واحدة جزيء مضان المجهر على مستو المعتمدة طبقات ثنائية

ملخص

يظهر هنا تحضير طبقات دهنية مستوية مدعومة بالزجاج المستوي الوظيفي ، وتحديد حركة البروتين داخل وقياس كثافة البروتين. تم تحديد خارطة طريق لبناء مجهر انعكاس داخلي إجمالي منخفض الضوضاء ، مما يسمح بتصور الفلوروكروم المقيم في طبقة ثنائية الطبقة بدقة زمانية مكانية عالية.

الملخص

في غضون عقد واحد ، تغير الفحص المجهري لجزيء واحد من كونه مجالا منعزل يتقاسمه فقط الفيزيائيون الذين لديهم خلفية قوية في البصريات وفيزياء الليزر إلى تخصص يتمتع الآن باهتمام حيوي من قبل علماء الحياة من جميع الأماكن ¹. وذلك لأن التصوير بجزيء واحد لديه إمكانات فريدة للكشف عن سلوك البروتين في الموقع في الخلايا الحية والكشف عن التنظيم الخلوي بدقة غير مسبوقة أقل من حد الحيود للضوء ^{المرئي 2}. تعد الطبقات الدهنية المستوية المدعومة بالزجاج (SLBs) أداة قوية لجعل الخلايا التي تنمو في التعليق على مقربة كافية من الشريحة الزجاجية بحيث يمكن تصويرها بسهولة في وضع الإضاءة الداخلية الكلية 3^،4 منخفض الضوضاء. إنها مفيدة جدا لدراسة ديناميكيات البروتين في الأحداث المرتبطة بغشاء البلازما المتنوعة مثل تكوين التلامس بين الخلية والخلية ، والالتقام الخلوي ، وإفراز الخلايا ، والتعرف المناعي. يتم تقديم إجراءات بسيطة حول كيفية توليد SLBs وظيفية عالية الحركة للبروتين بطريقة قابلة للتكرار ، وكيفية تحديد حركة البروتين داخل وكيفية قياس كثافة البروتين باستخدام الكشف عن الجزيء الفردي. يتم توضيح كيفية إنشاء نظام مجهر أحادي الجزيء فعال من حيث التكلفة مع قدرات إضاءة TIRF وكيفية تشغيله في التجربة.

المقدمة

يمكن فهم الآليات التي بروتينات الغشاء الوفاء وظيفتها الخلوية غالبا ما تكون مهمة صعبة، لأنه غالبا ما يتم تعريف وسائط عملها عن طريق التفاعلات تقارب منخفضة، مما يصعب اكتشاف وتقييم منهجيات الكيميائية الحيوية التقليدية. بروتينات الغشاء قد علاوة على ذلك يتم التخصيب في مجالات محددة غشاء ^5،6 أو تشكيل هياكل النظام أعلى ديناميكية، والتي يمكن من حيث المبدأ تغيير نشاطها البيولوجي ^7.

وبالتالي غير الغازية بمساعدة الليزر مضان جزيء واحد المجهر أصبحت منهجية اختيار لدراسة السلوك البروتين في البيئات الخلوية المعقدة. هذا هو على وجه الخصوص ينطبق على العمليات الكيميائية الحيوية التي تحدث في الغشاء البلازمي، وهذه يمكن من حيث المبدأ يمكن رصدها في خفض الضوضاء التأمل الداخلي الكلي (TIRF) واسطة. هنا عينة الإضاءة تقتصر على ما يصل إلى 200 نانومتر شريحة رقيقة على مقربة من كوب سوrface، مما يؤدي إلى خسارة كبيرة في الخلفية الخلوية، ونظرا لخصائص ضوء الإثارة زائل، وأيضا في زيادة كبيرة في مضان كثافة إشارة ^8،9. كلا جوانب مهمة عندما تهدف لقرار الموضعية والزمانية عالية في الكشف عن جزيء واحد.

مستو SLBs لا تتوافق فقط مع TIRF المجهري. عندما functionalized مع يغاندس المناسبة كما أنها توفر إمكانية الوصول المباشر إلى دراسة ديناميات الجزيئية الاعتراف خلية خلية لأنها تحدث في الخلايا المناعية أو الخلايا الأخرى. أنها يمكن أيضا أن تستخدم ببساطة لوضع خلايا متحركة وغير ذلك غير ملتصقة قريبة بما فيه الكفاية لشريحة زجاجية بحيث يمكن لهذه الخلايا يمكن تصويرها في TIRF الإضاءة، وهو مرغوب فيه للغاية عندما التجارب التوصيل التي تنطوي على تتبع جزيء واحد أو واحدة superresolution القائم على الجزيء. تحقيقا لهذه الغاية البروتينات لا بد من تحميلها على SLB كثيري التنقل. ميزة متأصلة من لى المستخدمة PIDS هي أنه لا يوجد ربط غير محددة من البروتينات على الإطلاق. وعلاوة على ذلك، يمكن اعتبار SLBs كما السوائل ثنائية الأبعاد مع القدرة الكامنة للشفاء أنفسهم. يتم تعويض المخالفات داخل الزجاج دعم ما يصل إلى درجة معينة. ويرد بروتوكول خطوة خطوة لتوليد طبقات ثنائية كثيري التنقل المكلفة البروتينات المثيرة للاهتمام. يوصف تشكيل SLBs مستو، والتي تحتوي على 1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC) باعتبارها العنصر الرئيسي (90-99٪) والاصطناعية وfunctionalized الدهون 1،2-dioleoyl- SN -glycero-3 - {[N (5-الأمينية-1-carboxypentyl) iminodiacetic حمض] succinyl} النيكل الملح (DGS NTA، النيكل) في وفرة منخفضة (1-10٪). POPC يحمل واحدة الأحماض الدهنية المشبعة وغير المشبعة الأحادية واحد الأحماض الدهنية وتشكل طبقات ثنائية الدهون من سيولة عالية حتى في RT. DGS NTA ني يربط مع headgroup لذيول بولي الحامض الاميني وبمثابة مرساة للبروتينات الموسومة بولي الحامض الاميني لاختيار (الشكل 1).

"> الأهم من ذلك، يجب أن يتضمن الأجهزة المجهري عدد من الأجهزة الطرفية التي تم وصفها أدناه. مع المعلومات المقدمة وبعض المعارف الأساسية في مجال البصريات وفيزياء الليزر، ينبغي أن يكون أي الأحياء قادرة على بناء واحد الإعداد والتصوير الجزيء. وينبغي أن تكون عينة الإثارة مثالي تجرى على مجهر مقلوب في الانعكاس الداخلي الكلي (TIRF) واسطة لأن هذا النظام يقلل ضوء زائفة والخلفية المفرطة مما أدى خلاف ذلك من الخلوية لصناعة السيارات في مضان ^9. لهذا، هدف-TIRF قادرة خاص (انظر أدناه)، وهناك حاجة إلى إضاءة ليزر. وبعض التجارب تتطلب مرات الإضاءة في نطاق ميلي ثانية واحدة وتعمل في تعاقب سريع. لتوفير الوقت إضاءة أو لتجنب التبييض غير المبررة التي تسببها الإضاءة المتكررة فإنه من المفيد في كثير من الأحيان لتقسيم الضوء المنبعث إلى اثنين أو أكثر من القنوات الطيفية. وهذا يسمح للقراءات في وقت واحد اثنين أو أكثر من ملفات تعريف الانبعاثات، والتي يمكن أن تصبح عاملا هاما عندما conducتجارب تينغ تنطوي على نقل فورستر الرنين الطاقة (الحنق). هنا الانبعاثات الناجمة عن واحد ضوء الإثارة النبض يمكن تسجيلها كلا من المانحين الحنق والحنق متقبل (كما الانبعاثات توعية). ينبغي للكاميرا التقاط ما يكفي من الفوتونات مع خلفية منخفضة بما فيه الكفاية لتصور fluorophores واحدة خلال فترة الإضاءة. برامج الكمبيوتر لابد وأن يكون على مستوى هذه المهمة لمزامنة اغلاق الإثارة والحصول على الصور. ويرد أدناه وفي الشكل 2 لمحة شاملة:

الهدف-TIRF قادر: لالقائم على الهدف TIRF الإضاءة يجب أن تكون الفتحة العددية (NA) هدف مساوية أو أكبر من 1.4 باستخدام الشرائح الزجاجية القياسية (ن = 1.515) ^9. التكبير يمكن أن تتراوح بين 60X إلى 150X. هدف ينبغي تصحيحه لونيا للسماح confocality عند التصوير fluorophores مختلفة.

