القنوات الأيونية التي أعرب عنها في ظهارة أنبوبي كلوي تلعب دورا هاما في علم الأمراض من مرض الكلى المتعدد الكيسات. نحن هنا وصف البروتوكولات التجريبية استخدامها لإجراء التحليل ومستوى الكالسيوم داخل الخلايا القياسات التصحيح، المشبك في ظهارة الكيسي المعزولة حديثا من الكلى القوارض.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
تنفيذ المشبك التصحيح وايف مضان المجهر لرصد خصائص الوظيفية للالمعزولة حديثا PKD الظهارة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
بدء الكيس والتوسع خلال مرض الكلى المتعدد الكيسات هي عملية معقدة تتميز شذوذ في تكاثر الخلايا أنبوبي، وتراكم السوائل اللمعية وتشكيل مصفوفة خارج الخلية. آخر من القنوات الأيونية وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا والمعلمات الفسيولوجية الرئيسية التي تحدد مهام خلايا الطلائية. طورنا طريقة مناسبة لمراقبة الوقت الحقيقي من النشاط القنوات الأيونية مع تقنية التصحيح، المشبك وتسجيل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية المعزولة حديثا من الكيسات الكلوية. الفئران PCK، وهذا نموذج الجيني للراثي مقهور مرض الكلى المتعدد الكيسات (ARPKD)، استخدمت هنا لخارج الحي تحليل القنوات الأيونية وتدفق الكالسيوم. وصف هنا هو إجراء مفصلة خطوة بخطوة تهدف إلى عزل الطبقات الوحيدة الكيسي والأنابيب غير متسعة من PCK أو العادية سبراغ داولي (SD) الفئران، ومراقبة نشاط قناة واحدة والكالسيوم داخل الخلايا 2+ ديناميات.هذه الطريقة لا تتطلب المعالجة الأنزيمية ويسمح تحليل في وضع الأصلي للالمعزولة حديثا أحادي الطبقة الظهارية. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية حساسة جدا للتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. وأخيرا، ظهارة الكيسي المعزولة يمكن أيضا استخدامها لتلطيخ مع الأجسام المضادة أو الأصباغ، وإعداد الثقافات الأولية وتنقية لمختلف فحوصات البيوكيميائية.
المقدمة
القنوات الأيونية تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. مقهورة أمراض الكلى المتعدد الكيسات السائدة والمتنحية (ADPKD وARPKD، على التوالي) هي اضطرابات وراثية تتميز تطوير مملوءة بسائل الكيسات الكلوية من أصل الخلايا الظهارية أنبوبي. ويتسبب ADPKD بواسطة طفرات من PKD1 أو PKD2 الجينات التي تكود polycystins 1 و 2، والبروتينات غشاء تشارك في تنظيم تكاثر الخلايا والتمايز. PKD2 في حد ذاته أو مجمع مع PKD1 تعمل أيضا بمثابة الكالسيوم 2+ الموجبة -permeable قناة 1. الطفرات من PKHD1 ترميز الجين fibrocystin (أ-مثل مستقبلات البروتين المرتبط أهداب المشاركة في tubulogenesis و / أو صيان....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان في كلية الطب في ويسكونسن وجامعة تكساس مركز العلوم الصحية في هيوستن وكان وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. الشكل 1 يوضح الخطوات الرئيسية لعزل الأنسجة وإجراء المعالجة. لفترة وجيزة، وتستخدم الكلى من PCK أو SD الفئران لعزل اليدوية من الطبقات الوحيدة الظهارية من جمع مجاري صحية سواء من الأنابيب غير التي تم الاتصال بها أو الخراجات. نحن هنا درس الكلى 4-16 أسابيع الفئران القديمة PCK 10،13.
