20 (2010).
    19. Garty, G., et al. The RABIT: a rapid automated biodosimetry tool for radiological triage. Health Phys. 98 (2), 209-217 (2010).
    20. Kovalchuk, I. P., et al. Age-dependent changes in DNA repair in radiation-exposed mice. Radiat Res. 182 (6), 683-694 (2014).
    21. Rube, C. E., et al. DNA repair in the context of chromatin: new molecular insights by the nanoscale detection of DNA repair complexes using transmission electron microscopy. DNA Repair. 10 (4), 427-437 (2011).
    22. Amundson, S. A., Do, K. T., Fornace, A. J. Induction of stress genes by low doses of gamma rays. Radiat Res. 152 (3), 225-231 (1999).

    الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

    إعادة الطباعة والأذونات

    استكشف المزيد من المقالات

    إصلاح تلف الحمض النوويقياس التدفق الخلويغاما H2AXالإشعاع منخفض الجرعةكسور الشريط المزدوجالتحدي الإشعاعيالوسم المناعي الفلوريعزل الخلايا
    قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة
    تواصل معنا
    أوصِ به للمكتبة

    الخصوصية

    شروط الاستخدام

    السياسات

    حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.