الليزر: عدد عالج بالليزر متاحزادت الخيارات ص بشكل كبير خلال السنوات الماضية. ليزر ديود موجة مستمرة modulatable إلكترونيا الحديثة ذات الكفاءة من حيث التكلفة ويمكن تشغيلها مع تواتر لم يسبق له مثيل والسرعة. أغلى ليزر ايون الغاز التفوق في الجودة شعاع الليزر، ولكنها تتطلب اغلاق خارجي (انظر أدناه)، وغالبا ما اسعة (الإمداد) التبريد.

مصاريع الإثارة: جهري صوتية البصرية (AOM) تسمح اغلاق سريع في تعاقب سريع ^10. لاغلاق محكم على مزيج من AOM مع مصاريع الميكانيكية ويوصى. يتم تجنب هذا الطريق التدفئة واسعة من AOM بسبب التعرض للضوء مستمر ويتم إلغاء ضوء يتسرب من AOM في خارج موقف خارج.

وتستخدم العدسات لتوسيع أشعة الليزر، والتركيز لهم على طائرة الوصل الخلفي من الهدف. بهذه الطريقة، وعلى ضوء الإثارة يترك الهدف بمثابة شعاع مواز (الشكل 3)، وهو مطلوب لTIRF الإضاءة العينة. ونقل مركز التنسيق داخل طائرة الوصل الخلفي من مركز في محيط الهدف تغيير الزاوية التي شعاع يترك الهدف، ولكن ليس في موقع بقعة الليزر في العينة (الشكل 3)، والتي هي وظيفة للهندسة شعاع الشاملة. تستتبعه TIRF الإضاءة في زاوية حرجة، والتي يمكن تعديلها باستخدام مجموعة من المرايا يعمل بمثابة المنظار لترجمة النقطة المحورية ليزر داخل الطائرة المحورية لهذا الهدف. العدسات ينبغي تصحيحه لونيا، ويمكن استخدامها في مجموعة من اثنين أو ثلاثة العدسات. يتكون نظام الثلاث عدسة اثنين من العدسات بوصفها تلسكوب لتوسيع شعاع ليزر (وبالتالي بقعة الإضاءة في العينة) وعدسة ثالثة لتركيز شعاع موسع في طائرة الوصل الخلفي من الهدف (الشكل 4). يمكن أيضا أن يتحقق على حد سواء وظائف (التلسكوب والتركيز) من خلال مزيج من اثنين من العدسات فقط (انظر الشكل 4).

"jove_content"> يجب أن تكون مرايا لا يقل عن 95٪ عاكس لتجنب فقدان ضوء الليزر. لكل تعديل شعاع يتم تطبيق مجموعة من اثنين من المرايا وعادة ما هذا الترتيب غير كافية لضبط بالضبط أي زاوية وموقف شعاع الليزر.

تعكس تراكب مزدوج اللون وتنقل الضوء من موجات محددة مختلفة وتستخدم لركب أو تقسيم أشعة الليزر اثنين.

مرشحات Polychroic هي أكثر تعقيدا من مرشحات مزدوج اللون، وهناك حاجة لتعكس الضوء الإثارة واردة ونقل تخرج ضوء الانبعاثات من العينة. يتم وضعها في مكعب مرشح بين الهدف والعدسة أنبوب المجهر.

تنظيف الفلاتر: اعتمادا على نوع من صاحب العمل الليزر د الليزر تنظيف المرشحات مع عرض النطاق الترددي انتقال ضيق ينبغي أن توضع في شعاع الليزر مباشرة بعد خروجها من الليزر.

مرشحات الشقمصممة لاستيعاب نحو فعال ضوء الليزر مع عرض النطاق الترددي الضيق ونقل جميع الخفيفة الأخرى. يتم وضعها ضمن مسار الانبعاثات لتصفية أي زائفة ضوء الإثارة الليزر. لكن تحقيقها فلاتر تعمل فقط عند 0 درجة زاوية واردة. إذا كانت الفرقة العرض للمرشح الشق حاد جدا، قد لا تعكس زوايا مختلفة واردة أكثر من ذلك. لا يتأثر حجب ضوء الليزر ليزر موازى، ولكن الضوء المتناثرة العودة قد لا تكون أعاقت كفاءة من الوصول إلى الكاميرا.

تصفية العجلات المزودة بمحركات مزودة بمرشحات المناسبة عجلات يمكن وضعها بسهولة في الإثارة وانبعاث مسار وتسمح التحول بسيط بين شدة الضوء المختلفة (عندما تكون مجهزة بمرشحات ND) أو قنوات الفلورسنت (عند وضعها أمام زينون أو مصباح الزئبق قوس لratiometric التصوير الكالسيوم أو أمام الكاميرا لاختيار لfluorophore الباعث للضوء).

50:50 مكعب شعاع الخائن جويمكن استخدامها لتقسيم أشعة الليزر على مسارين منفصلين الإثارة شعاع وأيضا إلى الجمع بينهما أمام منظار.

شعاع الخائن (مسار الانبعاثات): لسرعة الحصول على الصور من دون أي حاجة لإجراء تغييرات تصفية الجسدية، يتم تقسيم شعاع الانبعاثات إلى قناة الأزرق تحول والحمراء تحول. من حيث المبدأ، شق شعاع يمكن أن يبنى من خلال توظيف إسفين مزدوج اللون أو مجموعة من المرايا ومرآة مزدوج اللون لفصل شعاع الانبعاثات بطريقة تعتمد على الطول الموجي. وهناك حاجة إلى المرشحات الانبعاثات اثنين لتنظيف قنوات المنبعثة.

مرشح المكاني: تصفية المكانية من شعاع الإثارة مطلوب أحيانا لإزالة أشعة الضوء غير متوازية المنبعثة من أشعة الليزر ذات جودة منخفضة. يتكون مرشح المكاني للتلسكوب يومين مع عدسة ذات الثقب صغير يوضع بالضبط في نقطة محورية في كل من العدسات. هذا الضوء زائفة طريقة الناتجة عن الأجزاء غير متوازية من شعاع الليزر يصبح سدت بكفاءة. سويجب أن تتحقق الشروط CH عند وضع المجهر على أساس TIRF. زيادات تصفية المكانية مع الثقوب الصغيرة، التي هي أكثر صعوبة لوضع في نقطة محورية، ومع أطوال أصغر من العدسة الأولى. للحد من الآثار الناجمة عن الانحرافات عدسة فإنه من المفيد أن توظف بدلا من العدسات بسيطة ذات جودة عالية وأهداف المجهر لتصحيح ما لا نهاية مع التكبير المنخفض (10X 20X أو).

الناظور: A الإعداد منظار ضروري لترجمة تركيز شعاع الليزر داخل طائرة الوصل الخلفي من الهدف، وهو شرط أساسي لTIRF التصوير. ويمكن أن يبنى بسهولة من اثنين من المرايا اثنين بوصة، وهي مرحلة متعدية لضبط المرآة الأولى وآخر لتحديد المواقع مرآة الثانية لتعكس اتسعت وركزت الإثارة شعاع إلى المجهر (الشكل 5).

