بروتوكول لتقييم التغيرات في مستويات تلف الحمض النووي وقدرة إصلاح الحمض النووي التي قد تكون ناجمة عن تشعيع الجرعة المنخفضة المزمن في الجسم الحي في الخلايا الليمفاوية في طحال الفأر ، عن طريق قياس هيستون H2AX الفسفوري ، وهو علامة على فواصل الحمض النووي المزدوج ، باستخدام قياس التدفق الخلوي.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
قياس الحمض النووي من التلف وإصلاح في ماوس Splenocytes بعد المزمنة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
انخفاض جرعة التعرض للإشعاع قد تنتج مجموعة متنوعة من الآثار البيولوجية التي تختلف في كمية ونوعية من الآثار التي تنتجها جرعات عالية من الإشعاع. معالجة المسائل المتعلقة بالسلامة والصحة البيئية والمهنية والعامة بطريقة سليمة ومبررة علميا يعتمد بشكل كبير على القدرة على قياس دقيق لآثار البيولوجية للملوثات جرعة منخفضة، مثل المؤينة المواد الإشعاعية والكيميائية. الضرر وإصلاح الحمض النووي هي مؤشرات مبكرة أهم المخاطر الصحية بسبب العواقب على المدى الطويل المحتملة، مثل السرطان. نحن هنا وصف بروتوكول لدراسة تأثير التعرض المزمن في الجسم الحي لجرعات منخفضة من γ- وβ-الإشعاع على الحمض النووي من التلف وإصلاح في خلايا الطحال الماوس. باستخدام علامة مقبولة عموما من الحمض النووي الكسر مزدوج الحبل، مفسفر H2AX هيستون دعا γH2AX، علينا أن نظهر كيف يمكن استخدامها لتقييم ليس فقط على مستوى الحمض النووي من التلف، ولكن التغييرات أيضافي قدرة إصلاح الحمض النووي المنتجة يحتمل بجرعة منخفضة في التعرض الجسم الحي. التدفق الخلوي يسمح قياس سريعة ودقيقة وموثوق بها من المسمى immunofluorescently γH2AX في عدد كبير من العينات. يمكن تقييم DNA مزدوج الجديلة إصلاح كسر من خلال تعريض splenocytes استخراج إلى جرعة الصعبة من 2 غراي لإنتاج عدد كاف من DNA فواصل لتحريك إصلاح وعن طريق قياس يسببها (1 ساعة بعد التشعيع) والحمض النووي من التلف المتبقية (24 ساعة بعد التشعيع). أن الحمض النووي من التلف المتبقي يكون مؤشرا على إصلاح ناقصة وخطر عدم الاستقرار الجيني على المدى الطويل والسرطان. جنبا إلى جنب مع فحوصات أخرى ونقطة النهاية التي يمكن بسهولة أن يقاس في مثل هذه الدراسات المجراة (على سبيل المثال، التشوهات الكروموسومية، ترددات النويات في الشبكيات نخاع العظام، والتعبير الجيني، وما إلى ذلك)، وهذا النهج يتيح إجراء تقييم دقيق والسياقية للآثار البيولوجية من الضغوطات مستوى منخفض.
المقدمة
جدل كبير بشأن الآثار الضارة المحتملة من تناول جرعات منخفضة أو منخفضة جدا من الإشعاع والخوف الجمهور من الإشعاع، مدفوعا صورا للتفجيرات الذرية هيروشيما وناغازاكي والنادرة الحوادث محطة نووية المؤينة (التي تفاقمت بسبب وسائل الإعلام)، قد أدى إلى غاية تنظيم الحماية من الإشعاع الصارم والمعايير التي يمكن أن تكون غير مبررة علميا. في العقود الثلاثة الماضية، وقد وثقت تقارير عديدة سواء لعدم وجود ضارة وجود الآثار البيولوجية يمكن أن تكون مفيدة الناجمة عن الإشعاع جرعة منخفضة 1-4. عوامل الخطر الصحية للإشعاع الرئيسي هو احتمال السرطان، تقديرها بناء على دراسات وبائية من الناجين من القنبلة الذرية تلقي جرعات عالية أو متوسطة من الإشعاع. يس....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وينبغي لجميع إجراءات التعامل مع والعلاج الماوس الالتزام بالقواعد التي وضعتها برامج التشريعية و / أو رعاية الحيوان والتي وافقت عليها لجنة رعاية الحيوان المحلية. تم تنفيذ جميع الطرق الموضحة في هذا البروتوكول وفقا للمبادئ التوجيهية للمجلس الكندي للرعاية الحيوان بموافقة لجنة رعاية الحيوان المحلية.
