مقالة منهجية

Microdialysis التحقيق التصميم حسب الطلب

DOI:

10.3791/53048

⸱

يوليو 21, 2015

 ,  ,  ,  , 
1Department of Pharmacology, Goethe University of Frankfurt, 2Department of Pharmaceutical Chemistry, Goethe University of Frankfurt, 3Department of Clinical Pharmacology, Goethe University of Frankfurt

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialysis هو أسلوب يستخدم عادة في البحوث الأعصاب. لذا تحقيقات تجارية هي في demand.In عظيم هذا العمل أوضح التجمع التحقيق في التفاصيل لبناء موثوق بها، متحدة المركز، حسب الطلب microdialysis التحقيق لأقل من 10 دولارا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialysis هو أسلوب يستخدم عادة في البحوث الأعصاب. لذا تحقيقات تجارية هي في الطلب الكبير لرصد التغيرات الفسيولوجية، الدوائية والمرضية في السائل المخي الشوكي. لسوء الحظ، تحقيقات تجارية غالية للمجموعات البحثية في المؤسسات العامة. في هذا العمل، وأوضح التجمع التحقيق في التفاصيل لبناء موثوق بها، متحدة المركز، حسب الطلب microdialysis التحقيق لأقل من 10 دولارا. يتكون التحقيق microdialysis من غشاء polysulfone مع الجزيئي قطع 30 كيلو دالتون. التحقيق في المختبر يتم مقارنة المبالغ المستردة من المواد مع مختلف الوزن الجزيئي (في نطاق 100-1،600 دا) والخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة. التحقيق غلة الانتعاش في المختبر ما يقرب من 20٪ للمركبات الصغيرة الجلوكوز، اللاكتات، الأستيل كولين وATP. في المختبر المبالغ المستردة للنيوروببتيد مع الوزن الجزيئي بين 1،000-1،600 دا المبلغ 2-6٪. وهكذا، في حين أن ث الجزيئي العاليثمانية من نيوروببتيد خفضت في القيم الانتعاش المختبر، غسيل الكلى من المركبات في النطاق الأدنى (ما يصل إلى 500 دا) ذات وزن جزيئي لا يوجد لديه تأثير كبير على معدل الاسترداد في المختبر. هذا الأسلوب يسمح استخدام غشاء غسيل الكلى مع غيرها من قيمة قطع والمواد الغشاء. لذلك، هذا التجمع التحقيق حسب الطلب لديها ميزة المرونة الكافية لdialyze المواد في نطاق الوزن الجزيئي واسع. هنا، ونحن نقدم التحقيق microdialysis مع طول تبادل 2 مم، الذي ينطبق على microdialysis في مناطق مخ الفأر والجرذ. ومع ذلك، أبعاد التحقيق يمكن بسهولة أن تتكيف لفترات تبادل أكبر لاستخدامها في الحيوانات الكبيرة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microdialysis هو أسلوب يستخدم عادة في البحوث الأعصاب. خلال السنوات ال 50 الماضية، تم تقنية microdialysis الحد الأدنى الغازية تحسنت بشكل مستمر لتصبح وسيلة راسخة لمراقبة التركيزات المحلية في مركبات صغيرة الوزن الجزيئي في الفضاء خارج الخلية. تقريبا كل السائل الخلالي الأنسجة يمكن التحقيق في الحيوانات التحرك بحرية.

عرض Gaddum تقنية دفع سحب في 1960s. انه تعديل النهج من فيلدبرج آخرون في الذي perfused لتوبوكورارين من خلال قنية تنتهي في البطين الجانبي وجمع النفايات السائلة أيضا عن طريق قنية 1. وضعت Gaddum تقنية دفع سحب التي تم زرعها قنية تتكون من اثنين من الإبر الصلب متحدة المركز في مناطق الدماغ متميزة وperfused لبحل أثناء إزالة في وقت واحد مع الناقلات التي تفرز من الخلايا العصبية المحيطة طرف 2. للأسف، دارنا الأنسجةجنرال الكتريك التي تسببها قنية حول الطرف يقتصر تطبيق هذا الأسلوب. ونتيجة لتحقيق مزيد من التقدم هذا الأسلوب، قدم بيتو وزملاء العمل وطريقة كيس غسيل الكلى التي تم فصلها الحل التي تم جمعها من الأنسجة المحيطة بغشاء غسيل الكلى. أنها مزروع كيس غسيل الكلى في الأنسجة تحت الجلد من رقاب الكلب. محتوى كيس غسيل الكلى هو خالية من البروتين ويمكن تحليلها في وقت لاحق عدة أسابيع للأيونات والأحماض الأمينية 3. وكان التطور القادمة dialytrode، تحقيقا microdialysis البدائي، الذي كان في الأصل وصفها دلغادو في عام 1972 (4). وأخيرا، Ungerstedt وزملاؤه تحسين تصميم microdialysis التحقيق حتى أنه كان أصغر حجما وأقل النازحين الأنسجة 5.