وتستخدم مضيئة العودة الإلكترو بضرب الأجهزة المسؤول يقترن (EMCCD) بشكل روتيني ل: الكاميراتسجيل إشارات جزيء واحد. وذلك لأن من كفاءة الكم العالية (تصل إلى 95٪)، وارتفاع سرعة اكتساب (تصل إلى 30 ميغاهيرتز)، وانخفاض مستوى الضجيج نسبيا. تهدئة ل-80 ° C يقلل من الضوضاء الحرارية ويدعمه عدد من المتاحة حاليا الكاميرات EMCCD. وجود قيود على تكنولوجيا EMCCD هو أن الضوضاء كاميرا يزيد خطيا مع كل من كسب الكاميرا وإشارة يتم القبض. ليست هذه هي الحال مع العلمية CMOS (sCMOS) الكاميرات، والتي هي أقل تكلفة وتشغيل نظرا لبنية خاصة من الشريحة sCMOS أيضا أسرع بكثير من الكاميرات EMCCD. لكن مشكلة المرتبطة تكنولوجيا CMOS هي أن الحصول على الصور لا تزال تفتقر إلى حد ما من قراءات الكمية على مستوى جزيء واحد، لأن كل بكسل ملامح حساسية الكشف مختلفة. من حيث المبدأ هذا يمكن تعويضه من خلال بكسل التطبيع، ولكن هذا الإجراء هو بأي حال من الأحوال تافهة ^11. هذا هو السبب في أننا لا تزال تتردد في إعادةنشيد كاميرات sCMOS للفحص المجهري جزيء واحد، ولكن بالنظر إلى التطور السريع لهذه التكنولوجيا، قد أصبحت الكاميرات sCMOS قريبا الكاميرا في الاختيار. بطيئة كاميرات CCD مسح الكاميرات تجنب المتعلقة التضخيم الضوضاء وبكسل الفرق كل ذلك معا وتدعم أسرع معدلات اقتناء ما اذا كان يمكن أن تعمل في ما يسمى وضع "الحركية". في هذا الوضع رقاقة الكاميرا بأكمله ما عدا المنطقة ذات الاهتمام (ROI) هو ملثمين، مما يجعل من الممكن استخدام الرقاقة نفسها كجهاز تخزين. بعد تعرض ROI لأول مرة، وتحولت التهم مما أدى إلى منطقة ملثمين من خط رقاقة بكسل خط بكسل، حيث محمي الصورة من مزيد من التعرض للضوء. وبمجرد الانتهاء من تحويل جميع خطوط ROI في المنطقة ملثمين (في المدى ميلي ثانية واحدة دون)، والعائد على الاستثمار في حد ذاته هو على استعداد للتعرض المقبل. وتتكرر هذه الدورة حتى يتم تحميل جميع خطوط بكسل للرقاقة CCD. رقاقة وثم قرأ ببطء مع ملحوظ reduالضوضاء قراءات دائرة الهندسة المدنية. على سبيل المثال على رقاقة بكسل 1000 x 1300، 20 رويس من 50X50 بكسل يمكن تسجيلها في تعاقب سريع. لأن الصور لا تزال على الرقاقة لفترة طويلة قبل أن تلا، فمن الأهمية بمكان لضمان الجودة العالية واخفاء لتبريد الكاميرا (على سبيل المثال مع النيتروجين السائل) كوسيلة للحد من الضوضاء الحرارية المفرطة. بعض الكاميرات EMCCD أيضا دعم الوضع الحركي.

البرنامج: توقيت الليزر، المصاريع، AOMS والتعرض الكاميرا، فضلا عن تخزين الصور السليم جزء لا يتجزأ من أي تجربة التصوير ناجحة. من حيث المبدأ يمكن برمجتها العديد من العمليات المحددة مع حزم البرامج المتاحة التي تأتي مع الكاميرا. حزم البرمجيات التجارية دعم عدد كبير من الأجهزة الطرفية، والتي يمكن تنفيذها مع القليل المعرفة التقنية.

مولد النبض، والحصول على البيانات (دق) مجلس (مع التناظرية والرقمية قنوات الانتاج) والذبذبات: مولد النبض هواختيار ممتاز لتحويل النبضات الزناد في نبضات زمنية محددة والجهد. بهذه الطريقة ليزر يمكن التحكم بدقة لانتاج الطاقة وانتهت في ميلي ثانية واحدة إلى مجموعة ميلي ثانية واحدة الفرعية. مجالس دق مع مخرجات التناظرية تحقيق نفس ودمجها بسهولة في اللوحة الأم للكمبيوتر عبر فتحات PCI. يتم التحقق من مدة النبضة، والسعة والتردد مع الذبذبات.

الضميمة من كامل مسار الإثارة شعاع: لتجنب التقلبات في ملف تعريف الإثارة بسبب convections الهواء وينبغي إغلاق كامل مسار شعاع الإثارة من بيئة معملية لها. هذا الإجراء أهمية خاصة عند إجراء TIRF المجهري. محمية المكونات البصرية أيضا من الغبار والعين البشرية من التعرض للضوء ليزر. يمكن أن يكون بناء اسوار بسهولة من الأسود متن بطاقة، التي يمكن شراؤها في المتاجر فنون العرض.

لتحديد سيولة استرداد SLB الإسفار بعد Photobleacهينج (FRAP) القياسات ¹² يتم تنفيذها. لFRAP وجود مسارين الإثارة شعاع من المستحسن (انظر الشكل 3). تم تصميم مسار الشعاع الأول لصورة مضان من طبقة ثنائية. ويمكن القيام بذلك في تكوين TIRF ومع شدة الإضاءة الخافتة. يجب أن يسمح مسار الشعاع الثاني لمسافة قصيرة ولكن مكثفة نبض التبييض ويجب أن يتم تكوين في غير TIRF الوضع، بحيث يترك الهدف على طول المحور البصري. يمكن وضع فتحة مستديرة في مسار شعاع الإثارة (انظر الشكل 8) لمشروع لمحة التبييض مستديرة تماما مع حواف محددة. من أجل صورة هذا الفتحة على الطائرة الكائن، موقفها الأمثل سيكون في المستوى البؤري للعدسة 3 (انظر الشكل 3). ولكن نظرا لطول بؤري طويل من هذه العدسة، كما يمكن إنشاء صورة الفتحة ذات جودة كافية، عندما يتم وضع فتحة في المواقف تحولت قليلا.

بعد أن تي يؤديهاكان التصوير التجربة يجب تحليل البيانات الخام بشكل مناسب. وتقدم عدة بروتوكولات خطوة بخطوة، والتي تغطي تعديل الإعدادات الرئيسية (مثل قوة الإضاءة والوقت، TIRF زاوية)، والحصول على البيانات وتحليلها.

