Method Article

مضان غشاء حيوي قوة دقق: الكميات المتزامنة من حركية مستقبلات يجند والتي يسببها ملزم بين الخلايا اشارة على خلية واحدة

DOI:

10.3791/52975

⸱

August 4th, 2015

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Woodruff School of Mechanical Engineering, Petit Institute for Bioengineering and Biosciences, Georgia Institute of Technology, 2Coulter Department of Biomedical Engineering, Georgia Institute of Technology, 3Charles Perkins Centre, The University of Sydney, 4Institute of Biophysics, Laboratory of RNA Biology, Chinese Academy of Sciences, 5University of Chinese Academy of Sciences, 6School of Medicine and Collaborative Innovation Center for Diagnosis and Treatment of Infectious Diseases, Zhejiang University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف تقنية لقياس حركية ربط المستقبلات المفردة المنظمة بالقوة والتصوير في الوقت الفعلي لإشارات الكالسيوم في الخلايا الليمفاوية التائية واحدة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الغشاء مستقبلات يجند التفاعل تتوسط العديد من الوظائف الخلوية. ملزمة حركية وإشارات المصب الناجمة عن هذه التفاعلات الجزيئية المرجح تتأثر البيئة الميكانيكية التي ملزما ويشير تجري. أظهرت دراسة حديثة أن قوة ميكانيكية يمكن أن تنظم الاعتراف المستضد من قبل، ويتسبب في مستقبلات الخلايا التائية (TCR). وقد أصبح هذا ممكنا بفضل التكنولوجيا الجديدة التي قمنا بتطويرها ومضان يطلق قوة غشاء حيوي التحقيق (fBFP)، الذي يجمع بين جزيء واحد قوة التحليل الطيفي مع مضان المجهري. باستخدام خلايا الدم الحمراء في الانسان فائقة النعومة كما استشعار القوة حساسة، وكاميرا عالية السرعة والوقت الحقيقي تتبع تقنيات التصوير، وfBFP هو من ~ 1 السندات الإذنية (10 -12 N)، ~ 3 ~ نانومتر و 0.5 مللي ثانية في القوة، القرار المكانية والزمانية. مع fBFP، يمكن للمرء أن قياس بدقة حركية مستقبلات يجند واحدة ملزمة بموجب المادة القوة في وقت واحد صورة أثار ملزم كال داخل الخلاياcium يشير على خلية حية واحدة. هذه التكنولوجيا الجديدة يمكن استخدامها لدراسة أخرى الغشاء مستقبلات يجند التفاعل ويشير في الخلايا الأخرى في إطار التنظيم الميكانيكي.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلية الى خلية والخلية الى خارج الخلية مصفوفة بوساطة (ECM) التصاق عن طريق الربط بين مستقبلات سطح الخلية والبروتينات ECM، و / أو الدهون 1. ملزمة تمكن خلايا لتشكيل هياكل وظيفية 1، وكذلك الاعتراف، والتواصل، والتفاعل مع البيئة 1-3. على عكس البروتينات القابلة للذوبان (مثل السيتوكينات وعوامل النمو) التي تربط من ثلاثي الأبعاد (3D) المائع على مستقبلات سطح الخلية، مستقبلات التصاق الخلايا تشكل السندات مع بروابط بهم عبر فجوة ضيقة صلي لسد سطحين معارضة التي تقيد الجزيئية نشر في الأبعاد (2D) واجهة اثنين 4-7. وعلى النقيض من حركية 3D والتي يتم قياسها عادة من قبل المقايسات ملزمة التقليدية ....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول يتبع المبادئ التوجيهية للوتمت الموافقة من قبل لجنة أخلاقيات البحوث البشرية من معهد جورجيا للتكنولوجيا.

1. كرات الدم الحمراء الإنسان العزلة، Biotinylation والأسمولية تعديل

ملاحظة: الخطوة 1.1 يجب أن يؤديها الطبية المهنية مثل ممرضة مدربة، مع الموافقة على مجلس المراجعة المؤسسية البروتوكول.

