العديد من أنواع أورام الدماغ البشرية مترجمة في مناطق محددة داخل الدماغ ويصعب نموها في الثقافة. يتناول هذا البروتوكول دور البيئة المكروية للورم ويبحث في العلاجات الدوائية الجديدة من خلال تحليل خلايا ورم الدماغ الأولية الفلورية التي تنمو في شريحة دماغ فأر عضوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ورم في المخ / شريحة عضوي النمط المشارك ثقافة النظام لدراسة ورم المكروية والمستهدفة المخدرات العلاجات
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أورام الدماغ هي سبب رئيسي للمراضة والوفيات المرتبطة بالسرطان. من الصعب تطوير علاجات جديدة لهذه السرطانات ، حيث لا يمكن زراعة العديد من هذه الأورام بسهولة في ظروف الاستزراع القياسية. وسعت مزارع الغلاف العصبي في ظل ظروف خالية من المصل والطعوم الغريبة تقويم العظام نطاق الأورام التي يمكن الحفاظ عليها. ومع ذلك ، لا يزال من الصعب نشر العديد من أنواع أورام المخ أو دراستها. هذا ينطبق بشكل خاص على أورام الدماغ لدى الأطفال مثل الأورام النجمية الشعرية والأورام الأرومية النخاعية. يصف هذا البروتوكول نظاما يسمح بزراعة أورام الدماغ البشرية الأولية في المزرعة. يمكن استخدام هذا الاختبار الكمي للتحقيق في تأثير البيئة المكروية على نمو الورم ، ولاختبار العلاجات الدوائية الجديدة. يصف هذا البروتوكول نظاما تزرع فيه خلايا ورم الدماغ المصنفة بالفلورسنت على شريحة دماغية عضوية من فأر صغير. يمكن دراسة استجابة الخلايا السرطانية للعلاجات الدوائية في هذا الاختبار ، من خلال تحليل التغيرات في عدد الخلايا الموجودة على الشريحة بمرور الوقت. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن لهذا النظام معالجة طبيعة البيئة المكروية التي تعزز عادة نمو أورام الدماغ. يوفر مقايسة الزراعة المشتركة لشريحة النمط العضوي لورم الدماغ نظاما مناسبا لاختبار أدوية جديدة على الخلايا السرطانية البشرية داخل بيئة مكروية للدماغ.
المقدمة
جعلت أبحاث السرطان مؤخرا التطورات الهامة في تحديد الطفرات الجينية، والتغيرات الجزيئية والعلاجات الممكنة لمجموعة متنوعة من أورام المخ. وعلى الرغم من هذا التقدم، لا تزال أورام المخ واحدة من الأسباب الرئيسية للوفيات المرتبطة بالسرطان للبالغين والأطفال. وتشمل العوامل التي تحد في مجال البحوث ورم في المخ القيود المفروضة على توفر عينات المريض الابتدائية وخطوط الخلايا وصعوبة في تكرار المكروية الدماغ فريدة من نوعها وغير المتجانسة في النظم التجريبية يمكن الوصول إليها. بالنسبة لكثير من أورام الدماغ الشروط المطلوبة للحفاظ على الخلايا السرطانية مع مرور الوقت ليست معروفة بعد. حتى لعلاج أورام المخ التي يمكن زراعتها في تعليق خلية كما neurospheres، وظروف ثقافة قد تؤثر على الخلايا السرطانية 1،2. في الواقع، فإن إضافة عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية أو عامل نمو البشرة لتشجيع انتشار وتمنع التمييز قد يغير التعبير الجيني 1. طرق أخرى لنمو الخلايا السرطانية من هذا القبيلكما نشر الورم في الفئران عن طريق طعم أجنبي مثلي أو تحت الجلد من الخلايا السرطانية هي فحوصات قيمة، ولكنها محدودة بسبب عوامل مثل الوقت من تطوير ورم (وخاصة بالنسبة للأورام درجة منخفضة)، والتكلفة، وعدد الخلايا السرطانية التي يمكن حقنها ودرس . الأساليب الحالية وبالتالي لخلايا ورم في الدماغ البشرية المتنامية غير كافية للحفاظ على أنواع الأورام معينة، وغالبا ما توفر بيئات اصطناعية التي لا تحاكي بشكل وثيق في الجسم الحي بيئات الورم.