البروتوكول

1. جيل وFunctionalization من مستو SLBs

1. اختلاط الدهون
   1. للوصول إلى 10٪ DGS NTA ني / 90٪ تكوين POPC الدهون حل 45 ملغ من POPC و 6.9 ملغ DGS NTA ني في الكلوروفورم في 250 مل قارورة أسفل جولة. الحفاظ على وحدة التخزين من الاسعار المنخفضة الكلوروفورم (فقط عدة مل) لتتبخر في الخطوة التالية. ل1٪ DGS NTA ني / 99٪ تكوين POPC الدهون استخدام 49.5 ملغ POPC و 0.69 ملغ DGS NTA ني.
   2. إزالة الكلوروفورم باستخدام المبخر الدوار ببطء - زيادة فوق درجة حرارة الجو المحيط ليست ضرورية. بدلا من ذلك، ضربة تشغيله داخل غطاء الكيميائية في تيار من غاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون. حين نفعل ذلك تتحول باستمرار القارورة للسماح للترسب على قدم المساواة من الدهون التجفيف على النصف السفلي من أسفل القارورة المستديرة.
   3. بمجرد تبخرت غالبية الكلوروفورم، ونعلق قارورة فراغ O / N لإزالة الكلوروفورم كميا.
      ملاحظة: هذه الخطوة مهمة لتجنب التلوثمن البروتينات والخلايا مع الكلوروفورم سامة في مراحل لاحقة، وضمان الدهون طبقة ثنائية سيولة.
2. جيل من الحويصلات unilamellar الصغيرة (سيارات الدفع الرباعي) من الدهون المجففة
   ملاحظة: صغير الحويصلات unilamellar (سيارات الدفع الرباعي) ما بين 20 نانومتر و 100 نانومتر في القطر ويمكن انتاجها بسهولة عن طريق حمام صوتنة. قذف الدهون، طريقة بديلة، يمكن أن تؤدي إلى سيارات الدفع الرباعي، وهذا يتوقف على حجم المسام للمرشح بطلب للحصول على قذف، وأيضا الحويصلات unilamellar كبيرة (LUVs)، والتي هي 100 نانومتر إلى 1000 نانومتر في الحجم. ومع ذلك، سيارات الدفع الرباعي هي الأنسب لتشكيل SLBs.
   1. سيارات الدفع الرباعي من خلال حمام صوتنة (كما هو موضح في الفيديو):
      1. Degass PBS. تعليق خليط الدهن المجففة مع 250 مل قارورة أسفل جولة في 10 مل نزع الغاز PBS.
      2. ملء قارورة مع غاز خامل مثل النيتروجين أو الأرجون، وإغلاقه مع سدادة وختم قارورة مع الشريط الأوتوكلاف.
      3. ضع قارورة مختومة إلى sonicator حمام ويصوتن الدهون تعليق علىر 120-170 W حتى تحولت واضحا. هذا يستغرق ما بين 30 و 60 دقيقة.
      4. رصد التقدم المحرز في الحويصلة تشكيل الطيف-بقياس الضوء: تترتب على ذلك أن امتصاص مستحلب مخفف بالمقارنة مع PBS يبقى ثابتا عند 234 نانومتر (كمؤشر تقريبي للتركيز الدهن) بعد أن تنخفض بشكل كبير عند 550 نانومتر (نتيجة لانخفاض تشتت الضوء عبر الجزيئات الكبيرة).
      5. لتكوير الحويصلات غير unilamellar الثقيلة، التي تتداخل مع تشكيل SLB متجاورة، بيليه تعليق الحويصلة بواسطة الطرد المركزي، في 150،000 x ج لمدة 1 ساعة على 25 درجة مئوية، وبعد ذلك لمدة 8 ساعة على 288،000 x ج، 4 ° C.
      6. تصفية طاف من خلال مرشح حقنة مع قطر المسام من 0.2 ميكرون.
      7. قياس OD في 234 نانومتر و 550 نانومتر لمراقبة وضوح إعداد الحويصلة وكمية الدهون اليسار.
      8. تخزين الحويصلات في 4 درجات مئوية تحت الأرجون أو النيتروجين. اختياريا، استخدم الحويصلة تعليق لإعداد طبقة ثنائيةلعدة أشهر.
   2. سيارات الدفع الرباعي من خلال قذف الدهون:
      1. وباختصار، تمرير تعليق الدهون عدة مرات من خلال مرشح مع حجم المسام من 0.1 ميكرون. بغض النظر عن طريقة التصنيع وأجهزة الطرد المركزي تعليق الحويصلة مرتين (1H، 150،000g، 25 ° C، ثم 8H، 4 ° C، 288،000 ز) لتكوير الحويصلات غير unilamellar التي هي أثقل.
         ملاحظة: عند تخزينها في 4 درجة مئوية تحت غاز خامل، الحويصلات يمكن استخدامها لإعداد طبقة ثنائية لعدة أشهر.
3. تشكيل SLB وشحن مع البروتين
   1. علاج 24 × 50 ملم # 1.5 الشرائح الزجاجية مع 3: خليط 1 من حمض الكبريتيك المركز و 30٪ بيروكسيد الهيدروجين لمدة 30 دقيقة.
      ملاحظة: نظرا للطبيعة العدوانية للخليط عناية خاصة، أي ارتداء معطف المختبر ونظارات السلامة كما هو موضح في الفيديو!
   2. شطف الشرائح الزجاجية تحت تيار من ده _{2 O} من زجاجة بخ. وضعها على حامل تفلون والسماح لهم الجافةلمدة 10 إلى 30 دقيقة.
   3. إزالة الشريحة الزجاجية السفلى من 8 أو 16 غرف جيدا، وملء الجزء السفلي مع الغراء الايبوكسي ووضع بعناية شريحة زجاجية نظيفة وجافة على غرفة أسفل المغطاة الغراء. السماح للالغراء تتصلب لمدة 10 دقيقة. إزالة الغراء الزائد من أسفل.
      ملاحظة: يمكن أيضا ختم ضيق بين شريحة زجاجية وغرفة تتحقق بسهولة مع استخدام الأسنان مركبين لصق النمذجة السيليكون، والتي يصلب في غضون 10 إلى 30 دقيقة. هذا الختم ليس ثابتا مثل الغراء الايبوكسي ولكن يقاوم الاجهاد البدني المنتظم. بعد التجربة أنه يمكن إزالتها بسهولة من الغرفة، والتي هي قابلة لإعادة الاستخدام ثم في التجارب المستقبلية.
   4. ماصة 120 ميكرولتر (60μl) من تعليق الدهون 10 أضعاف PBS المخفف في كل بئر من 8 (16) - حسنا الغرفة (أعد كما هو موضح أعلاه)، والسماح للشكل طبقة ثنائية لمدة 20 دقيقة. شطف بعناية طبقة ثنائية مرتين مع 15 مل PBS. مرة واحدة وقد شكلت طبقة ثنائية، فإنه يجب أن يكون دائما مغمورة في المخزن وأبدا أن يتعرض للهواء.
   5. ملء كل بئر على الطريق مع كل PBS، ثم خلع 330μl (الغرفة 8 جيدا) أو 165μl (غرفة 16 أيضا). هناك 350μl (175μl) غادر في البئر. إضافة 50μl (25μl) من كوكتيل يحتوي على البروتينات صاحب الموسومة مخففة في PBS إلى كل بئر (400 أو 200 ميكرولتر النهائي)، واحتضان في RT لمدة 60 دقيقة في الظلام. يمكن تعديل كثافة البروتين السطحي من خلال تغيير تركيز البروتين خلال هذه الخطوة الحضانة.
   6. شطف كل مرتين بشكل جيد مع 15 مل PBS.
      ملاحظة: عادة، SLBs ينبغي أن تستخدم في تجارب لم يعد من 6 ساعات بعد الشحن مع البروتين. خلال هذه الفترة، والانتعاش بعد photobleaching من fluorophore لا تزال تصل إلى 95٪، ويمكن أن يتم الكشف عن أي خسارة في البروتين المرتبط طبقة ثنائية. ينبغي تحديد كثافة البروتين قبل التجربة (انظر أدناه).
   7. خطوة اختيارية: لاختبار غير محددة وملزمة من البروتين وDGS NTA ني تحتوي على SLB، وغسل SLB مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 300 ملي إميدازول. للمحترفينالبروتين يجب أن تأتي بشكل كامل.

2. إعداد مجهر

1. لبناء نظام المجهر قادر على الكشف عن مضان من fluorochromes واحد الرجوع إلى التوصيات الواردة في المقدمة.

3. قياسات الطاقة

ملاحظة: Fluorophores يمكن المشبعة بسهولة مع فائض ضوء الإثارة. هذا يسرع photobleaching من دون أي مكسب آخر في الانبعاثات وبالتالي ينبغي تجنبها. لتحسين إضاءة العينة ينبغي قياس كثافة القدرة الإثارة مباشرة في العينة. ويمكن لهذه القياسات أيضا بمثابة إشارة للتجارب في المستقبل. وعلاوة على ذلك، مع العلم أن النسبة بين المدخلات والمخرجات ليزر قوة غير مفيدة عند تقييم حيث يتم فقدان الضوء في نظام التصوير.