تنبيه: كل عمل مع النشاط الإشعاعي (بما في ذلك، ولكن لا تقتصر على التعامل مع التريتيوم، الخارجي γ-التشعيع، والتعامل مع الأنسجة الحيوانية المشعة والنفايات الفراش) يجب أن تلتزم القواعد المنصوص عليها من قبل السلطات التشريعية و / أو الحماية من الإشعاع وأن يقوم بها أذن الموظفين في مختبر معتمد و / أو المرفق.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 2 أمثلة من التدفق الخلوي الرسوم البيانية المتوقعة لsplenocytes أعدت باستخدام الطريقة الموصوفة هنا. هي بوابات الخلايا أولا على أساس <الإلكترونية مبعثر الجانب حجم> مؤامرة مبعثر (الشكل 2A و 2D، حجم الإلكترونية ما يعادل مبعثر إلى الأمام). FL3 / propidium رسوم بيانية اليود (الشكل 2B و2E) تؤكد العادي توزيع دورة الخلية. يعني إشارة γH2AX حسابها باستخدام قناة FL1 يؤكد زيادة> 2 أضعاف في الحمض النووي DSB.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكول الواردة في هذه الورقة هو مفيد لإجراء الماوس على نطاق واسع في الدراسات المجراة دراسة الآثار السامة للجينات من مستويات منخفضة من مختلف العوامل الكيميائية والفيزيائية، بما في ذلك الإشعاعات المؤينة. منشأتنا الحيوانات خالية من مسببات الأمراض محدد فريدة من نوعها مجهزة GammaBeam 150 irradiator و30 متر قاعة التشعيع طويلة تسمح بإجراء الدراسات مدى الحياة التي تنطوي على irradiations معدل جرعة منخفضة أو منخفضة جدا على مئات أو حتى آلاف من الفئران. يمكن تعيين مرافق أش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون أنه لا توجد مصالح مالية متنافسة معروفة.
شكر وتقدير
يود المؤلفان أن يعرب عن تقديرهما لمساهمة زملائنا ساندرين روش لوفيفر وإريك غريغوار من معهد الحماية الإشعاعية والسلامة النووية (باريس، فرنسا). ودعم هذا العمل برنامج العلم والتكنولوجيا التابع لحكومة كندا في المختبرات النووية الكندية (نهر تشالك ، أونتاريو ، كندا) ، ومجموعة مالكي CANDU (تورنتو ، أونتاريو ، كندا) ، ولجنة السلامة النووية الكندية ، ومعهد الحماية الإشعاعية والسلامة النووية (باريس ، فرنسا).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| HTO: ماء متراهي ، [3H] | يتم الحصول عليه محليا من مفاعل نووي ؛ | نشاط المخزون 3.7 جيجابايت / مللي لرغونفي ؛ يمكن استبداله ب HTO من Perkin Elmer | |
| OBT: Alanine ، L- [3-3H]: التريتيوم المرتبط عضويا (OBT) بيركين | إلمر | NET348005MC | 1 ملي سي / مل (185 ميجابايت في المل |
| OBT: الجلايسين ، [2-3 ساعات]: تريتيوم مرتبط عضويا | بيركين إلمر | NET004005MC | 1 ملي سي / مل (185 ميجابايت في المq) |
| OBT: البرولين ، L- [2،3-3 ساعة]: التريتيوم المرتبط عضويا (OBT) بيركين | إلمر | NET323005MC | 1 ملي Ci / مل (185 ميجابايت في مليون) |