مسبار microdialysis متحدة المركز بشكل مشابه لأحد الشعرية الدموية. وperfused لنظام باستمرار حلا يضم التركيب الايوني من السائل الأنسجة المحيطة بها في حين تفتقر إلى تحليلها من الفائدة. عشرغشاء ه غسيل الكلى تتعرض لحل خارجي أو الأنسجة شبه منفذ. ويسمح الانتشار السلبي من المواد في التحقيق على طول التدرج تركيزهم 6. نفاذية تعتمد على العديد من المتغيرات مثل الوزن الجزيئي، والشكل، وتهمة والرقم الهيدروجيني للمجمع. يقتصر أيضا أنه نظرا لخصائص المواد الغشاء، المسام حجم الغشاء ومعدل 7 التدفق.

أرقام 1 و 2 تظهر التحقيق microdialysis متحدة المركز. يدخل السائل نضح عن طريق أنابيب مدخل إلى كم المعادن التي تحيط السيليكا تنصهر فيها. داخل الغلاف المعدني، وتيارات أسفل على طول السيليكا تنصهر ويترك على طرفها. في المسافة بين غشاء غسيل الكلى وتترافلوروإيثيلين (PTFE) -tubing (مثل تفلون) ثم يتدفق السائل نضح أعلى. هنا، نشر المواد من الأنسجة التي تحيط يحدث الغشاء. وديالة أوراق التحقيق من خلال PTFE-الأنابيب، والتي يتم توصيلها إلى منفذ الأنابيب ويمكن جمعها.

تقنية microdialysis ديها العديد من المزايا النسبية إلى الآخر في تقنيات الجسم الحي. يشكل لجنة التحقيق حاجز مادي وكانت النتيجة التي تحتوي على ديالة لا الإنزيمات أو الخلايا. لذلك، ليست هناك حاجة لتنقية شطافة قبل التحليل، وأي تدهور الأنزيمي في التحاليل تأخذ مكان. يمكن أن يحدث تدهور الأكسدة أثناء مرور التحاليل في الأنبوب، ولكن هذا غالبا ما يمكن الوقاية منها عن طريق إضافة مضادات الأكسدة (مثل حمض الاسكوربيك) إلى الإرواء. بدلا من ذلك، من الضرر التأكسدي للنيوروببتيد، على سبيل المثال، تم قمعها بشكل فعال من خلال استبدال أنابيب منفذ مع طرف لجمع ديالة 8. وديالة يمكن التحقيق مباشرة مع ما يقرب من أي نوع من الطريقة التحليلية ويمكن جمع التحاليل متعددة في وقت واحد. هذا النظام يمكن استخدامه في الحيوانات المستيقظة، وتقريبا كل مناطق الدماغ يمكن أن يكونفحصها. وعلاوة على ذلك، ضخ المخدرات من خلال التحقيق هو ممكن (retrodialysis). ومع ذلك، هناك أيضا قيود تقنية microdialysis. لا يوفر القرار مرة منخفضة إلى حد ما المعلومات في الوقت الحقيقي فيما يتعلق بالتغييرات العصبي. لأنه هو أسلوب الغازية، التحقيق غرس يسبب الصدمة الجراحية والتخدير، والتي يمكن أن تؤثر على تركيزات الناقلات العصبية، مطلوب خلال هذه الخطوة 7،9،10.

تركيز مركب في ديالة يضم سوى كمية صغيرة من تركيز مركب الفعلي في السائل خارج الخلية. لحساب تركيز مركب غير معروف في السائل خارج الخلية، نسبة الانتعاش في المختبر أن يتم حسابها. تقرير من قريب الفردية في التعافي المختبر لكل التحقيق وكل مركب ضروري قبل بدء التجربة في الجسم الحي. لهذا الغرض، وانخفض التحقيق في محلول يحتوي علىالحليلة من الفائدة في حين أن السائل نضح هو نفس الحل تفتقر إلى تحليلها من الفائدة. بعد تحديد التركيزات مجمع في ديالة، هذه البيانات لابد من الإشارة إلى تركزها في السائل المحيط. يمكن تنفيذها في المختبر قرارات التعافي من عدة مواد في وقت واحد 9.