1. نقل شعاع الإثارة في وضع مستقيم بحيث يترك الهدف في زاوية 90 درجة.
2. وضع رئيس السلطة متر على رأس سو الحزم وقياس قوة شعاع (= P). توثيق النتيجة.
3. باستخدام المنظار، وتحويل شعاع في موقف TIRF وصورة لطبقة ثنائية الفلورسنت متجانسة سليمة. لتجنب التبييض وCCD إشارة تشبع المكان محايدة الكثافة (ND) مرشح مع الكثافة الضوئية (OD) من 2-3 في مسار ضوء الإثارة.
   1. قياس التهم متكاملة من الملعب مضاءة بالكامل (= I _{المجموع).} أيضا، وقياس حجم المنطقة المضاءة (= A _{المجموع).} قياس التهم المتكاملة (= _مركز I) من بقعة مركزية مضيئة الحد الأقصى فضلا عن حجم بقعة (= A _الوسط).
4. قياس إشارة الخلفية لكل بكسل (= B) إما خارج المنطقة المضاءة أو بدون عينة الإضاءة.
5. طرح إشارة الخلفية من النتائج المقاسة في 3.). القيام بذلك عن طريق ضرب عدد من وحدات البكسل من المنطقة المعنية (المنطقة المضاءة كليا أو بقعة في الوسط) مع الخلفيةالتهم لكل بكسل. (= I _{المجموع -} A .B _مجموعه وI _{المركز - مركز} .B).
6. تقسيم المتكاملة وخلفية تصحيح إشارة من نقطة الوسط بنسبة إشارة متكاملة وتصحيح خلفية الحقل بأكمله من الإضاءة.
   ملاحظة: نتيجة تدل على الكسر من إجمالي الطاقة تقع ضمن بقعة المركز (= _(مركز I - _مركز .B) / (I _{المجموع -} A .B _الكل)). تكاثر هذه النتيجة مع P القدرة المقاسة في 2.) النتائج في قوة ضوء ينير نقطة المركز.
7. تحديد حجم بقعة _مركز في μm². لهذا تقسيم حجم بيكسل في ميكرون من قبل التكبير من الهدف، واتخاذ مربع من النتيجة كما μm² لكل بكسل.
   1. بدلا من قياس حجم البكسل في الصورة مع استخدام شريحة ميكرون وضعت على المجهر واتخاذ مربع من نتيجة كمنطقة لكل بكسل. المزيد الصورةiply هذه القيمة من قبل عدد من وحدات البكسل التي تقع داخل بقعة مركز للوصول إلى منطقة بقعة مضيئة.
8. تقسيم P السلطة إلقاء الضوء على بقعة مركز من حجم بقعة مركز _{مركز، μm²} لحساب شدة الإضاءة في ميكرون ^2. تم اعطاء مثال في الشكل (6).
9. قيم كثافة القدرة المقاسة في غير TIRF الإضاءة أقل عادة من الحاضرين في TIRF إضاءة ^13، والتي تعتمد أيضا على زاوية الدقيق الذي ينعكس ضوء الليزر تماما. للوصول إلى كثافة الطاقة الحالية تحت TIRF الإضاءة، صورة معايرة حبات الفلورسنت من قطر 0.1μm سواء في عدم TIRF وTIRF. نسبة كثافة مضان حبة قياس في TIRF وغير TIRF وضع تبلغ عامل التحويل C، والذي يسمح تحويل القيم المقاسة كثافة الطاقة في تلك الفعالية تحت TIRF الإضاءة (المعادلة 1).
   كثافة الطاقة _TIRF = C • كثافة الطاقة _{غير TIRF} (المعادلة 1)
   مع C = كثافة حبة _{T IRF} / شدة حبة _{غير TIRF-}

4. الكثافة القياسات

1. تحديد متوسط ​​إشارة من fluorophores الفردية تقع على طبقة ثنائية. المرفقة طبقة ثنائية الجزيئات MHC محملة الببتيدات الفلورسنت مثالية لهذا الغرض منذ البروتين: التسمية رياضيات الكيمياء هو واحد بالضبط. إذا التبييض الضروري جميع التسميات على طبقة ثنائية في مجال الرؤية، والسماح للمضان استعادة لتصور fluorophores واحدة.
   1. تسجيل صور في تتابع سريع (على سبيل المثال تطبق اكتساب يتدفقون بروتوكول) ورصد الجزيئات واحدة التنقل على مدى عدة إطارات. لمزيد من المعلومات راجع الشكل 7.
الأقسام بقعة إضاءة مركزية داخل طبقة ثنائية كما ROI. قياس العائد على الاستثمار، وينبغي أن يكون التباين في إضاءة كثافة الطاقة (الذي يتناسب مع كثافة مضان) أقل من الناحية المثالية من 15٪.
1. تحديد جزيء واحد ومضان بالجملة فقط داخل هذا ROI. دمج إشارة من العائد على الاستثمار، والتي هي كبيرة بما يكفي لالتقاط 99٪ أو أكثر من وظيفة انتشار نقطة باعث واحد و. عندما تستخدم كاميرا بحجم بكسل من 16-20 ميكرون (جاء في مواصفات الكاميرا الشركة المصنعة)، وهو الهدف مع التكبير 100 أضعاف والفتحة العددية مساوية أو أكبر من 1.45، واتخاذ منطقة 7 بنسبة 7 بكسل مع ذروة الكثافة تقع في وسط الميدان.
2. لتحديد إشارة الخلفية، ودمج التهم لالمجاورة مربع 7 بنسبة 7 بكسل، والتي لا تحتوي على إشارة مضان. طرح الخلفية من إشارة جزيء واحد لتحديد القيمة تصحيح لفلور جزيء واحدescence. تحديد الإشارات الوحيدة التي لا تزال واضحة في إطار التالي.
2. كرر الخطوة 4.2 خمسين إلى عدة مئات من المرات. متوسط ​​إشارة لتصحيح الخلفية. إذا رغبت في ذلك، رسم القيم كثافة جزيء واحد كما رسم بياني. اختياري: الاستفادة من البرنامج المساعد مناسبة من حزم البرمجيات مفتوحة المصدر (على سبيل المثال يماغيج) أو معالجة البيانات باستخدام البرمجيات التجارية (مثل Metamorph، الأجهزة الجزيئية). المستخدمين ذوي الخبرة يمكن أن يكتب برنامجهم تحليل الخاصة في ماتلاب أو حزم البرمجيات مماثلة.
3. وضع مرشح الكثافة المحايدة من 2 أو أعلى في مسار الإثارة والتقاط صور من طبقة ثنائية الفلورسنت التي تحتوي على البروتينات التي تحمل نفس fluorophore. تسجيل متوسط ​​كثافة بكسل داخل نفس ROI المستخدمة لقياس كثافة جزيء واحد. تسجيل وقت التعرض للقياسات مضان السائبة. قياس نفس المكان دون إضاءة للخلفية الطرح.
4. لتحديد كثافة البروتين داخل ثنائيةطبقة، تتضاعف مضان الأكبر كثافة متوسط ​​بكسل لتصحيح الخلفية تحديدها في الخطوة 4 من قبل عدد من بكسل لكل ميكرون مربع (على سبيل المثال 41.5)، من خلال 100 (إذا كان يعمل عامل تصفية ND مع OD من 2) أو 1000 (إذا كان ND تم استخدام مرشح مع OD من 3) ووقت التعرض تستخدم في الخطوة 2 ونقسمه على متوسط ​​إشارة جزيء واحد تحديدها في الخطوة 3، ووقت التعرض تستخدم في الخطوة 2 وعدد من fluorophores في البروتين.

5. اختبار النزاهة من طبقة ثنائية

1. إعداد طبقة ثنائية الفلورسنت ووضعه على المسرح المجهر كما هو موضح أعلاه.
2. ضبط التركيز والتقاط صورة للطبقة ثنائية في وضع TIRF. تطبيق القصيرة ولكن المكثفة نبض التبييض في غير TIRF الوضع ليجتذ مضان ضمن ROI على شكل قرص صغير.
3. التقاط صورة من طبقة ثنائية في وضع منخفض الكثافة TIRF مباشرة بعد التبييض، وبعد ذلك كل 5-10 ثانية لمراقبة سرعة الانتعاش مضان.
4. موهاء إلى منطقة مختلفة على طبقة ثنائية واتبع الخطوة 2 و 3. التقاط صورة أخرى في كثافة منخفضة وضع TIRF 5 دقائق بعد نبض التبييض. تحديد شدة I _{إضافة التبييض} في مجال التبييض وذلك لمقارنة كثافة السابقة لتبيض _I 0 في بداية التجربة (تبييض لا ينبغي أن يكون حدث) لحساب جزء متحرك (IF) على النحو التالي:
   جزء متحرك IF (٪) = _(I 0 - I _{إضافة التبييض)} / _(I 0 - الخلفية) × 100،
   مع خلفية = كثافة يقاس داخل ROI مع أي ضوء الإثارة تطبيق
   وIF يجب أن تكون أقل من 10٪ (مثالي أقل من 5٪).

النتائج

ويرد بنية جزيء نظام مضان المجهر واحد بقدر كبير من التفصيل في الشكل 2. وأوضح أجزاء فردية مثل المكونات البصرية ومكونات الأجهزة الأخرى في المقدمة. مسارات الإثارة شعاع البصرية، التي تؤدي بطريقة محددة لTIRF وغير TIRF الإضاءة، وتظهر وأوضح في أرقام 3-5. لاحظ مكان الخائن 50:50 شعاع أمام مرآة المنظار الأول المتمركزة على مرحلة للترجمة ميكرومتر (الشكل 5). هذا الخائن شعاع تطغى شعاع TIRF المستخدمة في التصوير (المشار إليها باللون الأخضر) وشعاع غير TIRF (المشار إليها باللون الأحمر) المستخدمة للتبييض أو بوساطة ضوء تفعيل عينة محددة فتحة المحلي (كما هو موضح في الشكل 3). وترد مسارات الجمع بين الخفيفة (الشكل 5، المشار إليها في البرتقال) عبر مرآة المنظار الثانية بمنفذ الخلفي للميكر مقلوبoscope. كما هو موضح في الشكل (4) والموضحة في الشكل 2، وتنفيذ اثنين أو ثلاثة عدسات محدبة يوسع ملامح شعاع الليزر، ويركز على أشعة الليزر على طائرة الوصل الخلفي من الهدف أن تؤدي إلى شعاعين موازى إلقاء الضوء على عينة في TIRF و ، على التوالي، في غير TIRF.

