يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

تنفيذ المشبك التصحيح وايف مضان المجهر لرصد خصائص الوظيفية للالمعزولة حديثا PKD الظهارة

9.3K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53035

⸱

سبتمبر 1, 2015

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Physiology, Medical College of Wisconsin, 2Department of Integrative Biology & Pharmacology, University of Texas Health Science Center at Houston

في هذه المقالة

ملخص

القنوات الأيونية التي أعرب عنها في ظهارة أنبوبي كلوي تلعب دورا هاما في علم الأمراض من مرض الكلى المتعدد الكيسات. نحن هنا وصف البروتوكولات التجريبية استخدامها لإجراء التحليل ومستوى الكالسيوم داخل الخلايا القياسات التصحيح، المشبك في ظهارة الكيسي المعزولة حديثا من الكلى القوارض.

الملخص

بدء الكيس والتوسع خلال مرض الكلى المتعدد الكيسات هي عملية معقدة تتميز شذوذ في تكاثر الخلايا أنبوبي، وتراكم السوائل اللمعية وتشكيل مصفوفة خارج الخلية. آخر من القنوات الأيونية وإشارات الكالسيوم داخل الخلايا والمعلمات الفسيولوجية الرئيسية التي تحدد مهام خلايا الطلائية. طورنا طريقة مناسبة لمراقبة الوقت الحقيقي من النشاط القنوات الأيونية مع تقنية التصحيح، المشبك وتسجيل الخلايا مستوى الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية المعزولة حديثا من الكيسات الكلوية. الفئران PCK، وهذا نموذج الجيني للراثي مقهور مرض الكلى المتعدد الكيسات (ARPKD)، استخدمت هنا لخارج الحي تحليل القنوات الأيونية وتدفق الكالسيوم. وصف هنا هو إجراء مفصلة خطوة بخطوة تهدف إلى عزل الطبقات الوحيدة الكيسي والأنابيب غير متسعة من PCK أو العادية سبراغ داولي (SD) الفئران، ومراقبة نشاط قناة واحدة والكالسيوم داخل الخلايا 2+ ديناميات.هذه الطريقة لا تتطلب المعالجة الأنزيمية ويسمح تحليل في وضع الأصلي للالمعزولة حديثا أحادي الطبقة الظهارية. وعلاوة على ذلك، هذه التقنية حساسة جدا للتغيرات الكالسيوم داخل الخلايا ويولد صور عالية الدقة لقياسات دقيقة. وأخيرا، ظهارة الكيسي المعزولة يمكن أيضا استخدامها لتلطيخ مع الأجسام المضادة أو الأصباغ، وإعداد الثقافات الأولية وتنقية لمختلف فحوصات البيوكيميائية.

المقدمة

القنوات الأيونية تلعب دورا هاما في العديد من الوظائف الفسيولوجية، بما في ذلك نمو الخلايا والتمايز. مقهورة أمراض الكلى المتعدد الكيسات السائدة والمتنحية (ADPKD وARPKD، على التوالي) هي اضطرابات وراثية تتميز تطوير مملوءة بسائل الكيسات الكلوية من أصل الخلايا الظهارية أنبوبي. ويتسبب ADPKD بواسطة طفرات من PKD1 أو PKD2 الجينات التي تكود polycystins 1 و 2، والبروتينات غشاء تشارك في تنظيم تكاثر الخلايا والتمايز. PKD2 في حد ذاته أو مجمع مع PKD1 تعمل أيضا بمثابة الكالسيوم 2+ الموجبة -permeable قناة 1. الطفرات من PKHD1 ترميز الجين fibrocystin (أ-مثل مستقبلات البروتين المرتبط أهداب المشاركة في tubulogenesis و / أو صيانة قطبية ظهارة) هي دفعة الجيني للARPKD 2. هو ظاهرة معقدة رافقت نمو الكيس مع انتشار اضطراب 3،4، 5 الأوعية الدموية، فقد التمايز وفقدان القطبيةإيتي الخلايا الأنبوبية 6-8.