أنواع متميزة من أورام الدماغ عند الأطفال تنمو في مواقع متخصصة للغاية داخل المخ [3، 4] وهذا من المرجح أن تعكس متطلبات microenvironmental متميزة لنمو الورم [5]. يصف هذا البروتوكول بوضع نظام جديد حيث الخلايا التي يصعب نشر في ظروف التربية العادية يمكن زراعتها في المكروية الدماغ عضوي النمط الذي يحاكي في ظروف نمو الورم الجسم الحي. في هذا الاختبار الكمي، fluorescently المسمىومطلي الخلايا السرطانية في الدماغ في الأحداث شرائح عضوي النمط مخ الفأر ومراقبتها مع مرور الوقت. هذا الاختبار يمكن أن تستخدم لدراسة تأثير المكروية على نمو الورم، واختبار علاجات دوائية جديدة في المكروية الدماغ ذات الصلة سريريا.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد أجريت الإجراء التالي التي تجرى على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المعاهد الوطنية للصحة وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان السرطان المؤسسي دانا فاربر: بيان الأخلاق. وجرى استعراض جميع المواد الإنسان العمل الذي يقوم به المجلس لجان المراجعة المؤسسية للبريغهام ومستشفى النساء ودانا فاربر للسرطان معهد وجامعة ستانفورد للاستخدام المناسب، أن المستنيرة تم الحصول عليها من جميع المواد عند الحاجة، والتنازل المناسب لمتطلبات الموافقة تم الحصول على دراسات المخاطر ضئيلة.
الجدول الزمني للبروتوكول الثقافة شريحة:
الشكل 1. الجدول الزمني للبروتوكول استئصال ورم من الدماغ / شريحة عضوي النمط المشارك الثقافة. هذا الرقم يصور الجدول الزمني لإجراء ثقافة شريحة يشمل جميع الأيام الثمانية سو التجربة والخطوات الرئيسية لهذا الإجراء. الجدول الزمني نسبة إلى يوم 0 عندما ومطلي الخلايا على شريحة من أجل تسليط الضوء على أهمية البدء في أيام الإجراء قبل خلايا الطلاء. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
1. تشريح العازلة
- إعداد 15 ملي HEPES (1 M)، 6.5mg / الجلوكوز مل، 1.3 ملي MgSO4 (1 M)، و 20 ملي بوكل (2 M)، و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين في 1X HBSS.
- ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 مع هيدروكسيد الصوديوم.
- تصفية وتخزينها في -20 ° C.
2. شريحة الثقافة وسائل الإعلام
- إعداد 2٪ B-27، 1٪ ملحق N2، 1٪ البنسلين / الستربتومايسين، 1٪ Glutamax، و 1.5 ملغ / مل الجلوكوز في Neurobasal-A ناقص الفينول متوسطة الأحمر.
- تصفية وتخزينها في -20 ° C. ذوبان الجليد عند الحاجة، وتجاهل بعد 1 أسبوع في 4 درجات مئوية.
ملاحظة: يمكن أن يتم الإجراء التالي حتى علىقبل البدء في تشريح يوم ه. - 3٪ انخفاض نقطة انصهاره الاغاروز
ملاحظة: يمكن أن يتم إجراء متابعة ليوم واحد قبل البدء في تشريح. - مزيج 0.9 ز نقطة انصهار منخفضة الاغاروز إلى ~ 31 مل من العازلة التشريح، والميكروويف لمدة 25 ثانية مع غطاء فضفاض. الميكروويف حتى يذوب والتأكد من خليط لا تجاوز.
- الحفاظ على 55-65 درجة مئوية لحين الحاجة إليها.
ملاحظة: يمكن أن يتم إجراء متابعة ليوم واحد قبل البدء في تشريح.
4. معطف ثقافة إدراجات شريحة مع Laminin
ملاحظة: يمكن أن يتم إجراء متابعة ليوم واحد قبل البدء في تشريح.
- في نسيج الثقافة هود، وذلك باستخدام ملقط معقم، ضع شريحة واحدة ثقافة إدراج في كل بئر من لوحة 6 جيدا (مطابقة عدد من شرائح كنت تنوي الحصول على حوالي 12 يمكن جمعها من إجراء واحد. هو مكتوب الإجراء التالي ل ست شرائح). ملء 15 مل المخروطية ر أوبي مع برنامج تلفزيوني 1X (800 ميكرولتر / إدراج) وإضافة laminin (10 ميكروغرام / مل).
- إضافة 800 ميكرولتر من الخليط laminin إلى أعلى كل إدراج ثقافة شريحة. احتضان عند 37 ° C لحين الحاجة إليها.