العديد من المجموعات البحثية علم الأعصاب تستخدم تقنية microdialysis للتحقيق في الناقلات العصبية ونواتج الأيض في الفضاء خارج الخلية من مناطق الدماغ متميزة. وبالتالي، تحقيقات تجارية هي في الطلب الكبير في البيئة البحثية الأعصاب. وهناك ميزة كبيرة للتحقيقات المتاحة تجاريا هي الموثوقية وظيفية عالية. وراسخة التجريبية مجموعة المتابعة للتحقيقات تجارية والتحقق من صحتها للعديد من الناقلات العصبية المعروفة والأيض. ومع ذلك، في حين أن المعدات microdialysis المتاحة تجاريا مكلفة ولديها مرونة أقل في التطبيق 11، في الهو العمل وقدم التجمع microdialysis التحقيق في التفاصيل، والتي يمكن أن تتكيف مع أي تطبيق ويمكن تصنيعها لأقل من 10 دولارا. هذا التحقيق حسب الطلب هو microdialysis التحقيق متحدة المركز اختبار للتحقيقات في مناطق المخ المختلفة 8.

في استرداد التحقيق في المختبر من مواد مختلفة مع الوزن الجزيئي (مجموعة من 100-1،600 دا) وتتم مقارنة مع الخصائص الفيزيائية والكيميائية المختلفة. في المختبر تقرير التعافي من الجلوكوز، اللاكتات وأستيل مع الوزن الجزيئي أقل من 200 دا، ATP مع الوزن الجزيئي من يتم تنفيذ ما يقرب من 500 دا وأنجيوتنسين نيوروببتيد الثاني، مادة P والسوماتوستاتين ذات وزن جزيئي فوق 1000 دا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد PTFE-الأنابيب

  1. تقصير PTFE-الأنابيب إلى 2.5 سم قطعة. استخدام ورقة على نطاق وتقدير الأبعاد المادية. (انظر الشكل 3A)
  2. قطع النهاية واحد في زاوية لتسهيل توصيل الأنابيب منفذ. (انظر الشكل 3A)
  3. خشن PTFE-الأنابيب عن طريق استخدام الصنفرة للسماح التمسك الغراء الايبوكسي.

2. إعداد تنصهر السيليكا

  1. تقصير السيليكا تنصهر فيها إلى 2.25 سم قطعة. (انظر الشكل 3A)

3. إدراج وتنصهر السيليكا في PTFE-الأنابيب

  1. إدراج 30 G قنية في الألياف PTFE جوفاء لاختراق ذلك على مسافة 1 سم من نهاية مسطحة. ثني PTFE-أنابيب لتبسيط العملية. (انظر الشكل 3B)
  2. إدراج السيليكا تنصهر في PTFE-الأنابيب باستخدام قنية والتوجيه. (انظر الشكل 3C)
  3. بلطف إزالة قنية وتأمين السيليكا تنصهر فيها. (انظرالشكل 3D)
  4. ومن المفترض أن السيليكا تنصهر فيها على إبراز 5 ملم في نهاية مسطحة. (انظر الشكل 3E)
  5. الغراء السيليكا تنصهر في مكان في موقع ثقب بواسطة الغراء cyanoacrylate واتركه حتى تتصلب خلال الليل. (انظر الشكل 3E)

4. إعداد الايبوكسي الغراء (اثنان مكون الغراء)

  1. إضافة 30 أجزاء من تصليب الأصفر إلى 70 أجزاء من الأسود الغراء الايبوكسي عن طريق مساعدة من إبرة رفيعة وتخلط برفق. انها مستعدة لاستخدام مباشرة.

5. تطبيق غشاء (جميع خطوات أخرى يجب أن تتم تحت المجهر، ويستخدم ورقة مقياس لتقدير الأبعاد المادية)

  1. سحب الغشاء polysulfone بعناية على مدى السيليكا تنصهر فيها، ثم سحب الغشاء في PTFE-الأنابيب وضبط الغشاء إلى 5.5 مم باستخدام مشرط حاد. (انظر الشكل 3F)
  2. تعيين نقطة وسم على الغشاء بالقلم بشكل جيد لتحديد طول تبادل 2 مممن نهاية الغشاء.
  3. تنطبق على كمية صغيرة من الغراء الايبوكسي لتغطية غيض من غشاء بمساعدة إبرة رفيعة. (انظر الشكل 3G)
  4. إغلاق المشترك بين غشاء غسيل الكلى والألياف PTFE بواسطة مساعدة من نفس إبرة رفيعة المستخدمة في الخطوة 5.3) مع الغراء الايبوكسي. (انظر الشكل 3G)
  5. إضافة ما يكفي من الغراء الايبوكسي على الغشاء وصولا إلى النقطة بمناسبة لضمان طول تبادل 2 مم. السماح لتتصلب خلال الليل. (انظر الشكل 3G) قبل تحديد طول الصرف، والغشاء هو 5.5 مم. بعد تطبيق الغراء الايبوكسي على الغشاء، فقط 2 ملم من الغشاء متاح للنشر.