  1. الحصول على 8-10 ميكرولتر (قطرة واحدة) من الدم من وخز الاصبع وإضافة إلى 1 مل من كربونات / بيكربونات العاز....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

كان رائدا في تقنية BFP من قبل المختبر ايفانز في عام 1995 (17). وقد استخدمت هذه الأداة picoforce على نطاق واسع لقياس تفاعلات البروتينات ثبتوا على السطوح، وذلك لتحليل حركية ثنائي الأبعاد للجزيئات الالتصاق التفاعل مع بروابط بهم 16،19،20، 30، لقياس مرونة الجزيئية 21،29، وتحديد البروتين بتكوين يتغير 21. لfBFP، مجموعة إضافية من الأجهزة ذات الصلة برنامج التحصين الموسع ومضان مع نظام البرمجيات المقابلة (الجدول 1) يضاف (ال.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تجربة ناجحة fBFP ينطوي على بعض الاعتبارات الهامة. أولا، لحساب القوة لتكون موثوقة، وmicropipette، وRBC، وحبة التحقيق يجب أن تكون محاذاة أقرب إلى محوري وقت ممكن. يجب أن يكون الإسقاط من RBC داخل ماصة حوالي واحد قطره التحقيق ماصة بحيث الاحتكاك بين RBC وماصة لا يكاد يذكر. لRBC البشري نموذجي، وقطرها ماصة الأمثل هو 2،0-2،4 ميكرون، والتي تعطي أفضل نوبة من المعادلة 1 17،30. ثانيا، لضمان قياسات في فحص قوة المشبك والحرارية تقلب الاختبار هي في الغالب للسندات واحدة، تردد التصاق أقل .......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم الأبحاث المتعلقة بهذه الورقة وتطوير تقنية fBFP في مختبر Zhu من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة AI044902 و AI077343 و AI038282 و HL093723 و HL091020 و GM096187 و TW008753. نشكر إيفان إيفانز على اختراع هذه الأداة التجريبية التمكينية ، وأعضاء مختبر إيفانز ، أندرو ليونج ، وكوجي كينوشيتا ، وويسلي وونغ ، وكين هالفورسن ، لمساعدتنا في بناء BFP. نشكر أيضا أعضاء مختبر Zhu الآخرين ، Fang Kong و Chenghao Ge و Kaitao Li ، على مساعدتهم في تطوير الأجهزة.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
أحادي هيدرات فوسفات الصوديوم أحادي القاعدة (NaH2PO4 & H2< / sub>O)Sigma-AldrichS9638تحضير عازلة الفوسفات
Anhy. فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na 2< / sub >HPO4< / sub>)Sigma-AldrichS7907تحضير عازلة الفوسفات
كربونات الصوديوم (Na 2< / sub >CO3< / sub>)Sigma-AldrichS2127تحضير عازلة كربونات / بيكربونات
بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>)Sigma-AldrichS5761كربونات / بيكربونات تحضير المخزن المؤقت
كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم)Sigma-AldrichS7653N2-5٪ تحضير عازلة
كلوريد البوتاسيوم (KCl)Sigma-AldrichP9541N2-5٪ تحضير عازلة
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2< / sub>PO4< / sub>)Sigma-AldrichP5655N2-5٪ تحضير عازل
السكروزسيجما ألدريتشS0389N2-5٪ إعداد العازلة
MAL-PEG3500-NHSJenKemA5002-1وظيفة الخرزة
البيوتين-PEG3500-NHSJenKemA5026-1RBC biotinylation
NystatinSigma-AldrichN6261تعديل الأسمولية RBC
هيدروكسيد الأمونيوم (NH4< / sub>OH)Sigma-AldrichA-6899حبة زجاجية السيلان
الميثانولBDH67-56-1سيلان الخرزة الزجاجية
30٪ بيروكسيد الهيدروجين (H2< / sub>O2< / sub>) JTBarkerJan-86سيلان الخرزة الزجاجية
حمض الخليك (الجليدي)سيجما ألدريتشARK2183سيلان الخرزة الزجاجية
3-Mercaptopropyltrimethoxysilane (MPTMS) UctSpecialties، LLC4420-74-0وظيفة حبة زجاجية
حبة البورسليكات الخرز الزجاجيDistrilab تكنولوجيا الجسيمات9002حبة الزجاج
Streptavidin & ناقص ؛ MaleimideSigma-AldrichS9415وظيفة حبة الزجاج
BSASigma-AldrichA0336Ligand وظيفية
Fura2-AMLife TechnologiesF-1201صبغة مضان الكالسيوم داخل الخلايا تحميل