5. التحضير للتشريح
- ملء كل بئر من لوحة 6 جيدا مع 1200 ميكرولتر من وسائل الإعلام ثقافة شريحة. ملء أي الآبار غير المستخدمة مع 1200 ميكرولتر PBS وملء الفراغ وسط لوحة مع 5 مل 1X PBS. تخزين هذا الطبق عند 37 درجة مئوية.
- تعقيم أدوات تشريح في الايثانول 70٪. مسح vibratome شفرة مع الأسيتون لإزالة النفط وتعقيم قبل الاستخدام.
- وضع ثلاثة 35 مم 2 الأطباق وخمسة 10 سم 2 أطباق زراعة الأنسجة في غطاء محرك السيارة. ملء واحدة 10 سم 2 طبق مع العازلة تشريح ومكان على الجليد.
ملاحظة: عملية ولادتها في وقت واحد.
6. تشريح
ملاحظة: عملية ولادتها في وقت واحد.
وفاق / ftp_upload / 53304 / 53304fig2.jpg "/>
الشكل 2. التخفيضات تشريح. هذه الصور تظهر تخفيضات تشريح اللازمة لإزالة الجمجمة من دماغ الفأر P6. وترد التخفيضات خطوط منقط. (A) قطع يظهر 1. يتم إجراء تخفيضات 1 و 2 من جذع الدماغ / الخلفي ثنائيا الاتصال محجر العين على كل جانب .. (B) يخفض يتم عرض 3 و 4. قطع 3 مصنوع من محجر العين واحدة إلى التخفيضات التي تربط أخرى 1 و 2. قص 4 يبدأ في خط الوسط لقطع 3 ويستمر نحو طرف الأنف تقسيم الجمجمة بين بصيلات الشم (مقياس بار = 4.4 ملم). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
- تخدير الماوس P6 باستخدام التعرض الأيزوفلورين (100٪ الأيزوفلورين). بعد حوالي 5 دقائق تباطأ عند التنفس أو أن هناك أي علامة على التنفس، وسرعان ما قطع رأسالفأر مع مقص حاد. رذاذ الرأس مع 70٪ من الإيثانول ومكان في صحن زراعة الأنسجة.
- باستخدام الملقط حادة كبيرة عقد رئيس ثابت عن طريق الاستيلاء على الأنف. باستخدام مقص تشريح المتوسطة الحجم، وإزالة الجلد الزائد للكشف عن الجمجمة.
- إجراء تخفيضات 1 و 2 عن طريق قطع الجمجمة بشكل ثنائي، من الخلفي من الجمجمة نحو الأمام على كل جانب، وربط قطع لتجويف العين. الحفاظ على غيض من مقص أقرب إلى الجمجمة ممكن لتجنب تلف الأنسجة.
- لقطع 3، واستخدام مقص الربيع الصغيرة للاتصال تخفيضات 1 و 2. ثم استخدام الملقط حادة صغيرة لتقشر بلطف الجمجمة.
- باستخدام مقص الربيع الصغيرة، وقطع بلطف الجمجمة المتبقية على طول خط الوسط على القمة، بحيث الجمجمة المتبقية تصبح 2 نصفين (الشكل 2، وقطع # 4). باستخدام ملقط تقشر الجمجمة للكشف عن اثنين من بصيلات الشم.
- إدراج ملعقة مسطحة الوجه (مبلل مع العازلة تشريح، وبالتالي فإن الأنسجة لا التشبث به) بين بottom من الدماغ وقاعدة الجمجمة، وإزالة بلطف الدماغ ووضع في صحن يحتوي عازلة تشريح على الجليد.
- كرر الخطوة 6 للحصول على الدماغ الثاني تشريح ل
7. تضمين العقول في الاغاروز
- وضع اثنين من 35 ملم 2 أطباق مفتوحة على الجليد ومسح أسفل زوج من الملقط حادة كبيرة مع 70٪ من الإيثانول.
- صب 3٪ منخفضة ذوبان نقطة الاغاروز (المعد في الخطوة 3) في أطباق اثنين حتى أشكال قبة على القمة. تعيين جهاز ضبط الوقت لمدة 3 دقائق. في 3 دقائق (اختبار عن طريق لمس حافة مليئة الاغاروز القبة، إذا بلمرة الاغاروز يمكن ملاحظة، انها جاهزة) التقاط الدماغ واحد مع ملقط حادة والمكان إلى جانب وجود 35 مم طبق مملوء الاغاروز، ثم التحرك إلى وسط الطبق (هذا يزيل عازلة تشريح الزائدة حول الدماغ لذلك يتصاعد أفضل).