عيب استيعاب وإفراز المعزز في ظهارة الكيسي يسهم في تراكم السوائل في التجويف والكيس التوسع 9،10. ضعف تعتمد على تدفق [كا 2+] وقد تم ربط ط يشير أيضا إلى تكون الكيسة خلال PKD 11-15.

هنا، نحن تصف طريقة مناسبة لقياس التصحيح، المشبك النشاط قناة واحدة والخلايا مستويات الكالسيوم 2+ في الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المعزولة من الفئران PCK. تم تطبيق هذه الطريقة بنجاح من قبلنا لوصف النشاط من قناة الظهارية نا + (عناق) 10 و [كا 2+] أنا معتمد على العمليات الناجمة عن الكالسيوم 2+ TRPV4 -permeable وpurinergic يشير شلال 13.

في هذه الدراسات استخدمنا الفئران PCK، وهذا نموذج من ARPKD الناجمة عن طفرة تلقائية في الجين PKHD1. كان من سلالة PCK اصلاذ المستمدة من سبراج داولي (SD) الفئران تستخدم 16 الجرذان وبالتالي التنمية المستدامة باعتبارها الرقابة المناسبة للمقارنة بسلالة PCK. ونتيجة لذلك، يمكن على حد سواء SD الفئران شرائح كليون والقنوات غير المتوسعة جمع المعزولة من الفئران PCK نفس بمثابة مجموعتين مقارنة مختلفة لتجارب على ظهارة الكيسي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية المبينة أدناه من قبل لجنة رعاية واستخدام المؤسسية الحيوان في كلية الطب في ويسكونسن وجامعة تكساس مركز العلوم الصحية في هيوستن وكان وفقا لالمعاهد الوطنية للصحة الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية. الشكل 1 يوضح الخطوات الرئيسية لعزل الأنسجة وإجراء المعالجة. لفترة وجيزة، وتستخدم الكلى من PCK أو SD الفئران لعزل اليدوية من الطبقات الوحيدة الظهارية من جمع مجاري صحية سواء من الأنابيب غير التي تم الاتصال بها أو الخراجات. نحن هنا درس الكلى 4-16 أسابيع الفئران القديمة PCK 10،13.