ويرد مثال للقيم كثافة يقاس المطلوبة لحساب كثافة القدرة على العينة في الشكل (6). ويبلغ متوسط ​​إشارة الخلفية لتطرح من شدة قياس في المنطقة المضاءة والوسطى (التي تستخدم للتصوير)، يتحدد في منطقة داخل مجال الرؤية، والتي لا تنيره شعاع ليزر (هنا 7089 التهم). ثم يتم ضرب متوسط ​​الشدة لتصحيح خلفية مضيئة (1684 التهم) والمنطقة الوسطى (4830 التهم) من أحجام المنطقة المقابلة أن تؤدي إلى شدة متكاملة (1،471× 10 ⁸ التهم عن المنطقة المضاءة و3.424 × 10 ⁷ تهم للمنطقة المركزية). نسبة من شدة المتكاملة في المناطق الوسطى ومضيئة ينتج جزء من الطاقة الإجمالية إلقاء الضوء على المنطقة الوسطى (0.23 أو 23٪). كما هو مبين في الفيلم، والقوة الشاملة لابد من تحديدها في هدف مع استخدام السلطة متر في وضع الإضاءة غير TIRF. في مثالنا هو تعديله إلى 5 ميغاواط، مما أدى بالتالي إلى قوة 5 ميغاواط X 0.23 = 1.15 ميغاواط داخل المنطقة المركزية. منذ 41.5 بكسل المبلغ في مثالنا إلى 1 ميكرون ^2، المنطقة الوسطى لديها حجم 7089 بكسل /41.5 بكسل العاشر ميكرون ² = 170.8 ميكرون ^2. تقسيم قوة ضوء ينير المنطقة الوسطى (1.15 ميغاواط) من خلال هذا المجال (170.8 ميكرون ²⁾ ينتج في المتوسط ​​السلطةكثافة 0.7 كيلو وات / سم ² في المنطقة الوسطى.

يتميز الشكل 7 صور ونتائج شدة المقابلة من fluorophores واحدة حصلت في تعاقب سريع (100 لقطة في الثانية الواحدة، أي مع إطار زمني من 10 ميللي ثانية). لكثافة الكميات متوسط ​​إشارة من منطقة مستطيلة من سبعة سبعة (= 49) بكسل، الذي يغطي إشارة مضان، يتم تحديد. وعلاوة على ذلك يتم تحديد متوسط ​​إشارة للخلفية داخل منطقة مستطيلة من سبعة سبعة بكسل على مقربة من إشارة جزيء واحد. يتم ضرب متوسط ​​إشارة لتصحيح الخلفية من قبل عدد من بكسل داخل المنطقة (= 49) أن تؤدي إلى إشارة جزيء واحد (علامة بالخط العريض).

وأظهرت تجربة FRAP تمثيلية تهدف إلى تقييم تنقل SLB المرتبطة البروتينات المسمى مضان في الشكل 8 لاحظ في الشكل 8A في repetiاستخدام موانع من كثافة منخفضة شعاع التصوير اتسعت واستخدام واحد من الثانية أكثر الضيقة وفتحة-تعريف عالية شعاع كثافة لالاجتثاث تألقي السريع عند نقطة الصفر مرة الثانية. متوسط ​​الشدة، طرح الخلفية داخل دائرة صفراء، والتي تم تطبيع في متوسط ​​قيمة كثافة الأولية السابقة لنبض التبييض، ويتم رسم في الشكل 8B ضد الوقت لتسجيل السرعة والمدى الذي مضان تعافى. كما هو مبين، وانتشال أكثر من 90٪ (المشار إليها الخط الأخضر) من شدة طبقة ثنائية الأولية في غضون 75 ثانية بعد الاجتثاث تألقي. ونتيجة لذلك أقل من 10٪ من البروتينات جزءا لا يتجزأ من هو مبين SLB غير قادرة على الحركة.

الشكل 1. مخطط توضيحي لنظام SLB. مصنوعة (A) SLBs من POPC (90-99٪) والدهون الاصطناعية DGS NTA-Nط (1-10٪). وهي تشكل تلقائيا عندما يتم تحميل أسطح زجاجية نظيفة مع السيارات الرياضية متعددة الاستخدامات يتألف من الدهون المقابلة. (B) وبمجرد تشكيلها، وهذه SLBs يمكن تزيين بسهولة مع بروتينات قابلة للذوبان مدد إما مع C- واحد أو علامة N-الطرفية التي تحتوي على اثني عشر histidines (12H، ل مثال المشارك تنشيطية جزيء B7-1 وجزيء التصاق ICAM-1) أو البروتين dimers امتدت مع اثنين من العلامات التي تحتوي على ستة histidines كل (2x6H، على سبيل المثال ديمر αβMHC الدرجة الثانية). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.

الشكل 2. لمحة عامة عن الإثارة والحزم الانبعاثات المسارات. يزر ايون الغاز (على سبيل المثال في Ar ⁺ أو الخمير الحمر ⁺⁾ ويمكن تشغيله لاغلاق سريع مع استخدام صوتية مو البصري dulators. هي ليزر الثنائيات المتاحة في الوقت الحاضر في العديد من الأطوال الموجية، وتمثل بديلا ممتازا لأنها يمكن التضمين إلكترونيا في ميكروثانية-الغضب. لاحظ أن أشعة الليزر يمكن تعديلها بسهولة مع اثنين من (مزدوج اللون) المرايا والانقسام وجنبا إلى جنب مع استخدام شق شعاع بسيطة أن تؤدي إلى اثنين أو أكثر من مسارات شعاع. في هذا المثال شعاع التصوير TIRF (لرصد الأحداث) وشعاع التبييض (إما fluorophores التبييض أو صورة تنشيط الجزيئات في قفص بطريقة محددة الفتحة) وتستخدم. كلا المسارين الإثارة يمكن أن تعمل بشكل مستقل عن بعضها البعض من خلال استخدام مصاريع إضافية. منظار يسمح لترجمة أشعة الليزر المركزة داخل طائرة الوصل الخلفي من الهدف لتوليد الإضاءة TIRF من العينة. الصورة الفلورية يمكن تقسيم طيفيا باستخدام شعاع الخائن الانبعاثات قبل الاستحواذ باستخدام كاميرا فائقة الحساسية (مثل EM-CCD أو كاميرا CMOS العلمية).كوم / ملفات / ftp_upload / 53158 / 53158fig2large.jpg "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وتحول الشكل 3. ضبط TIRF الإضاءة بترجمة شعاع تركيزا داخل طائرة الوصل الخلفي من الهدف. كما هو مبين النقطة المحورية لشعاع الليزر داخل طائرة الوصل الخلفي من الهدف من المركز إلى المحيط الخارجي من خلال النبات من الحزم (باستخدام ترتيب مرآة المنظار). ونتيجة لذلك يترك شعاع مواز الهدف في الإضاءة يميل إلى أن يتم التوصل إلى الزاوية الحرجة التي يحدث الانعكاس الكلي الداخلي. يتم إنشاء مجال زائل في واجهة الزجاج وسائل الإعلام حيث يحدث الانعكاس الكلي. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذه فاي جوري.