- أكرر للدماغ 2 الثانية. بدء الموقت لمدة 10 دقيقة.
- بعد 10 دقيقة، تضاف ملعقة مسطحة في الفضاء بينالاغاروز وطبق لموسيقى البوب خارج الاغاروز بلمرة تحتوي على العقول P6.
- استخدام شفرة حلاقة شقة لتقليم الاغاروز إلى المكعب حول الدماغ، والتأكد من أن حواف هي كما مستقيم ممكن.
- وضع superglue على لوحة vibratome في شريطين. ثم، والتقاط الاغاروز شنت الدماغ وبلطف إسقاطه إلى أسفل على الغراء، ووضع لشرائح السهمي. تفعل الشيء نفسه للدماغ الآخرين. تأكد تصطف على حد سواء العقول مع بعضها البعض.
- السماح للالغراء الجاف في RT لمدة 5-8 دقيقة. خلال هذا الوقت، وملء منطقة حامل الجليد من vibratome مع الثلج المجروش والماء.
8. التقطيع مع Vibratome
- وضع خزان القطع في منطقة حامل الجليد، تحريك علامة التبويب إلى اليمين لتثبيته في مكانه.
- باستخدام برنامج تشغيل رأس المسمار دائري، والتقاط لوحة vibratome دائرية مع العقول لصقها على ذلك، وأنها تناسب في الخزان. إزالة سائق المسمار وتأمين لوحة في مكان مع الالبريد سداسية الرأس المسمار سائق. تأكد من أن لوحة وخزان قطع راسخة في مكانها.
- باستخدام ملقط، وبيك اب شفرة vibratome، يصلح لها في قطع الرأس، وقفل في مكان مع سائق المسمار سداسية. ثم، وتأمين قطع الرأس مع شفرة تعلق على vibratome باستخدام المسمار الجولة.
- طرح موقف حلاقة لأقرب إلى العقول agarose جزءا لا يتجزأ وقت ممكن، في حين التأكد من الحلاقة هي على نفس الارتفاع (أو فوق) العقول. ملء الغرفة مع المخزن ما يكفي تشريح الباردة لتغطية شفرة.
- الصحافة ↕ الزر مرة واحدة (يجب أن نرى ذلك وميض، ويعرف هذا الزر حدود عندما نصل سوف يذهب ذهابا وإيابا)، ثم اضغط "إلى الأمام" لخفض الدماغ جزءا لا يتجزأ، وإطلاق سراح يدويا حتى مسح الحلاقة كتلة agarose. اضغط على الفور ↕ الزر مرة أخرى، وهذا سوف تحدد نهاية النطاق لقطع التلقائي.
- اضغط على زر "واحد / CONT" مرة واحدة ولآيت التي كتبها CONT يجب أن تستمر. تعيين سماكة القطع إلى 400-450 ميكرون، وتهتز تردد ل5،5-6، وسرعة إلى 4. وسيكون هذا الإعداد التشذيب.
- اضغط على زر "بدء / إيقاف" مرة واحدة، ويجب أن يبدأ القطع التلقائي. اضغط على "وقفة" لجمع الأنسجة باستخدام ملعقة ذات ثقوب، حسب الحاجة. ينبغي أن يستغرق حوالي 5-10 دقيقة، للوصول إلى أقرب إلى خط الوسط. عند هذه النقطة، اضغط على "وقفة" وتغيير السرعة إلى 3 وتغيير سماكة 200 ميكرون. لا نجمع شريحة الأولى المنتجة بعد إجراء هذا التغيير.
- سوف شرائح المرجوة من 200 ميكرون سمك يكون في البصلة الشمية من خلال المخيخ تعريف جيد. نقل كل شريحة على النحو المرغوب فيه يتم قطع الى 6 لوحات جيدا مليئة عازلة تشريح على الجليد. القيام بذلك عن طريق تحريك عازلة في غرفة التشريح في جميع أنحاء الأنسجة لتعويم شريحة، لمسها أقل قدر ممكن، رفعه من المخزن المؤقت عندما يكون مباشرة على ملعقة فترة زمنية محددة. عادة حوالي 12 شرائح مع الهياكل المطلوبة يمكن جمعها. شرائح يمكن أن تترك في تشريح عازلة على الجليد لمدة تصل إلى 20 دقيقة.