1. عزل الكلى الخراجات والأنابيب الصغيرة توصيل (CNT) / جمع مجاري (CD) قطاعات

  1. تخدير حيوانات التجارب مع isoflurane (5٪ تحريض، 1،5-2،5٪ الصيانة) / الصف O الطبية 2 أو طريقة أخرى معتمدة. يجب مراقبة الحيوانات باستمرار لضمان جنيه كافيةفيل من التخدير. تستخدم مستقر التنفسي رد الفعل معدل وقرصة أخمص قدميه لتأكيد التخدير المناسب.
  2. أداء البطن وطرد الكلى مع الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) من خلال الشريان الأورطي البطني 17.
    1. إعداد القسطرة أنابيب البولي ايثيلين (PE50) وتوصيله إلى جهاز ضخ حقنة مليئة PBS. قطع الجلد وجدار البطن على طول الخط ألبا، ثم إجراء شق في البطن عرضية عبر البطن من جانب إلى آخر وتحول أعضاء البطن مع مسحات القطن للوصول إلى الشريان الأورطي النازل مع المتفرعة المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين. بلل الأعضاء الداخلية مع المياه المالحة الدافئة خلال مزيد من الإجراءات لمنع جفاف بهم.
    2. وضع رباط واحد (رقم 1) حول المساريقي والاضطرابات الهضمية الشرايين وضمد آخر (رقم 2) حول الأبهر تحت الحجاب الحاجز (لا ربط). فصل بلطف. البطنية التي تخفف من حدة تشريح الأنسجة الضامة المحيطة بها مع ملقط رقيقة ووضع اثنين من اربطة ~ 3مم أسفل الشريان الكلوي الأيسر (رقم 3) وفوق التشعب الشرايين الحرقفية (رقم 4).
    3. ربط رباط رقم 4 وإرفاق المشبك السفينة في جميع أنحاء الشريان الأورطي بين الشريان الكلوي الأيسر ورباط # 3. إجراء شق بين الشبك ورباط رقم 4 ليقثطر الشريان الأبهر، واستخدام رباط رقم 3 لإصلاح بحزم القسطرة.
    4. الافراج عن المشبك والتأكد من أن نبض الدم مرئيا في القسطرة لضمان التركيب الصحيح. بدء نضح بمعدل 6 مل / دقيقة، وربط الحروف المركبة رقم 1 ورقم 2، وقطع الوريد الكلوي الأيسر. تواصل التنظيف لمدة 1-2 دقيقة حتى يتم المقشر أجهزة تماما.
    5. قطع الأوعية الدموية الكلوية، مجرى البول والأنسجة المحيطة الضام والدهنية مع مقص لجمع الكلى. ثم جعل المسيل للدموع قصيرة في كبسولة الكلى وقشر الكلى لdecapsulate لهم. وضع الكلى في PBS الجليد الباردة. تأكيد القتل الرحيم قبل بضع الصدر.
  3. إعداد 5 × 5 مم رقائق الزجاج غطاء المغلفة مع بولي-L-ليسين. قطع غلا غطاءSS مع قلم رصاص الماس ومكان ما يقرب من 20 ميكرولتر من 0.01٪ العقيمة التي تمت تصفيتها حل بولي-L-ليسين على كل شريحة زجاجية. إعداد المالحة واثنين من أزواج من ملقط ساعاتي للتشريح.
  4. قطع الكلى بشفرة حلاقة على طول الطائرة الأمامية إلى شرائح من ~ 1-2 مم. مكان واحد من شرائح تحت stereomicroscope. وينبغي أن يتم عزل الأنسجة في المياه المالحة الجليد الباردة.
  5. تحديد الخراجات تحت stereomicroscope كما تجاويف مستديرة الشكل (الشكل 2A). غالبا ما تحتوي على جدرانها شبكة بارزة من الأوعية الدموية انتشرت. باستخدام ملقط غرامة ذات الرؤوس تشريح طبقة الطلائية الداخلية للمثانة رقيقة قدر الإمكان للحصول على منطقة أحادي الطبقة. إرفاقه شريحة زجاجية مغطاة بولي-L-ليسين. مثبت سطح بولي-L-ليسين يسمح الباحث لوضع بحزم طبقة الكيس الداخلية على الزجاج. كشف الكيس مع الجانب قمي لتوفير وصول ماصات (الشكل 2B).
  6. استخدام PCK أو الفئران SD طفلشرائح الناي المركزية التي تحتوي على حليمة لعزل غير المتوسعة-CNT / CCDsegments 18-21.
    ملاحظة: الأنسجة حليمي هي أكثر دواما من القشرة وعقد عصابات أنبوبي حليمي مع ملقط وتمزق على طول شعاعي محور شريحة يمكن المشقوق إلى قطاعات رقيقة. الأنابيب الفردية واضحة ويمكن انسحبت لتوضع على رقائق الزجاج غطاء.
  7. تحديد قطاعات CNT / CCD التي كتبها التشعبات والشفافية أعلى من الأنابيب القريبة والخلايا المرئية بشكل بارز كبيرة (الشكل 2C). وضع رقاقة غطاء زجاجي مع الأنابيب المرفقة تحت المجهر مجهزة micromanipulators مناسبة لقيادة بال micropipettes. باستخدام بال micropipettes حادة الأنابيب تقسيم مفتوحة ونعلق حوافها على الزجاج لجعل سطح القمي الوصول (الشكل 2D).