| ماء متريت ، [3 ساعات] (HTO) | بيركين إلمر | NET001B005MC | بديل ل HTO من أصل محلي ؛ |
| GammaBeam 150 irradio | للطاقة الذرية الكندية المحدودة | المصنعة محليا | بمصدر إشعاع g آخر ذو نشاط منخفض بما فيه الكفاية |
| Tween-20 | Sigma Aldrich | P1379-500ML | |
| RPMI | Fisher Scientific | SH3025501 | Hyclone RPMI 1640 مع L-Glutamine و HEPES 500 مل |
| مصل الأبقار الجنيني | Sigma Aldrich | F1051-100ML | |
| الأجسام المضادة ل gH2AX ، استنساخ JBW301 | Millipore | 05-636 | |
| Alexa fluor-488 الماعز المضاد للأجسام المضادة للفأر | Life Technologies (سابقا Invitrogen) | A21121 | |
| بروبيديوم اليود | سيجما ألدريتش | P4864-10ML | 1 مجم / مل |
| الإيثانول | الكحول التجاري | P006-EAAN | زجاجات 500 مل أنابيب الإيثانول المطلق |
| 1.5 مل | أنابيب فيشر Scientific | 2682550 | الطرد المركزي |
| الدقيقة 15 مل أنابيب | فيشر ساينتفيك | 05-539-5 | أنابيب طرد مركزي بولي بروبيلين معقمة |
| النيتروجين السائل | Linde | P110403 | |
| 12 × 75 مم أنابيب زجاجية غير | فيشر ساينتفيك | K60B1496126 | أنابيب زجاجية من البورسليكات يمكن التخلص منها مع نهاية عادية |
| T25 قوارير | VWR | CA15708-120 | nunc tisue ثقافة 25 مل قارورة (رقم المورد 156340) |
| مقص | العلوم الدقيقة | 14068-12 | مقص فاغنر 12 سم ملقط حاد / حاد |
| ، | أدوات العلوم الدقيقة | المستقيمة 11008-13 | ملقط سيمكين 13 سم ، |
| ملقط مستقيم ، أدوات | العلوم الدقيقة | 11003-12 | ملقط نمط ضيق 12 سم ، أطباق بتري منحنية |
| 60 مم | VWR | CA25382-100 | BD طبق زراعة أنسجة الصقر 60 × 15 مم |
| مصافي خلايا ، 70 مم | فيشر ساينتفيك | 08-771-2 | مصافي خلايا الصقر 50 / علبة |
| وصفة PBS: 1 قرص مذاب في 200 مل من الماء منزوع الأيونات ، اضبط درجة الحموضة على 7.4 إذا لزم الأمر. | Sigma Aldrich | P4417-100TAB | أقراص ملحية مخزنة بالفوسفات وصفة |
| TBS: لعمل 10x مخزون | |||
| 30 جم TRIS HCl | Sigma Aldrich | T3253-1KG | Trizma hydrochloride |
| 88 جم كلوريد الصوديوم NaCl | Fisher Scientific | S271-500 | كلوريد الصوديوم |
| 2 جم KCl | Fisher Scientific | P217-500 | كلوريد |
| البوتاسيومقم بإذابة 1 لتر من الماء منزوع الأيونات ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7.4 |
المراجع
- Mitchel, R. E., Jackson, J. S., McCann, R. A., Boreham, D. R. The adaptive response modifies latency for radiation-induced myeloid leukemia in CBA/H mice. Radiat Res. 152 (3), 273-279 (1999).
- Shadley, J. D. Chromosomal adaptive response in human lymphocytes. Radiat Res<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