- بينما شرائح هي على الجليد، واخراج لوحة 6 جيدا مع تدرج يجري المغلفة مع laminin من 37 درجة مئوية الحاضنة. في غطاء محرك السيارة تشريح تجاهل laminin مع الحرص على عدم الإضرار تدرج. إضافة 3.5 مل من شريحة سائل الإعلام والثقافة إلى أعلى كل إدراج. والجزء العلوي من وسائل الإعلام تشكل على شكل قبة من دون إراقة للخروج الى الآبار.
9. طلاء للشرائح على إدراجات
- باستخدام أداة ملعقة فترة زمنية محددة، ضع شريحة الدماغ في وسائل الإعلام على إدراج، دفع بلطف شريحة لتكون مغمورة تماما. أكرر لجميع شرائح.
- استخدام P1000 لاستخلاص 1 مل من شريحة سائل الإعلام والثقافة من أعلى إدراج والاستغناء عليه في قاع البئر. إزالة والتخلص من الزائد وسائل الإعلام حتى حواف الاغاروز حول الدماغ slicebecome مرئية. هل هذا للشرائح المتبقية.
- التقاط رانه إدراج بواسطة حافة بالملقط، والميل وإزالة وسائل الاعلام الزائدة. ثم، ونقل بسرعة إدراج في 35 ملم 2 طبق تحتوي على 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة شريحة. استخدام 2 أزواج من الملقط حادة لإزالة الاغاروز في جميع أنحاء الأنسجة، مع الحرص على عدم تمتد / شريحة الضرر أو كزة ثقب في غشاء (أسهل إذا قمت بإجراء المسيل للدموع على حافة جدا من الاغاروز، ثم مزق الاغاروز من كلا الجانبين). ثم نقل إدراج العودة إلى لوحة 6 جيدا وتكرار للشرائح المتبقية.
- في نسيج الثقافة هود مع منفاخ قبالة (لمنع شرائح من الجفاف) إزالة شظايا الاغاروز من كل الغشاء.
- نقل شرائح لوحة 6 جيدا أعدت في الخطوة 5.1 و تخزين لوحة عند 37 ° C. احتضان شرائح لمدة 24-48 ساعة.
10. تغيير الثقافة وسائل الإعلام شريحة
- كرر الخطوة 5.1 مع لوحة 6 جيدا جديدة.
- في نسيج الثقافة هود مع منفاخ قبالة، ونقل إدراج لوحات جديدة 6-جيدا تابعaining سائل الإعلام شريحة جديدة.
11. طلاء الخلايا السرطانية على شريحة
- يصوتن الصبغة سم الجاذبة وتدور على سرعة متوسطة لمدة 2 دقيقة.
- تدور باستمرار الخلايا السرطانية تستخدم لتراكب في 201 x ج لمدة 5 دقائق. resuspend ثم في 2 مل من وسائل الإعلام ثقافة شريحة.
- إضافة 7 ميكرولتر من سم-الجاذبة في مل 2 من الخلايا وسائل الإعلام واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
- تدور باستمرار الخلايا في 201 x ج لمدة 5min و resuspend في 200 ميكرولتر من وسائل الاعلام تشريح. يسحن بلطف لفصل الخلايا (10-20 مرات أو حتى يزول بيليه) ثم قم بإضافة 800 ميكرولتر تشريح وسائل الإعلام لجعل 1000 ميكرولتر اجمالى حجم.
- عد الخلايا السرطانية قابلة للحياة باستخدام التريبان الأزرق. إضافة المجهرية الفلورية الخضراء إلى الخلايا السرطانية، في نفس التركيز كما الخلايا. وهذه المجهرية الخاملة بمثابة السيطرة. تدور باستمرار الخليط خلية / microsphere في 201 x ج لمدة 5 دقائق و resuspend في المبلغ المطلوب من وسائل الإعلام ثقافة شريحة. لوحة الخلايا في مناطق ذات كثافة من 6000 خلية / SLالثلج في 65 حجم ميكرولتر. ويمكن زيادة عدد الخلايا مطلي لكل شريحة اعتمادا على تفضيل ومدى توافرها.
- في الثقافة غطاء محرك السيارة الأنسجة الاستغناء الخلايا في 65 ميكرولتر من وسائل الإعلام / شريحة على مركز للشريحة.