1. عزل الكلى الخراجات ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
وقد ثبت تورط محتمل في عناق تكون الكيسة من قبل العديد من الدراسات أن لوحظ تعطل عامل نمو البشرة (EGF) يشير في PKD تقدم 22-25 وغير طبيعي استيعاب الصوديوم في ARPKD نماذج الفئران والثقافات الأنسجة 26-28. على سبيل المثال، Veizis وآخرون أظهرت أن تراعي الأميلوريد نا + امتصاص وانخفاض في خلايا CD من النموذج غير orthologous الماوس BPK من ARPKD 29. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن ضعف الصوديوم واستيعاب المياه في الخراجات هو عامل مهم في تفاقم .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
وصفنا هنا تطبيقات التقليدية تقنية التصحيح، المشبك والتصوير epifluorescence الكالسيوم إلى الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المستمدة من نموذج الجيني الفئران من ARPKD. يتكون البروتوكول من ثلاث خطوات، والتي ينبغي أن تدفع معظم الاهتمام إلى عزل الخراجات (الخطوة 1.5 من قسم البروتوكولات) والدراسات الكهربية. تتطلب هذه الإجراءات الرئيسية التدريب والصبر واسعة النطاق، ويجب أن لا يكون القارئ بالإحباط في آن واحد.
أولا وقبل كل ش.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أشكر غلين سلوكم (كلية الطب في ويسكونسن) وكولين A. لافين (الصكوك نيكون المؤتمر الوطني العراقي) للحصول على المساعدة الفنية ممتازة مع التجارب المجهري. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL108880 (لAS)، R01 DK095029 (لOPO) وK99 HL116603 (لTSP)، المؤسسة الوطنية للكلى IG1724 (لTSP)، وجمعية القلب الأميركية 13GRNT16220002 (لOPO) و وJ. زمالة بن Lipps البحوث من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى (لDVI).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Fura-2 AM | Life Technologies | F-14185 | |
| Fluo-8 | AAT Bioquest | 21091 | |
| Poly-L-lysine | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| حمض البلورونيك | سيجما ألدريتش | F-68 ؛ | حل |
| شاكر | Boekel Scientific | 260350 | |
| مصدر الضوء | Sutter Instrument Co | Lambda XL | مع سائق عجلة مصراع / مرشح متكامل |
| مرشحات كثافة محايدة | نيكون | ND4 ، ND8 | |
| الموضوع | نيكون | SFluo ؛ | 40 / 1.3 DIC WD 0.22 ؛ كاميرا زيلية |
| Andor Technologies | Zyla sCMOS | ||
| Nikon مجهر (مقلوب) | نيكون | نيكون Eclipse TE2000-S | |
| غطاء زجاجي | Thermo Scientific | 6661B52 | |
| قلم رصاص الماس | فيشر Scientific | 22268912 | |
| الحصول على الصور | برنامج نيكون | نيكون NIS-Elements | |
| يسمح البرنامج | ImageJ | http://imagej.nih.gov/ | ND Utility باستيراد الصور بتنسيق Nikon Instruments الأصلي .nd2 |
| غرفة التسجيل / التروية | Warner Instruments | RC-26 | |
| Patch Clamp مكبر للصوت | الأجهزة الجزيئية | MultiClamp 700B | |
| الحصول على البيانات | الأجهزة الجزيئية | Digidata 1440A | Axon Digidata & reg ؛ نظام |
| مرشح التمرير المنخفض | Warner Instruments | LPF-8 | 8 أقطاب Bessel |
| البورسليكات الشعرية | الزجاجية World Precision Instruments | 1B150F-4 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co | P-97 | Flaming / Brown نوع مجتذب الماصات |
| الدقيقة Microforge | Narishige | MF-830 | اليابان |
| بمحركات Micromanipulator | Sutter Instrument Co | MP-225 | |
| مجهر مقلوب | نيكون | Eclipse Ti | |
| طاولة عزل الاهتزاز | الدقيق TMC | مجهزة بقفص فاراداي | |
| نظام نضح الصمامات متعدد القنوات | AutoMake Scientific | Valve Bank II | |
| غرفة التسجيل / التروية | برنامج Warner Instruments | RC-26 | |
| الأجهزة الجزيئية | pClamp 10 . 2 | ||
| الجدول الجراحي الذي يتم التحكم فيه في درجة الحرارة ; | MCW الأساسية | للقوارض مجهر | |
| نيكون | SMZ745 | ||
| نظام التروية القائم على مضخة | الحقنة هارفارد | ||
| أنابيب البولي إيثيلين | جهاز هارفارد سيجما ألدريتش | PE50 | |
| تخدير الأيزوفلوران | http://www.vetequip.com/< / أ > | 911103 | |
| الكواشف الأساسية الأخرى | سيجما ألدريتش |
المراجع
- Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
- Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recess....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