الكهربية 2. قناة واحدة التصحيح، المشبك

  1. ملء غرفة التصحيح المشبك مع حل حمام ونقل الغطاء الزجاجي رقاقةمع الأنسجة المعزولة إلى الغرفة. ضمان بال micropipettes التصحيح، المشبك لديها مقاومة 7-10 MΩ للمقاييس (الخلية المرفقة) موثوقة عن خلايا.
  2. للقياسات الخلية المرفقة، تعيين نسبة الربح مكبر للصوت ل20X والمنخفضة تمرير التيارات في 300 هرتز على فلتر من ثماني قطب بسل. للقنوات ENAC المراقبة، واستخدام محلول حمام، في ملي: 150 كلوريد الصوديوم، CaCl 2 1، 2 MgCl 2، 10 HEPES (7.4 درجة الحموضة)؛ ماصة: 140 LiCl، 2 MgCl 2 و 10 HEPES (7.4 درجة الحموضة).
  3. إجراء تجربة التصحيح، المشبك التقليدية في وضع الخلية المرفقة 10. حدد خلية في أحادي الطبقة الظهارية والاقتراب من ماصة للالغشاء القمي. شكل خاتم عالية المقاومة بين ماصة وغشاء الخلية من خلال تطبيق طيف الامتصاص. مرة واحدة يتم تشكيل مقاومة عالية ختم gigaOhm، يجب أن تبدأ بروتوكول خالية من فجوة في إمكانية عقد لنشاط الرصد للقناة المثيرة للاهتمام.
  4. البيانات قناة واحدة حرة الفجوة متجر الحالية من غيغاالأختام أوم لتحليلها لاحقا. تحليل الأحداث القناة باستخدام حزمة البرنامج الذي تم توفيره بشكل عام مع الاجهزة التصحيح، المشبك 18. حساب النشاط قناة كما NPO حيث تشير N إلى عدد من القنوات النشطة في التصحيح وP س متوسط ​​احتمال فتح القنوات.
    ملاحظة: استخدام الأكياس المعزولة أو الأنابيب في تجارب التصحيح، المشبك مدة لا تزيد عن 30 دقيقة.

3. القياسات Ratiometric Epifluorescence من جواني تركيز الكالسيوم في الخلايا الظهارية