12. التصوير وإصلاح
ملاحظة: نيكون الكسوف ني C2si تستقيم تم استخدام متحد البؤر لاتخاذ مسح صورة كبيرة لشريحة السهمي كلها في 4X مع قنوات الفلورسنت الحمراء والخضراء. إذا ميزة المسح غير متوفرة، التقاط صور متعددة بالتسلسل عبر شريحة وفيما بعد غرزة الصور معا في فوتوشوب (باستخدام موقع المجهرية وحافة شريحة للتنقل).
- في اليوم التالي (يوم 1 التصوير)، ونقل إلى ست شرائح 35 مم 2 الأطباق مع 1 مل شريحة سائل الإعلام والثقافة. صورة كل شريحة واحدة في وقت واحد على المجهر تستقيم الفلورسنت. خذ مسح صورة كبيرة لشريحة السهمي كلها في 4X مع قنوات الفلورسنت الحمراء والخضراء. الحفاظ الليزروربح نفس إعدادات لكل شريحة. في نهاية التصوير، نقل جميع شرائح العودة إلى لوحة 6 جيدا تحتوي على وسائل الاعلام شريحة جديدة.
- إذا كان المطلوب إضافة EDU، وغيرها من علامة انتشار المخدرات أو شرط، وخلق مخزون من وسائل الاعلام شريحة مع المخدرات التي سيتم استخدامها للتغييرات وسائل الإعلام يوميا لشرط المعاملة. وينبغي الأخذ في حالة العلاج في خطوة 12.1 (مباشرة بعد يوم 1 التصوير). يجب إضافة أي EDU أو انتشار علامة على وسائل الإعلام بدأت أيضا في 12.1 وتحديثها يوميا (استخدام EDU في 10 ميكرومتر).
- الصورة مرة أخرى في يوم 7 باستخدام نفس الإعدادات كما في يوم 1 الصور.
- بعد يوم واحد 7 التصوير اكتمال نقل كل شريحة في لوحة 6 جيدا مع بعضها يحتوي كذلك 1.2 مل من 4٪ لامتصاص العرق (PFA). بعناية وببطء إسقاط 1 مل إضافية من PFA على رأس كل شريحة. ترك في RT لمدة 1 ساعة.
- إزالة PFA من كل بئر ومن أعلى كل شريحة. يغسل كل 3X بشكل جيد مع برنامج تلفزيوني. تخزين الشرائح في برنامج تلفزيوني في4 ° C لتلطيخ أو تصاعد على الشرائح.
قد تحتاج إلى ضبط يماغيج إلى تعديل والأمثل لتفسير الصورة وجودة المجهر فضلا عن حجم الخلية السرطانية: مذكرة.
13. الكمي للصور (عن طريق يماغيج)
قد تحتاج إلى ضبط يماغيج إلى تعديل والأمثل لتفسير الصورة وجودة المجهر فضلا عن حجم الخلية السرطانية: مذكرة.
- في يماغيج، استخدم أداة المضلع على الخطوط العريضة لشريحة بأكملها أو المنطقة التي تريد قياسها كميا. إضافة هذا التحديد إلى مدير ROI حيث يمكنك تسميته وحفظه.
- انقر بزر الماوس الأيمن على المنطقة المحددة واختيار مكررة. اسم هذه الصورة المكررة مع المنطقة، شريحة، اليوم. اضغط CTL + التحول + E لعرض المخطط التفصيلي، ثم حدد معالجة - طرح الخلفية - المتداول الكرة الشعاع = 4.
- بعد الطرح الخلفية، حدد "ضبط عتبة" في "صورة" القائمة المنسدلة. تحقق خلفية داكنة -؛ ننظر إلى الصورة بالتكبير وتعيين العتبة. كما يمكنك تحديد عتبة عن طريق تحريك شريط العتبة، التأكد من تضمين كل خلية / أبرز لكنها لم تدرج النقاط الصغيرة للغاية التي الحطام (أو أصغر من خلية). استخدام نفس العتبة لجميع الصور. نقل الإطار عتبة إلى الجانب.
- حدد "عملية" - "البحث ماكسيما" وتعيين التسامح الضوضاء بين 5 و 10 وتحقق ما يلي: اختيار نقطة المعاينة، نوع الانتاج كما جسيمات مجزأة، واستبعاد حافة ماكسيما، فوق عتبة أدنى. ثم إعادة تحديد المنطقة ذات الاهتمام بالضغط على CTL + التحول + E.
- حدد "تحليل الجزيئات" من القائمة المنسدلة تحليل. تعيين حجم البيكسل إلى 4-40 ودائرية ل0،00-1،00. أيضا النقر فوق "عرض الخطوط العريضة تراكب" "عرض النتائج" و "تلخيص"، ثم اضغط OK.
