Method Article

تقدير حجم الجذعية القولون الطفرات خلية

DOI:

10.3791/53240

⸱

September 25th, 2015

 , 
1Department of Pharmaceutical Sciences, University of Pittsburgh

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أبلغنا عن تحسينات كبيرة في القياس القابل للتكرار لطفرات الخلايا الجذعية القولونية الجسدية بعد تعرض الفئران للعوامل الضارة بالحمض النووي المحتملة.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

القدرة على قياس الطفرات الخلايا الجذعية هي أداة قوية لتحديد في عدد السكان خلية بالغ الأهمية إذا، وإلى أي مدى، يمكن أن مادة كيميائية تحفز الطفرات التي تؤدي المحتمل إلى السرطان. استخدام لفحص الأنزيمية لتحديد الطفرات الخلايا الجذعية في العاشر مرتبطة نازعة الجلوكوز 6 فوسفات الجينات ذكرت سابقا. 1 هذا الأسلوب يتطلب إعداد أقسام المجمدة وحضانة الأنسجة مقطوع مع خليط التفاعل التي تعطي اللون الأزرق إذا كانت الخلايا تنتج وظيفية نازعة الجلوكوز 6 فوسفات (G6PD) الانزيم. إن لم يكن، والخلايا تظهر بيضاء. قمنا بتعديل خليط التفاعل باستخدام الأمثل مجمع قطع درجة الحرارة (أكتوبر) المتوسطة بدلا من البولي فينيل الكحول. هذا يسهل قياس درجة الحموضة، ويزيد من ذوبان المكونات تلطيخ G6PD ويحد من انتشار انزيم G6PD و. لإثبات أن طفرة حدثت في الخلايا الجذعية، يجب على سرداب كامل تفتقر G6PD الأنزيميةالنشاط. إلا إذا تؤوي الخلايا الجذعية طفرة G6PD المظهرية وجميع ذرية في سرداب تفتقر G6PD النشاط الأنزيمي. للتعرف على خبايا مع طفرة الخلايا الجذعية، وقطعت أربعة أقسام المجمدة المجاورة متتالية (مستوى) في 7 ميكرون سمك. هذا النهج جعل التخفيضات المجاورة يوفر التشكل التي سرداب وتحور بشكل كامل منذ وسيراعى في نفس سرداب تحور في الفروع المجاورة. وكانت الشرائح مع عينات الأنسجة التي كانت أكثر من 50 ميكرون وبصرف النظر مستعدة لتقييم ما مجموعه> 10 4 الخبايا في الماوس. تردد طفرة هو عدد المرصودة تحور (أبيض) الخبايا ÷ من قبل عدد من النوع البري (الأزرق) الخبايا في مجموعة العلاج.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعتقد أن سرطان القولون لإشراك التعرض للعوامل البيئية والمكونات الغذائية التي يمكن أن تضر الحمض النووي وإنتاج تفعيل الطفرات الجسدية في الجينات المسرطنة (مثل ß-catenin) أو تعطيل الطفرات في جينات الورم القامع (على سبيل المثال، APC). ومن المفترض أن هذه الطفرات الهامة تحدث في الخلايا الجذعية القولون. بسبب بنية فريدة من سرداب ظهارة القولون، فمن الممكن لقياس الطفرات الخلايا الجذعية في القولون بعد تعريض الحيوانات للمواد الكيميائية المرتبطة القولون التسرطن. كما أن الكثير من الانزيمات المرتبطة X بمثابة مؤشرات لالطفرات التي تحدث في الخلايا الجذعية، حيث أن الطفرات سوف تكون موجودة في جميع الخلايا داخل سرداب.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتمت الموافقة على الإجراءات التجريبية والمعاملة الأخلاقية للحيوانات من جامعة بيتسبرغ IACUC (بروتوكول # 1104674).

1. إعداد G6PD تلطيخ خليط

ملاحظة: تأكد من أن تركيز النهائي من كل الكواشف هي على النحو التالي؛ 5 ملي الجلوكوز 6 فوسفات (G6P)؛ 2 مم NADP، 5 ملي MgCl 2، 0.35 ملي 1-ميثوكسي-5-methylphenazinium كبريتات الميثيل (MMPMS) و 0.8 ملي NBT. 1،8،9 لكل كاشف تم اشتقاق التركيز الأولي ل40 مل الحجم النهائي. وقد الحلول الطازجة وتستخدم كل يوم.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Results

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    القدرة على قياس القولون الطفرات الخلايا الجذعية في الحيوانات يوفر طريقة فريدة من نوعها لربط الطفرات إلى تحريض السرطان. عادة، فمن المفترض أن الخطوة الحاسمة في التسرطن ينطوي على تفعيل الطفرات في الجينات المسرطنة و / أو تعطيل الطفرات في الجينات الكابتة للورم. نحن حقن C57BL / 6 الفئران مع 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني أو 10 مغ / كغ AOM في 200 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني. AOM هو مادة مسرطنة معروفة القولون. 5-7 في 90 يوما حللت كولون للطفرات الخلايا الجذعية. مطلوب هذا الوقت .......

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Discussion

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    غالبا ما يتم تحديد تأثير السمية للمركب بقدرته على تعديل الحمض النووي. ويتم ذلك عادة من خلال عزل الأنسجة وقياس مستوى عالمي من الحمض النووي adducts. لAOM، وهذا ينطوي على قياس O 6 -methylguanine adducts في القولون. باستخدام هذه المعلومات النهج على الضرر في غضون أنواع معينة من الخلايا، مثل في محراب الخلايا الجذعية، يتم فقدان. بالإضافة إلى ذلك، ناتج إضافة DNA ليست هي نفسها كما طفرة منذ فقط مجموعة فرعية صغيرة من adducts يتم تحويلها في نهاية المطاف إلى الطفرات ثابتة. 12

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Disclosures

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

    Acknowledgements

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    الكتاب ليس لديهم الاعترافات.

    ....

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Materials

    List of materials used in this article
    NameCompanyCatalog NumberComments
    الكواشف
    نيتروبلو تيترازوليوم
    NADP
    الجلوكوز -6-فوسفات
    1-ميثوكسي -5-ميثيل فينازينيوم كبريتات
    ميثيل فورماميد
    فوسفات عازلة (الرقم الهيدروجيني 7.4
    مركب درجة حرارة القطع الأمثل (OCT)   ؛
    معدات
    مجهر ضوء مجهزة بكاميرا 5 ميجابيكسل
    غرفة دافئة  
    ميثيل ثنائي

    References

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Griffiths, D. F., Davies, S. J., Williams, S., Williams, G. T., Williams, E. D. Demonstration of somatic mutation and colonic crypt clonality by X-linked enzyme histochemistry. Nature. 333 (6172), 461-463 (1988).
    2. Griffiths, D. F., Sacco, P., Williams, G. T., Williams, E. D.

    Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

    Reprints and Permissions

    Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

    Request Permission

    Tags

    Colonic Stem CellsG6PD MutationMutation FrequencyFrozen SectionsEnzymatic AssayOCT MediumLight MicroscopyCrypt AnalysisSomatic MutationsStem Cell Quantification

    Related Articles