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)Sigma-AldrichD2650صبغة مضان الكالسيوم داخل الخلايا تحميل
حبات Quantibrite PEBD Biosciences340495القياس الكمي للكثافة
مقياس التدفق الخلويBD BiosciencesBD Biosciences BD LSR IIالكثافة الكمي
أنبوب الشعيرات الدموية 0.7-1.0 مم × 30 بوصةKimble Chase46485-1ماصة دقيقة صنع
المشتعلة / البني مجتذبالذراعP-97ماصة دقيقة صنع
الماصة microforceNarishigeMF-900ماصة دقيقة صنع
الزيوت المعدنيةفيشر العلميBP2629-1غرفة
الجمعية غطاء مجهر زجاجفيشر العلمي12-544-Gتجميع الغرفة
حاقن دقيقالعالم أدواتالدقة MF34G-5تجميع
الغرفة 1 مل حقنةBD & nbsp ؛تجميع غرفة 309602
حامل ماصة دقيقةNarishigeHI-7تجميع الغرفة
الميكانيكية المصممة للمنزل والمحولات باستخدام التصنيع باستخدام الحاسب الآلي.أداة الفيزياء الحيويةيتم تخصيص جميع الأجزاء وفقا لتصميمات CAD.نظام BFP
مجهر (TiE مقلوب) نظامنيكونMEA53100BFP
الهدف خطة CFI Fluor 40x (NA 0.75 ، WD 0.72 مم ، SPG)نظام BFPMRH00401من نيكون
، GE680 ، 640 × 480 ، GigE ، 1/3 بوصة CCD ، أحاديGraftek Imaging02-2020Cنظام BFP
Prosilica GC1290 - ICX445 ، 1/3 بوصة ، C-Mount ، 1280 × 960 ، أحادي اللون ، CCD ، 12 بت ADCGraftek Imaging02-2185ABFP نظام
مسبار يدوي submicron مع جهاز تحكم عن بعد عالي الدقةKarl SussPH400BFP
جدول مضاد للاهتزاز (5 × 3)TMC77049089BFP نظام
3D المرحلة الانتقالية اليدويةنيوبورت462-XYZ-M
SolidWorks 3D CAD البرمجياتSOLIDWORKS Corp.إصدار 2012 SP5نظام BFP
برنامج LabVIEWالأدوات الوطنيةالإصدار 2009نظام BFP ، برنامج BFP
3D بيزو المرحلة الانتقاليةPhysik InstrumenteM-105.3Pنظام BFP
مؤكد بيزو خطيPhysik InstrumenteP-753.1CDنظام BFP
Micromanagerالإصدار 1.4نظام fBFP ، مضان برنامج التصوير
كاميرا مزدوجة (DC-2)القياسات الضوئية77054724نظام fBFP
مرشح انبعاث الكاميرا المزدوجة (T565LPXR)القياسات الضوئية77054725نظام fBFP
كاميرا مضانHamamatsuORCA-R2 C10600-10Bنظام fBFP
بارافين بلاستيكي (بارافيلم)شركة Bemis ، IncPM996ختم زجاجة
الكربونات / عازلة بيكربونات (درجة الحموضة 8.5)8.4 جم / لتر كربونات الصوديوم (Na2< / sub>CO3< / sub>) ، 10.6 جم / لتر بيكربونات الصوديوم (NaHCO3< / sub>)
عازلة الفوسفات (درجة الحموضة 6.5-6.8)27.6 جم / لتر NaPhosphate أحادي القاعدة (NaH2< / sub>PO4< / sub> & bull; H2O) ، 28.4 جم / لتر Anhy. ثنائي الفوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة (Na2HPO4)
N2-5٪ عازلة (درجة الحموضة 7.2)20.77 جم / لتر كلوريد البوتاسيوم (KCl) ، 2.38 جم / لتر كلوريد الصوديوم (كلوريد الصوديوم ) ، 0.13 جم / لتر أحادي القاعدة من فوسفات البوتاسيوم (KH2< / sub>PO4< / sub>) ، 0.71 جم / لتر أنهي. ثنائي القاعدة من فوسفات الصوديوم (Na2HPO4)، 9.70 جم/لتر سكروز
وظيفة أداة الأجزاء كاميرا برنامج فيلم

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Aplin, A. E., Howe, A., Alahari, S. K., Juliano, R. L. Signal transduction and signal modulation by cell adhesion receptors: the role of integrins, cadherins, immunoglobulin-cell adhesion molecules, and selectins. Pharmacological reviews. 50, 197-263 (1998).
  2. Davis, M. M., Bjorkman, P. J.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Fluorescence Biomembrane Force ProbeReceptor ligand KineticsIntracellular Calcium SignalingSingle Cell AnalysisForce SpectroscopyFluorescence MicroscopyRed Blood Cell Force SensorT cell Receptor BindingMechanical Force RegulationMicro Pipette Manipulation

Related Articles