- تسجيل جميع البيانات الخام وملخص في وثيقة مايكروسوفت أوفيس. و"الكونت" لكل منطقة طق اللازمة لحساب التغير أضعاف على مدى أسبوع في الثقافة.
- كرر هذه العملية لجميع الصور ومجالات الاهتمام، والتأكد من أن عتبة والإعدادات الأخرى تبقى ثابتة.
- حساب التغير أضعاف في عدد الخلايا على شريحة خلال الأسبوع في الثقافة عن طريق قسمة عدد من الخلايا السرطانية على شريحة في يوم 7 من قبل عدد من الخلايا على شريحة يوم 1. وبالمثل، أضعاف تغيير في عدد الخلايا داخل كل منطقة ويحسب بقسمة عدد الخلايا في تلك المنطقة في يوم 7 من عدد الخلايا في تلك المنطقة في يوم 1.
- تنفيذ الخطوة 13.8 لالمجهرية كذلك. يجب أن يكون عدد microsphere على شريحة واحدة في يوم 7 كما في يوم 1 (طويت التغيير = 1). وبالمثل، يجب أن يكون عدد microsphere داخل كل منطقة في نفس يوم 7 كما في يوم 1 (طويت التغيير = 1). إذا يختلف التغيير طية من 1، وهذا يشير إلى تغييرات في شريحة التضاريس مع مرور الوقت.
14. تلطيخ
- الشريط قطعة من parafilm على الالبريد مختبر مقاعد البدلاء ورسم ستة دوائر مع السائل قلم مانع حلمة الثدي (واحد لكل شريحة، فقط أكبر من حجم شريحة). وضع حوالي 400 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في نقطة في منتصف كل دائرة. رقم أو تسمية الدوائر لتحديد كل شريحة.
- في 1 مل من برنامج تلفزيوني، واستخدام شفرة حلاقة لقطع مربع حول شريحة، وترك بعض المساحة من الغشاء حول شريحة. باستخدام ملقط تحرك قطع شريحة في الدائرة الأولى وبعناية تكمن شريحة على رأس فقاعة من برنامج تلفزيوني. ومن الضروري التأكد من أن شريحة لا أضعاف أكثر على نفسها أو الحصول على انقلبت رأسا على عقب خلال هذه العملية. ثم، وإزالة PBS من تحت شريحة ووضعها على رأس شريحة وإضافة المزيد من PBS إذا لزم الأمر للتأكد من أنها لا تزال مغمورة. كرر هذه الخطوة لكل شريحة.
- جعل 10 مل من 3٪ BSA في برنامج تلفزيوني. خذ 2 مل، وإضافة 100 ميكرولتر من ديجيتونين إليها. خلط وإضافة إلى شرائح لمنع وpermeabilize، 30 دقيقة في RT.
ملاحظة: استخدام وكلاء permeabilization الأخرى مثل ثلاثيوطن X-100 يؤدي إلى فقدان العلامات CM-الجاذبة. - إزالة permeabilization / حل الحجب وشطف 3X مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- إذا تلطيخ لEDU، اتبع الإرشادات التي قدمتها عدة لتجميع الخليط. ضعي الخليط لمدة 45 دقيقة. إذا تلطيخ مع الأجسام المضادة أخرى، يجب أن يكون الأمثل بروتوكول للتركيز الأجسام المضادة الأولية والثانوية (~ RT 1 ساعة للالابتدائي والثانوي). شطف 3X مع برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
- وصمة عار مع دابي 1: 1000 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق RT. شطف 2X مع برنامج تلفزيوني.
15. تركيب شرائح
- نقل شريحة إلى شريحة المجهر. تأكد من أن الجانب الغشاء مع شريحة يبقى مواجهة، ولا أضعاف أكثر على نفسها. رسم الحدود حول شريحة مع السائل مانع حلمة الثدي من ركلة جزاء.
- وضع ساترة زجاجية صغيرة (5 ملم) على كل جانب من شريحة (للحفاظ على شريحة من التلف). إسقاط اثنين أو ثلاث قطرات من Fluoromount-G (لالمناعي) على رأسشريحة لبالكاد تغطية ذلك. ثم تغطية ساترة طويلة شريحة (24 × 50 ملم).