الرقم 4. النظم البصرية بسيطة للتركيز شعاع الليزر في طائرة الوصل الخلفي من الهدف. وهناك حاجة إما ثلاثة أو اثنين من العدسات لتوسيع شعاع الليزر والتركيز على طائرة الوصل الخلفي من الهدف TIRF. نظم عدسة اثنين تحتوي على أخطاء المرتبطة عدسة أقل من الأنظمة الثلاثة عدسة، وقد تكون أكثر ملاءمة لتوليد شعاع التصوير TIRF. ثلاثة العدسات قد يكون من الأفضل عندما تهدف لتعريف اتساع شعاع وبقعة الإضاءة مع حواف حادة، كما ستكون هناك حاجة لدراسات توظيف الصور التنشيط أو -bleaching. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

/53158fig5.jpg "/>

الرقم 5. المشروح صورة لمسار الشعاع في الجزء الخلفي من مضان المجهر. وكما هو مبين في الشكل 2 بالفعل واحدة قصب بسهولة تنفيذ شعاعين الإثارة، واحدة في TIRF (المشار إليها باللون الأخضر) والآخر في وضع غير TIRF (المشار إليها في أحمر). هذه تصبح مضافين مع استخدام الخائن 50:50 شعاع (BS). يتم وضع عدسات محدبة (L1 و L2) في الحزم منها للتركيز لهم على طائرة الوصل الخلفي من الهدف (لا يظهر). A المنظار يتكون من اثنين من المرايا (M1 و M2) أدلة على حد سواء الحزم عن طريق ميناء دخول المجهر. يمكن نقل مرآة الأولى (M1) مع استخدام مرحلة الترجمة (TS) (عن طريق تحويل المسمار ميكرومتر كما هو مبين) لنقل أحد الحزم في الموقف TIRF. مرة واحدة وقد تم تأسيس TIRF، شعاع الثاني (تستخدم للصور تبيض أو -activation، أشار هنا باللون الأحمر) ويمكن تعديلها بشكل مستقل من شعاع TIRF لمغادرة الهدف في حالة عدم TIRF-واسطة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 6. قياس قوة في المنطقة الوسطى من بقعة الإضاءة. وكما هو مبين اختار المناطق المناسبة للاهتمام، والتي تعكس الخلفية، على المنطقة بأكملها مضيئة (IA) والمنطقة الوسطى (CA)، حيث سيتم في وقت لاحق أن تسجل الأحداث. طرح القيم الأساسية من تلك التي سجلت لIA وCA ودمج شدة بضرب متوسط ​​شدة تصحيح مع عدد البكسل موجودة داخل كل منطقة (= شدة متكامل). تقسيم شدة متكاملة من CA من قبل أن من IA للوصول إلى نسبة قوة شعاع ينير CA (في هذا المثال: 23٪). تحديد قوة ضوء ينير CA بضرب قوة شعاع الشاملة (هنا: 5 مW) مع نسبة إلقاء الضوء على CA (هنا: 0.23). لتحديد حجم المنطقة الوسطى ضرب منطقة (هنا: 7089 بكسل) مع عامل بكسل إلى منطقة تحويل الحجم (هنا: 1 / 41.5 ميكرون ² بكسل ^-1). للوصول إلى متوسط ​​كثافة الطاقة من ضوء الإثارة إلقاء الضوء على CA، تقسيم السلطة (هنا: 1.15 ميغاواط) من حجم CA (هنا: 170.8 ميكرون ²⁾ الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 7. الكميات من إشارات جزيء واحد. (A) وقت مسار fluorophores واحدة على SLB. يتم وضع منطقة 7 × 7 بكسل الحجم من الاهتمام (ROI والأصفر) حول إشارة لتحديد الكميات. يتم تحديد الخلفية من والمجاورة 7 × 7 بكسلوترد العائد على الاستثمار (الخضراء). (B) الكمي متوسط ​​كثافة بكسل. لتحديد إشارة جزيء واحد، يتم طرح القيم الأساسية (ROI الأخضر) من القيم إشارة (ROI الأصفر) ومضروبا 49. (C) يتم رسم شدة جزيء واحد من fluorophore واحدة ضد الزمن. لاحظ أن النقطة 90 مرة ميللي ثانية تم حذف كما fluorophore في عملية التبييض. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 8. مضان الانتعاش بعد photobleaching من (FRAP) التحليل لتحديد سلامة SLB. تم تنفيذ (A) FRAP على طبقة ثنائية تحمل IEK / MCC-فلور اليكسا 647. ويظهر كل صورة ال10 لتجربة (B) FRAP الكميات من التجربة هو مبين في (A). القيم تشير إلى متوسط ​​الشدة (I) داخل ROI الأصفر هو مبين في (A) مقسوما على شدة الأولية (I _س) قبل التبييض. يتم عرض نقاط البيانات الأحمر في (A)، والخط الأخضر يدل 0.9 الانتعاش من شدة الأصلية. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

يوفر المجهر جزيء واحد فرصة فريدة لدراسة سلوك البروتينات داخل البيئة الخلوية طنهم. يصبح التصوير الجزيئي وبالتالي جذابة على نحو متزايد إلى مجتمع علمي واسع النطاق، ولكن العديد من العلماء الحياة خجولة لا يزال بعيدا عن الاستثمار الأولي في التكنولوجيا والخبرة. الفائدة الرئيسية الناجمة عن تجميع نظام واحد التصوير الخاص هو أنه يمكن تعديلها بسهولة لحاجة معينة أي شخص.

كما اقترح هنا على غير TIRF الإثارة شعاع يمكن تنفيذها بسهولة بالإضافة إلى مسار الضوء TIRF القائمة، إذا كان المطلوب الصور وتبييض السريع ومحددة (أو -activation) من fluorophores وبروابط، على سبيل المثال عند تنفيذ FRAP أو يجند التجارب uncaging ¹⁴ . إدخال الخائن شعاع الانبعاثات يسمح للتسجيل في وقت واحد من اثنين على الأقل وفي بعض الحالات تصل إلى أربع قنوات الفلورسنت. قائمة ملحقات هي في جوهرها محدودة فقطخيال المرء.

على سبيل المثال، تنفيذ الآلية عجلة تصفية الانبعاثات في مسار الانبعاثات يسمح التبديل السريع بين ما يصل إلى عشر قنوات الفلورسنت مختلفة. عند الجمع بين اثنين من العجلات المزودة بمحركات مرشح الانبعاثات (كل منها مزودة فتحات 10 فلتر) في سلسلة، وتصل إلى 18 قنوات الفلورسنت يمكن أن تقرأ. ويمكن استكمال التصوير القائم على TIRF مع القياسات تعبئة الكالسيوم والتدخل انعكاس المجهري (IRM) بعد دمج مسار مصباح زينون الإثارة أو الزئبق. IRM هو الأسلوب المفضل لتصور مدى تعلق خلايا على سطح الزجاج أو SLB، ويمكن بالتالي توفير المعلومات الهامة عند تفسير البيانات التصوير القائم على TIRF. إنشاء الإثارة شعاع موسع مع استخدام مرآة مزدوج اللون بسيطة والليزر إضافي من 405 نانومتر يسمح إجراء الفحص المجهري تنشيط ضوئي توطين (PALM) أو العشوائية المجهر إعادة البناء الضوئي (STORM)، أي اثنين superresolutمنهجيات أيون مع دقة الموضعية أقل من الحد حيود الضوء المرئي ^15،16.

ومع ذلك، نجاح التجربة ليست سوى مسألة الأجهزة المناسبة. للاستفادة الكاملة من التصوير القائم على TIRF-انخفاض الضوضاء، وينبغي أن خلايا اجراء اتصالات على سطح بطريقة لا تفرض قيودا على سطح الخلية أو أن يتدخل في علم وظائف الأعضاء من غشاء البلازما الخاصة بهم. SLBs functionalized مع البروتينات مناسبة لالتصاق الخلايا وتزيد مناسب تماما لهذا الغرض لأن كل بروابط SLB جزءا لا يتجزأ من متحركة أفقيا وضبط الموقف الجانبي في غضون طبقة ثنائية ردا على مستقبلات ديناميات ملزمة والعزل.

لتصنيع SLBs بطريقة قابلة للتكرار، فمن الأفضل أن تبدأ مع سيارات الدفع الرباعي عالية النقاء. كما هو موضح هنا، بالتالي فمن الأهمية بمكان إزالة الحويصلات عديد الصفاحات، التي يتم إنتاجها أيضا خلال صوتنة، في خطوتين تنبيذ فائق وهذه طnterfere مع تشكيل SLBs متجاورة يضم سيولة عالية. SLBs الشكل ذات جودة عالية فقط على أسطح زجاجية نظيفة. مرة واحدة وينبغي أن تستخدم الشرائح الزجاجية تنظيفها مباشرة أو تخزينها في فراغ. الأهم من ذلك، لا يجب أبدا أن يتعرض SLBs في الهواء لأن هذا من شأنه أن يؤدي إلى تعطل بهم. SLB غسل ينطوي، كما هو مبين، عازلة الشطف باستخدام ماصة المصلية، وهذه ليست فقط ولكن الإجراء أيضا لتوفير الوقت حفظ.