  1. استخدام 5 ملي FURA-02:00 الذائبة في DMSO. حل سهم قسامة الفردية 500 ميكرولتر أنابيب مخروطية (حوالي 10 ميكرولتر). يحفظ بعيدا عن الضوء وتخزينها في الثلاجة عند درجة حرارة -20 مئوية لمدة تصل إلى ستة أشهر.
  2. احتضان الأكياس المعزولة والأنابيب انقسام مفتوحة لمدة 30-40 دقيقة في جهاز الأمن الوقائي (في ملي: 145 كلوريد الصوديوم، 4.5 بوكل، 2 MgCl 2، 2 CaCl 2 و 10 HEPES في درجة الحموضة 7.35) تحتوي على 5 ميكرومتر FURA-02:00 صبغ و 0.05٪ حمض pluronic للمساعدة في تفريق استرات acetoxymethyl. لذلك، الأنسجة مكان في 3.5 سم صحن يحتوي على كوكتيل تحميل، بعيدا عن الضوء واحتضان على شاكر بطيئة في درجة حرارة الغرفة.
  3. تغيير FURA-02:00 تحتوي على وسائل الإعلام لتنظيف PSS بعد الحضانة ووضع النسيج تحت المجهر لزيادة أداء التصوير epifluorescence.
  4. تشغيل كاميرا CCD ومصدر ضوء ثابت (نظام مستوحد اللون) مجهزة عجلة تصفية (كل موقف مرشح يمكن أن تترافق مع مستوى التوهين الخاص به، اختار كل مرة يتم استدعاء فلتر).
  5. العثور على الأنسجة في حقل مشرق. التبديل إلى الكشف عن إشارة مضان وضبط شدة مصدر الضوء باستخدام مرشحات الكثافة محايدة والطاقة مصباح لتجنب تشبع الإشارة.
  6. مراقبة FURA-02:00 مضان في عينات الأنسجة مع الإثارة ratiometric في 340/380 نانومتر مع تواتر 0.125 هرتز أو أعلى. استخدام 40 × / NA 1.3 أو ما شابه عدسة موضوعية لresolu السليمنشوئها الصورة.
  7. لمعالجة الصور وحسابات استيراد تسلسل الصور. تأكد لتقسيم القنوات واستخدام وضع hyperstack الرمادي. اختر العديد من المناطق ذات الاهتمام (خلايا كيس واحد أو مناطق مختارة من النسيج الكيسي) وحساب قيم الكثافة لكل قناة (340 و 380 نانومتر) في فضل برمجيات تحليل البيانات؛ طرح قيم الكثافة الخلفية من كل نقطة البيانات.
  8. لكل نقطة زمنية حساب نسبة كثافة من FURA-2:00 340-380 القنوات. مؤامرة مبعثر / خط التغييرات في الوقت نقطة من الكالسيوم 2+ عابرة لكل منطقة وحساب متوسط ​​القيم / SE.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وقد ثبت تورط محتمل في عناق تكون الكيسة من قبل العديد من الدراسات أن لوحظ تعطل عامل نمو البشرة (EGF) يشير في PKD تقدم 22-25 وغير طبيعي استيعاب الصوديوم في ARPKD نماذج الفئران والثقافات الأنسجة 26-28. على سبيل المثال، Veizis وآخرون أظهرت أن تراعي الأميلوريد نا + امتصاص وانخفاض في خلايا CD من النموذج غير orthologous الماوس BPK من ARPKD 29. نحن في الآونة الأخيرة أظهرت أن ضعف الصوديوم واستيعاب المياه في الخراجات هو عامل مهم في تفاقم ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وصفنا هنا تطبيقات التقليدية تقنية التصحيح، المشبك والتصوير epifluorescence الكالسيوم إلى الطبقات الوحيدة الظهارية الكيسي المستمدة من نموذج الجيني الفئران من ARPKD. يتكون البروتوكول من ثلاث خطوات، والتي ينبغي أن تدفع معظم الاهتمام إلى عزل الخراجات (الخطوة 1.5 من قسم البروتوكولات) والدراسات الكهربية. تتطلب هذه الإجراءات الرئيسية التدريب والصبر واسعة النطاق، ويجب أن لا يكون القارئ بالإحباط في آن واحد.