- كرر لكل شريحة. ختم حواف الشرائح مع طلاء الأظافر وتخزينها في 4 درجات مئوية. هل التصوير متحد البؤر من تلطيخ.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
يجسد هذا القسم نوع النتائج التي يمكن توقعها من الاستفادة من ورم في المخ / عضوي النمط شريحة ثقافة مشتركة للتحقيق في تفضيل المكروية الإقليمي وكذلك لاختبار علاجات جديدة. وتبين لنا أن الفحص يهدف إلى تكرار المكروية لعلاج أورام المخ، باعتبارها المنظمة الأنسجة ويتم الحفاظ على الدولة التكاثري للشريحة (الشكل 3). علينا أن نبرهن أيضا أن الزيادة في عدد الخلايا السرطانية على شريحة مع مرور الوقت قد يرجع جزئيا إلى الهجرة من الخلايا على المكروية شريحة الدماغ (الشكل 4).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يصف هذا البروتوكول كيف خلايا ورم في المخ يمكن fluorescently المسمى ومطلي على جزء الدماغ سهمي على فأرة الحاسوب P6 ثم مراقبة لمدة أسبوع واحد في الثقافة. ويمكن استخدام هذا ورم في المخ / عضوي النمط شريحة شارك في الثقافة الاختبار لتحديد تأثير المكروية الإقليمية على عدد الخلايا السرطانية، ويمكن أيضا أن تستخدم كنظام لقياس فعالية من العلاج بالعقاقير الجديدة على نمو الورم البشري. وقد استخدمت دراسات سابقة استراتيجية مماثلة لتقييم دور الدماغ الصغير للبيئة على العصبية 7،8 انتشار ال...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
لا يوجد لدى أي من المؤلفين مصالح متضاربة أو مصالح متضاربة.
شكر وتقدير
هذا العمل مدعوم بمنح من المعاهد الوطنية للصحة (P01CA142536 إلى RAS ، T32CA009361 إلى DPY) ومؤسسة الورم النجمي منخفض الدرجة للأطفال.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| هيبس | إنفيتروجين | 17504044 | |
| الجلوكوز | إنفيتروجين | 17502048 | |
| بينسيلين ستربتومايسين | لايف تكنولوجيز | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14185-052 | |
| B-27 | Life Technologies | 17504-044 | |
| N2 | Life Technologies | 17502-048 | |
| Glutamax | Life تقنيات | 35050061 | |
| Neurobasal-A- متوسط ناقص الفينول الأحمر | Invitrogen ؛ | 12349015 | |
| نقطة انصهار منخفضة Agarose | Promega | V2111 | |
| إدراج ثقافة الشريحة | Milipore | PICM0RG50 | |
| laminin | Invitrogen | 23017015 | |
| Cm-DiI | Invitrogen | V22888 | |
| EDU (وضع العلامات والكشف) | لايف تكنولوجيز | c10337 | |
| المجهرية | لايف تكنولوجيز | F-21010 | |
| Vibratome | Leica | ||
| متحد البؤر | نيكون Eclipse Ni C2si | ||
| ImageJ software | |||
| نظارات غطاء 5 مم | فيشر العلمي | 64-0700 (CS-5R) |
المراجع
- Heddleston, J. M., et al. Glioma stem cell maintenance: the role of the microenvironment. Curr Pharm Des. 17 (23), 2386-2401 (2013).
- Sasai, K. Shh pathway activity is down-regulated in cultured medulloblastoma cells: implications for preclinical studies. Cancer Res. 66 (8), 4215-4222 (2006).
- Louis, D. N., et al. The 2007 WHO classification of tumours of the central nervous system. Acta Neuropathol. 114 (2), 97-109 (2007).
- Duffau, H., Capelle, L. Preferential brain locations of low-grade gliomas. Cancer. 100 (12), 2622-2626 (2004).
- Chourmouzi, D., et al. Manifestations of pilocytic astrocytoma: a pictorial review. Insights Imaging. 5 (3), 387-402 (2014).
- Buonamici, S., et al. Interfering with resistance to smoothened antagonists by inhibition of the PI3K pathway in medulloblastoma. Sci Transl Med. 2 (51), 51ra70(2010).
- Choi, Y., Borghesani, P. R., Chan, J. A., Segal, R. A. Migration from a mitogenic niche promotes cell-cycle exit. J Neurosci. 25 (45), 10437-10445 (2005).
- Chan, J. A., et al. Proteoglycan interactions with Sonic Hedgehog specify mitogenic responses. Nat Neurosci. 12 (4), 409-417 (2009).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three- dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nat Commun. 6, 6220(2015).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