أثناء الحصاد وتنقية البروتينات SLB المقيمة ينبغي تجنب استخدام المنظفات. وذلك لأن المنظفات سيقلل التنقل البروتين بشكل كبير حتى عندما تكون موجودة بكميات ضئيلة. للتحايل على الحاجة إلى المنظفات كل ذلك معا، ويوصى التعبير للذوبان من polyhistidine يفرز مجهزة العلامة بروابط في خلايا الثدييات أو الحشرات. إذا refolding من الهيئات إدراج القولونية هو مطلوب، يجب أن تطبق بحذر لإزالة المنظفات بشكل فعال من الهيئات إدراج، قبل أن يقدموا غير الممثلة وrefolding.

والميزة الرئيسية لتوظيف نتائج SLBs من طبيعتها وحدات وreconstitutive، والذي يسمح لتشريح تحديدا دور مستقبلات يجند التفاعل نظرا لتنشيط الخلايا والتصاق الخلايا. في هذا الصدد من المهم أن نذكر أن أسهم دبي للذهب NTA ني ينبغي أن يكون حاضرا في 10٪ خلال SLB من أجل منع البروتينات التي تتنافس على مواقع الربط NTA-NI. عندما توظف SLBs إيواء سوى 1٪ أو 2٪ DGS NTA ني، والحد من اقتران أنواع البروتين الموسومة polyhistidine معين يمكن أن يكون لاحظت، وخصوصا عندما شارك في احتضان كميات متزايدة من أنواع البروتين polyhistidine الموسومة الثانية (غير منشورة الملاحظة). لا يلاحظ هذه الظاهرة عند العمل مع SLBs يضم 10٪ DGS NTA ني.

في حين لاحظنا أبدا غير محددة وملزمة من أي البروتين polyhistidine الموسومة اختبار لSLBs تحتوي على DGS NTA ني، ينبغي اختبار هذا الاحتمال عند تقديم البروتين لأول مرة،تحقيقا لهذه الغاية فإننا ننصح استخدام SLBs تخلو من DGS NTA ني (يجب أن البروتين لا يلزم). ثانيا، عند استخدام SLB تحتوي على DGS NTA ني، ينبغي أن البروتين تؤتي ثمارها تماما بعد غسل SLB مع برنامج تلفزيوني يحتوي على 300 ملي إميدازول.

ميزة هامة أخرى من توظيف SLBs هي أن التفاعلات عابرة ويشير أحداث يمكن رصدها مع تعزيز قرار الزمانية المكانية ^17-19. هذا هو على الأقل جزئيا لأن يتم تقليل عملية ملزمة ثلاثية الأبعاد أساسا على بعدين التصوير، وخاصة عند التسجيل في طريقة TIRF الضوضاء المخفف. استخدام SLBs متوافق مع الكشف عن إشارة جزيء واحد، وهو شرط أساسي لتنشيط الصورة توطين المجهري (PALM) أو العشوائية المجهر إعادة البناء الضوئي (STORM)، أي superresolution المجهري مع قرار أقل من الحد حيود ^15،16. هذه الطرائق التصوير الخاصة تمكن جزيء واحد فورستر الرنين الطاقة تراتجارب nsfer مصممة لتصور الفردية تفاعلات البروتين البروتين في بيئة متشابك ^20. ويفسر هذا النهج بقدر كبير من التفصيل في منشور إن الرب يطلق عليه "قياس TCR-PMHC ملزمة باستخدام القائم على الحنق المجهر فحص" ^21.

عند تفسير تجاربه التي تستند SLB-ينبغي للمرء أن نضع في اعتبارنا دائما أن هي واردة ليس كل خصائص الغشاء البلازمي للخلية حية من قبل SLBs، وأن بعض الصفات في عداد المفقودين قد تؤثر فسيولوجيا قيد التحقيق. بعد كل شيء، والبروتينات SLB جزءا لا يتجزأ من ونشرها بحرية وغير المنتظمة في microdomains غشاء لأن معظم نظرائهم الخلوية هي ^5،6،22. أوراق غشاء البلازما يجمد المستمدة من الخلايا الملتصقة، الذي الحفاظ على بنية الغشاء البلازمي للخلايا الحية إلى حد ما، وقد استخدمت بنجاح لدراسة امتصاص من المستضدات جزءا لا يتجزأ من الغشاء بواسطة الخلايا الليمفاوية ^B-23. ولكن، حتى هذاالأغشية لا تتفاعل مع الهيكل الخلوي ديناميكية للغاية وتحتوي على أي مرونة كما يتم دعمها من سطح الزجاج جامدة. في ضوء هذه التناقضات ومن الواضح أن هناك حاجة لSLBs الهندسية، والتي توفر وسيلة لتجزئة البروتينات بطريقة محددة والتي تدعمها السطوح من المرونة للتعديل أو الأسطح التي تغير صلابتهم في الاستجابة لنبضات الضوء تطبيقها محليا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة

الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
# 1.5 شرائح زجاجية	VWR	631-0853
250 مل قارورة سفلية مستديرة	VWR	201-1357
50:50 مكعبات مقسم شعاع	Thorlabs	BS013
Acousto-opitcal modulator C1205-2	Isomet-ضرورية	فقط إذا تم استخدام ليزر CW ، الذي لا يمكن تعديله ،
Alexa Fluor 488-NHS		Life A-20000
تقنيات Alexa Fluor 555-NHS	Life	A-20009
Alexa Fluor 647-NHS	Life	A-20006
شريط الأوتوكلاف	VWR	489-1312	أو أي أخرى لزجة مستقرة للحرارة
أفانتي ميني الطارد	Avanti Lipids	610000	بديل للحمام
سونيكاتور حمام سونيكاتور QSONICA Q700	QSONICA	Q700
شعاع الخائن	Cairn	P280 / 210 / MLS
B & uuml ؛ تشي المبخر الدوار	VWR	531-0837
الكاميرا	Andor	iXon Ultra 897	انظر نص المخطوطة للبدائل
الهيدروجين بيروكسيد المركز	روث	9683.1
حمض الكبريتيك المركز	روث	X944.2
غراء الايبوكسي	Uhu	45705	Uhu plus sofortfest 2min
عجلة الترشيح	Sutter أدوات	Lambda 10-2
غرف LabTek	VWR	734-2062
ليزر   ؛	المتغيرات Toptica-مختلفة (الأطوال الموجية 375 - 785 نانومتر)
تتوفر عدسة	Thorlabs, Newport-DGS
NTA-Ni (الدهون)	Avanti Lipids	790404C	بالفعل في Choroform-حل نسخة سلمت من البديل ملح nicekl موصى
به POPC (الدهون)	أفانتي الدهون	850457C	بالفعل في النسخة
التي تم حلهاالمجهر Zeiss Axiovert 200		Zeiss-mirrors
	Thorlabs	BB1-E02
المرشحات البصرية	AHF و Chroma و Semrock		تتوفر مجموعات المرشحات للعديد من المجموعات المختلفة من الأصباغ راسم
الذبذبات	BK Precision & nbsp ؛	2120C
فوسفات مخزن محلول ملحي (PBS)	تقنيات الحياة	14190-136	degas قبل الاستخدام
المنظار	Thorlabs	RS99 / M
picodent twinsil 22	Picodent	13001000	بديل لمقياس طاقة الغراء الايبوكسي
Lasermate-Q	Coherent-أي		مقياس طاقة حساس في النطاق الطيفي المستخدم سيفعل
مولد النبض	أنظمة أبحاث ستانفورد	SRS DG535 & nbsp ؛
مرشح مكاني	Thorlabs	KT310 / M
مرشح حقنة 0.2 & مايكرو ؛ م	Millipore	GVWP04700
هدف apochromat قادر على TIRF 100x ، NA 1.46	Zeiss	440782-9800-000
ثلاثي كلورو الميثان / الكلوروفورم	Roth	3313.1
أنابيب لبولي كربونات الطرد المركزي الفائق 1.00 مم ، 11 مم × 32 مم & nbsp ؛	ثيرمو فيشر	45237
Sorvall أجهزة الطرد المركزي الفائقة	ثيرمو فيشر	RC M150GX
دوار الطيف المركزي الفائق	الحراري فيشر	S120-AT2
الطيف الضوئي للأشعة فوق البنفسجية Nanodrop 2000c	مضخة فراغ فيشر
	الحرارية VWR	181-0248