أولا وقبل كل ش...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

فإن الكتاب أود أن أشكر غلين سلوكم (كلية الطب في ويسكونسن) وكولين A. لافين (الصكوك نيكون المؤتمر الوطني العراقي) للحصول على المساعدة الفنية ممتازة مع التجارب المجهري. وأيد هذه الدراسة من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R01 HL108880 (لAS)، R01 DK095029 (لOPO) وK99 HL116603 (لTSP)، المؤسسة الوطنية للكلى IG1724 (لTSP)، وجمعية القلب الأميركية 13GRNT16220002 (لOPO) و وJ. زمالة بن Lipps البحوث من الجمعية الأمريكية لأمراض الكلى (لDVI).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Fura-2 AMLife TechnologiesF-14185
Fluo-8AAT Bioquest21091
Poly-L-lysineSigma-AldrichP4707
حمض البلورونيكسيجما ألدريتشF-68   ؛حل
شاكرBoekel Scientific260350
مصدر الضوءSutter Instrument CoLambda XLمع سائق عجلة مصراع / مرشح متكامل
مرشحات كثافة محايدةنيكونND4 ، ND8
الموضوعنيكونSFluo   ؛40 / 1.3 DIC WD 0.22   ؛   كاميرا زيلية
Andor TechnologiesZyla sCMOS
Nikon  مجهر (مقلوب)نيكوننيكون Eclipse TE2000-S
غطاء زجاجيThermo Scientific6661B52
قلم رصاص الماسفيشر Scientific22268912
الحصول على الصوربرنامج نيكوننيكون NIS-Elements 
يسمح البرنامجImageJhttp://imagej.nih.gov/ND Utility باستيراد الصور بتنسيق Nikon Instruments الأصلي .nd2
غرفة التسجيل / الترويةWarner InstrumentsRC-26
Patch Clamp مكبر للصوتالأجهزة الجزيئيةMultiClamp 700B
الحصول على البياناتالأجهزة الجزيئيةDigidata 1440AAxon Digidata & reg ؛ نظام
مرشح التمرير المنخفضWarner InstrumentsLPF-88 أقطاب Bessel
البورسليكات الشعريةالزجاجية World Precision Instruments1B150F-4
Micropipette PullerSutter Instrument CoP-97Flaming / Brown نوع مجتذب الماصات
الدقيقة MicroforgeNarishigeMF-830اليابان
بمحركات MicromanipulatorSutter Instrument CoMP-225
مجهر مقلوبنيكونEclipse Ti
طاولة عزل الاهتزازالدقيق TMCمجهزة بقفص فاراداي
نظام نضح الصمامات متعدد القنواتAutoMake ScientificValve Bank II
غرفة التسجيل / الترويةبرنامج Warner InstrumentsRC-26
الأجهزة الجزيئيةpClamp 10 . 2
الجدول الجراحي الذي يتم التحكم فيه في درجة الحرارة   ;MCW الأساسيةللقوارض مجهر
نيكونSMZ745
نظام التروية القائم على مضخةالحقنة هارفارد
أنابيب البولي إيثيلينجهاز هارفارد سيجما ألدريتشPE50
تخدير الأيزوفلورانhttp://www.vetequip.com/< / أ >911103
الكواشف الأساسية الأخرىسيجما ألدريتش
المساعد نظام مجهر