6. تطبيق كم المعادن

  1. قطع إبرة 25 G إلى 1 سم قطع الأكمام المعدنية بنسبة مساعدة من كماشة الانحناء.
  2. سحب 1 سم كم المعادن (25 G) على الجزء المتبقي من السيليكا تنصهر فيها. كم المعادن تمكن في وقت لاحق ربط أنابيب مدخل مع MICRODIAتحلل التحقيق. (انظر الشكل 3H)
  3. ختم مشتركة بين كم المعادن وPTFE-الأنابيب مع الغراء الايبوكسي المتبقية. السماح لتتصلب لا يقل عن 24 ساعة. (انظر الشكل 3I)
  4. تطبيق الغراء الساخن حول التشعب لجنة التحقيق لتثبيت إضافية وتحقيق الاستقرار.
    ملاحظة: وحدة التخزين الداخلية مدخل لجنة التحقيق هي 0.045 ميكرولتر وحجمها الداخلي منفذ 2.5 ميكرولتر. لذلك، مع معدل التدفق من 1 ميكرولتر / دقيقة، فإنه يأخذ ما يقرب من 2.5 دقيقة بعد توصيل أنبوب مدخل لبدء جمع من ديالة. مع هذا البروتوكول، وإجراءات التحقيق التجمع غلة تحقيقات microdialysis التي هي 95٪ موثوق بها.

7. أداء التجارب في المختبر الانتعاش

  1. تراجع التحقيق مع قطع من 30 كيلو دالتون وطول تبادل 2 ملم الى حل سهم المؤلفة من ACSF تحتوي على 1 الجلوكوز ملي و 1 ملي اللاكتات و، في تجربة منفصلة، ​​إلى CSF تحتوي على 100نانومتر ATP و 100 نانومتر أستيل.
  2. يروي تحقيقات مع ACSF. ضبط معدل تدفق إلى 1 ميكرولتر / دقيقة وإجراء التجارب في درجة حرارة الغرفة (22 ° C). السماح للتحقيقات لكي تتوازن لمدة 1 ساعة في المحلول، وجمع عينات كل 30 دقيقة بعد ذلك وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى قياس.
  3. لحساب في المختبر المستردة، مقارنة تركيزات التحاليل في dialysates مع تركيز الحليلة المعروفة في المحلول. التعبير عن النتائج كنسبة مئوية من تركيز مادة في ديالة مقابل حل سهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتكون حسب الطلب متحدة المركز microdialysis التحقيق في غشاء polysulfone مع الجزيئي قطع 30 كيلو دالتون. ويتضح من التجمع التحقيق في الشكل (3).