المراجع

  1. Torres, V. E., Harris, P. C., Pirson, Y. Autosomal dominant polycystic kidney disease. Lancet. 369 (9569), 1287-1301 (2007).
  2. Zhang, M. Z., et al. PKHD1 protein encoded by the gene for autosomal recessive polycystic kidney disease associates with basal bodies and primary cilia in renal epithelial cells. Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 101 (8), 2311-2316 (2004).
  3. Chang, M. Y., et al. Haploinsufficiency of Pkd2 is associated with increased tubular cell proliferation and interstitial fibrosis in two murine Pkd2 models. Nephrol. Dial. Transpl. 21 (8), 2078-2084 (2006).
  4. Park, F., Sweeney, W. E., Jia, G., Roman, R. J., Avner, E. D. 20-HETE mediates proliferation of renal epithelial cells in polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (10), 1929-1939 (2008).
  5. Huang, J., Woolf, A., Long, D. Angiogenesis and autosomal dominant polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 28 (9), 1749-1755 (2013).
  6. Wilson, P. D. Apico-basal polarity in polycystic kidney disease epithelia. Bioch Biophys Acta. 1812 (10), 1239-1248 (2011).
  7. Wilson, P. D. Epithelial cell polarity and disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 272 (4 Pt 2), F434-F442 (1997).
  8. Wilson, P. D., et al. Reversed polarity of Na(+) -K(+) -ATPase: mislocation to apical plasma membranes in polycystic kidney disease epithelia. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 260 (3 pt 2), F420-F430 (1991).
  9. Murcia, N. S., Sweeney, W. E., Avner, E. D. New insights into the molecular pathophysiology of polycystic kidney disease. Kidn. Intern. 55 (4), 1187-1197 (1999).
  10. Pavlov, T. S., Levchenko, V., Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Staruschenko, A. Impaired epithelial Na+ channel activity contributes to cystogenesis and development of autosomal recessive polycystic kidney disease in PCK rats. Ped. Res. 77 (1), 64-69 (2014).
  11. Siroky, B. J., et al. Loss of primary cilia results in deregulated and unabated apical calcium entry in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 290 (6), F1320-F1328 (2006).
  12. Hovater, M. B., et al. Loss of apical monocilia on collecting duct principal cells impairs ATP secretion across the apical cell surface and ATP-dependent and flow-induced calcium signals. Purin. Signal. 4 (2), 155-170 (2008).
  13. Zaika, O., et al. TRPV4 Dysfunction Promotes Renal Cystogenesis in Autosomal Recessive Polycystic Kidney Disease. J. Am. Soc. Nephrol. 24 (4), 604-616 (2013).
  14. Rohatgi, R., et al. Mechanoregulation of intracellular Ca2+ in human autosomal recessive polycystic kidney disease cyst-lining renal epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 294 (4), F890-F899 (2008).
  15. Xu, C., et al. Attenuated, flow-induced ATP release contributes to absence of flow-sensitive, purinergic Cai2+ signaling in human ADPKD cyst epithelial cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 296 (6), F1464-F1476 (2009).
  16. Katsuyama, M., Masuyama, T., Komura, I., Hibino, T., Takahashi, H. Characterization of a novel polycystic kidney rat model with accompanying polycystic liver. Exp. Animals. 49 (1), 51-55 (2000).
  17. Ilatovskaya, D., Staruschenko, A. Single-channel analysis of TRPC channels in the podocytes of freshly isolated glomeruli. Methods Mol. Biol. 998, 355-369 (2013).
  18. Pavlov, T. S., et al. Deficiency of renal cortical EGF increases ENaC activity and contributes to salt-sensitive hypertension. J. Am. Soc. Nephrol. 24, 1053-1062 (2013).
  19. Mironova, E., Bugay, V., Pochynyuk, O., Staruschenko, A., Stockand, J. Recording ion channels in isolated, split-opened tubules. Methods Mol. Biol. 998, 341-353 (2013).
  20. Pavlov, T. S., et al. Endothelin-1 inhibits the epithelial Na+ channel through betaPix/14-3-3/Nedd4-2. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (5), 833-843 (2010).
  21. Sun, P., et al. High Potassium Intake Enhances the Inhibitory Effect of 11,12-EET on ENaC. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (10), 1667-1677 (2010).
  22. Zheleznova, N. N., Wilson, P. D., Staruschenko, A. Epidermal growth factor-mediated proliferation and sodium transport in normal and PKD epithelial cells. Biochim. Biophys. Acta. 1812 (10), 1301-1313 (2011).
  23. Sweeney, W. E., von Vigier, R. O., Frost, P., Avner, E. D. Src inhibition ameliorates polycystic kidney disease. J. Am. Soc. Nephrol. 19 (7), 1331-1341 (2008).
  24. Sweeney, W. E., Avner, E. D. Functional activity of epidermal growth factor receptors in autosomal recessive polycystic kidney disease. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 275 (3 Pt 2), F387-F394 (1998).
  25. Orellana, S. A., Sweeney, W. E., Neff, C. D., Avner, E. D. Epidermal growth factor receptor expression is abnormal in murine polycystic kidney. Kidn. Intern. 47 (2), 490-499 (1995).
  26. Rohatgi, R., et al. Cyst fluid composition in human autosomal recessive polycystic kidney disease. Ped. Nephrol. 20 (4), 552-553 (2005).
  27. Rohatgi, R., Greenberg, A., Burrow, C. R., Wilson, P. D., Satlin, L. M. Na transport in autosomal recessive polycystic kidney disease (ARPKD) cyst lining epithelial cells. J. Am. Soc. Nephrol. 14 (4), 827-836 (2003).
  28. Olteanu, D., et al. Heightened epithelial Na+ channel-mediated Na+ absorption in a murine polycystic kidney disease model epithelium lacking apical monocilia. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 290 (4), C952-C963 (2006).
  29. Veizis, I. E., Cotton, C. U. Abnormal EGF-dependent regulation of sodium absorption in ARPKD collecting duct cells. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 288 (3), F474-F482 (2005).
  30. Wilson, P. D. Polycystic kidney disease. NEJM. 350 (2), 151-164 (2004).
  31. Hillman, K. A., et al. P2X(7) receptors are expressed during mouse nephrogenesis and in collecting duct cysts of the cpk/cpk mouse. Exp. Nephrol. 10 (1), 34-42 (2002).
  32. Turner, C. M., Ramesh, B., Srai, S. K., Burnstock, G., Unwin, R. J. Altered ATP-sensitive P2 receptor subtype expression in the Han:SPRD cy/+ rat, a model of autosomal dominant polycystic kidney disease. Cells Tissues Organs. 178 (3), 168-179 (2004).
  33. Hillman, K. A., et al. The P2X7 ATP receptor modulates renal cyst development in vitro. Biochem. Biophys. Res. Commun. 322 (2), 434-439 (2004).
  34. Wilson, P. D., Hovater, J. S., Casey, C. C., Fortenberry, J. A., Schwiebert, E. M. ATP release mechanisms in primary cultures of epithelia derived from the cysts of polycystic kidneys. J. Am. Soc. Nephrol. 10 (2), 218-229 (1999).
  35. Schwiebert, E. M., et al. Autocrine extracellular purinergic signaling in epithelial cells derived from polycystic kidneys. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 282 (4), F763-F775 (1152).
  36. Stockand, J. D., et al. Purinergic inhibition of ENaC produces aldosterone escape. J. Am. Soc. Nephrol. 21 (11), 1903-1911 (2010).
  37. Pochynyuk, O., et al. Paracrine Regulation of the Epithelial Na+ Channel in the Mammalian Collecting Duct by Purinergic P2Y2 Receptor Tone. J. Biol. Chem. 283 (52), 36599-36607 (2008).
  38. Zaika, O., Mamenko, M., Boukelmoune, N., Pochynyuk, O. IGF-1 and insulin exert opposite actions on ClC-K2 activity in the cortical collecting ducts. Am. J. Physiol. Renal Physiol. 308 (1), F39-F48 (2015).
  39. Lalo, U., Pankratov, Y., Kirchhoff, F., North, R. A., Verkhratsky, A. NMDA receptors mediate neuron-to-glia signaling in mouse cortical astrocytes. J. Neurosci. 26 (10), 2673-2683 (2006).
  40. Lalo, U., Andrew, J., Palygin, O., Pankratov, Y. Ca2+-dependent modulation of GABAA and NMDA receptors by extracellular ATP: implication for function of tripartite synapse. Biochem. Soc. Trans. 37 (Pt 6), 1407-1411 (2009).
  41. Li, D., et al. Inhibition of MAPK stimulates the Ca2+ -dependent big-conductance K channels in cortical collecting duct). Proc. Nat. Acad. Sci U.S.A. 103 (51), 19569-19574 (2006).
  42. Bugaj, V., Mironova, E., Kohan, D. E., Stockand, J. D. Collecting duct-specific endothelin B receptor knockout increases ENaC activity. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 302 (1), C188-C194 (2012).
  43. Pavlov, T. S., et al. Regulation of ENaC in mice lacking renal insulin receptors in the collecting duct. FASEB J. 27 (7), 2723-2732 (2013).
  44. Gleason, C. E., et al. mTORC2 regulates renal tubule sodium uptake by promoting ENaC activity. J. Clin. Invest. 125 (1), 117-128 (2015).
  45. Frindt, G., Palmer, L. G. Acute effects of aldosterone on the epithelial Na channel in rat kidney. Am. J. Physiol. Renal Physiol. , (2015).
  46. Ilatovskaya, D. V., et al. Angiotensin II has acute effects on TRPC6 channels in podocytes of freshly isolated glomeruli. Kidn. Int. 86 (3), 506-514 (2014).
  47. Ilatovskaya, D. V., Palygin, O., Levchenko, V., Staruschenko, A. Pharmacological characterization of the P2 receptors profile in the podocytes of the freshly isolated rat glomeruli. Am. J. Physiol. Cell Physiol. 305 (10), C1050-C1059 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

تنفيذ المشبك التصحيح وايف مضان المجهر لرصد خصائص الوظيفية للالمعزولة حديثا PKD الظهارة
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.