انها عرضت الانتعاش في المختبر لالجلوكوز الأيض الطاقة الصغيرة (180.16 دا) واللاكتات (112.06 دا) من 19،10 ± 1.2٪ و 21.2 ± 1.6٪، على التوالي. للأستيل كولين موجبة الشحنة ذات وزن جزيئي من 181.66 دا، فإنه أظهر في المختبر قيمة استرداد 22.6 ± 1.4٪. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 3 تجميع التحقيق المثالي. وقد لوحظ أن الصحيحة أبعاد قطرها الداخلي والخارجي بشكل وثيق للأنابيب (OD 1.6 مم؛ ID 350 ميكرون)، والسيليكا تنصهر (OD 105 ميكرون، ID 40 ميكرون)، وغشاء غسيل الكلى (OD 245 ميكرون، ID 210 ميكرون). ومن المهم أيضا للحفاظ على المسافة بين الغشاء والسيليكا تنصهر من (105 ميكرون)، وبين الغشاء وأنابيب (105 ميكرون) كذلك. إذا كانت القيم تختلف، والضغط في التحقيق يمكن أن يرتفع ويؤدي إلى تسرب الغشاء.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون ممتنون ل G. Barka (SunChrom GmbH ، Friedrichsdorf ، ألمانيا) لدعمه وتوفير غراء الإيبوكسي. علاوة على ذلك ، يقر المؤلفون بشركة Fresenius Medical Care (باد هومبورغ ، ألمانيا) لتوريد فلتر الهيموديافلتر الشعري FXCorDiax. تم الحصول على التمويل من جامعة جوته في فرانكفورت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الغراء الايبوكسيSunChrom GmbH ، Fiedrichsdorf ، ألمانيا  ؛    
معرف السيليكا المنصهرة 40 & micro ؛ م OD 105 & مZiemer-Chromatographie, مانهايم, ألمانياالفن. رقم: 6.040105
غشاء البولي سلفون (مرشح غسيل الكلى FX Cor Diax 600)Fresenius Medical Care AG & Co. KGaA ، باد هومبورغ ، ألمانياالمرجع: F00001593
غراء سياناكريلات (Pattex & reg ؛ بلاستيك بالغراء الفائق)Henkel AG & Co. KGaA ، D & uuml ؛ سلدورف ، ألمانيا
أنابيب تفلون 1.6 × 0.35 ممSunChrom & reg ؛ GmbH ، فريدبرغ ، ألمانياالفن. رقم: 969-195.219
مشرط (ريشة & ريج; الشفرة الجراحية رقم 10)pfm الطبية ag ، كولونيا ، ألمانياالفن. الرقم: 07310
المجهرMEIJI Techno EMZ-8TR
30 جم × 11 بوصة (0.3 × 25 مم) قنية   ؛ Sterican® ZB.Braun Melsungen AG ، Melsungen ، ألمانياالمرجع: 9324500
25 جم × 11/2 بوصة (0.5 × 40 مم) قنية 100 Sterican & reg ؛B.Braun Melsungen AG ، Melsungen ، ألمانياالمرجع: 9186166
قلم ناعم (نقطة Stabilo 88 دقيقة 0.4)Schwan-STABILO Schwanh & auml ؛ uß er GmbH & شركة KGArt. رقم: 88/36
غراء ساخن  (عصي الغراء ULTRA Power × 11 مم)شتاينل & ريج; GmbH ، Herzebrock - Clarholz ، ألمانياالفن. لا: 4007841046910
ورق الصنفرة P60 230 × 280Robert Bosch GmbH, Gerlingen-Schillerhö هو ، ألمانيارقم الكتالوج: 2608605397

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Feldberg, W., Malcom, J. Experiments on the site of action of tubocurarine when applied via the cerebral ventricles. J Physiol. 149, 58-77 (1959).
  2. Gaddum, J. H. Push-pull cannulae. J Physiol. 155 (1 P), (1961).
  3. Bito, L., Davson, H., Levin, E., Murray, M., Snider, N. The concentrations of free amino acids and other electrolytes in cerebrospinal fluid, in vivo dialysate of brain, and blood plasma of the dog. J Neurochem. 13 (11), 1057-1067 (1966).
  4. Delgado, J. M., Lerma, J., Martín del Río, R., Solís, J. M. Dialytrode technology and local profiles of amino acids in the awake cat brain. J Neurochem. 42 (5), 1218-1228 (1984).
  5. Ungerstedt, U., Pycock, C. Functional correlates of dopamine neurotransmission. Bull Schweiz Akad Med Wiss. 30 (1-3), 44-55 (1974).
  6. Ungerstedt, U. Microdialysis--principles and applications for studies in animals and man. J Intern Med. 230 (4), 365-373 (1991).
  7. Bourne, J. A. Intracerebral microdialys: 30 years as a tool for the neuroscientist. Clin Exp Pharmacol Physiol. 30 (1-2), 16-24 (2003).
  8. Lietsche, J., Gorka, J., Hardt, S., Karas, M., Klein, J. Self-built microdialysis probes with improved recoveries of ATP and neuropeptides. J Neurosci Methods. 237, 1-8 (2014).
  9. Chefer, V. I., Thompson, A. C., Zapata, A., Shippenberg, T. S. Overview of Brain Microdialysis. Curr Protoc Neurosci. 7, Unit 7.1(2009).
  10. Neurochem, J. Brain Microdialysis. J. Neurochem. 52 (6), 1667-1679 (1989).
  11. Jolly, D., Vezina, P. In vivo microdialysis in the rat: low cost and low labor construction of a small diameter, removable, concentric-style microdialysis probe system. J Neurosci Methods. 68 (2), 259-267 (1996).
  12. Sumbria, R., Klein, J., Bickel, U. Acute depression of energy metabolism after microdialysis probe implantation is distinct from ischemia-induced changes in mouse brain. Neurochem Res. 36, 109-116 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Custom Microdialysis ProbePolysulfone MembranePTFE TubingFused SilicaEpoxy GlueMetal SleeveIn Vitro RecoveryMolecular Weight CutoffExchange LengthNeuropeptide Detection

مقالات ذات صلة