الموصوفة هي بروتوكولات لقياس التفاعلات الميكانيكية بين الخلايا الملتصقة والركائز المجهرية. ترتبط هذه التفاعلات ارتباطا وثيقا بسلوكيات الخلايا الأساسية بما في ذلك الهجرة والانتشار والتمايز وموت الخلايا المبرمج. تقدم البروتوكولات برنامجا مفتوح المصدر لتحليل الصور يسمى MechProfiler ، والذي يتيح تحديد القوى المعنية لكل منشور صغير.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
سهلة ودقيقة والميكانيكية التنميط على Micropost صالحة
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
ركائز زراعة الخلايا مع المنشورات الدقيقة المرنة المتكاملة تمكن المستخدم من دراسة التفاعلات الميكانيكية بين الخلايا ومحيطها المباشر. على وجه الخصوص ، التفاعلات بين الخلايا والركيزة هي الاهتمام الرئيسي. تعد مصفوفات micropost اليوم طريقة مميزة وراسخة مع مجموعة واسعة من التطبيقات التي تم نشرها على مدار العقد الماضي. ومع ذلك ، يبدو أن هناك تحفظا بين علماء الأحياء لتكييف هذه التقنية بسبب العملية الطويلة والصعبة لتصنيع micropost جنبا إلى جنب مع عدم وجود برامج يسهل الوصول إليها لتحليل صور الخلايا التي تتفاعل مع المنشورات الدقيقة.
قراءة القوة من المنشورات الدقيقة سهلة بشكل مدهش. يعمل المنشور المصغر مثل الزنبرك مع الخلية المتصلة بشكل مثالي عند طرفه. اعتمادا على الحجم ، تطبق الخلية القوة من هيكلها الخلوي من خلال نقطة التصاق بؤرية واحدة أو أكثر إلى micropost ، وبالتالي تشتيت المنشور الصغير. يرتبط مقدار الانحراف ارتباطا مباشرا بالقوة المطبقة في الاتجاه والحجم. يعد عدد المنشورات الدقيقة التي تغطيها الخلية وأنماط الانحراف اللاحقة مميزة وتسمح بتحديد قيم مثل القوة لكل عمود والعديد من المعلمات ذات الصلة بيولوجيا التي تسمح ب "التنميط الميكانيكي" للأنماط الظاهرية للخلايا.
يتم وصف طريقة ملائمة للتنميط الميكانيكي هنا تجمع بين الجيل الأول من المنشورات المصغرة الجاهزة للاستخدام المتاحة تجاريا مع حزمة برامج مطورة داخليا والتي يمكن الآن لجميع الباحثين الوصول إليها. كدليل على التطبيق النموذجي ، تم التقاط صور مفردة لخلايا سرطان العظام في الفحص المجهري ذو المجال الساطع للتنميط الميكانيكي لنماذج خط الخلايا للورم الخبيث. يسمح هذا المزيج من مستشعرات قوة الجر التجارية والبرامج مفتوحة المصدر للتحليل لأول مرة بالتنفيذ السريع لتقنية مصفوفة micropost في العمل المختبري الروتيني الذي يقوم به مستخدمون غير خبراء. علاوة على ذلك ، تمكن عملية التحليل القوية والمبسطة المستخدم من تحليل عدد كبير من صور micropost بطريقة عالية الكفاءة من حيث الوقت.
المقدمة
المقايسات خلية مقرها الحساسة والميكانيكية تسمح للتحقيق في الخلايا الملتصقة، مع مجموعة واسعة من التطبيقات التي تعكس الدور المحوري الذي يمكن أن تلعبه الميكانيكا في بيولوجيا الخلية. هذه التطبيقات غالبا ما تركز على الآليات الأساسية التي تقود عمليات التحت خلوية أو السلوك خلية كاملة. من جهة، يمكن أن العوامل البيئية الخارجية مثل اضافية تكوين مصفوفة الخلوية أو مصفوفة الصلابة تؤثر بشكل كبير على الاستجابة الميكانيكية والبيولوجية للخلية. 1 والشيء نفسه يمكن ملاحظتها بعد استخدام فئات كثيرة من المركبات النشطة صيدليا، وآثار والتي هي غالبا ما تتميز باستخدام نماذج ثقافة الخلية. 2 وفي غيرها من الخصائص الوراثية اليد، مثل تلك التي تسببها طفرات جينية عفوية أو تجريبيا يسببها، ويمكن أن تحدث تغيرات ملحوظة في النمط الظاهري الخلية التي ترتبط مع التغيرات في بنية الهيكل الخلوي وظيفة. 3 هذه الأمثلة ل فقط عدد قليل من كثير ممكنالموضوعات التي phenotyping الميكانيكي للخلايا هو ذات الصلة، وجرى التحقيق مع كل هذه مفيدة مع المصفوفات micropost.
وفي وقت كتابة هذا التقرير، تم نشر ما يقرب من 200 المقالات التي تصف التفاعل خلية micropost. هذه الأعمال مناقشة الجوانب النظرية للمبادئ انحراف micropost وكذلك الإرشادات العملية على صنعها. تم نشر المقالة الأولى التي تصف التفاعل بين الخلايا والمصفوفات micropost مرنة تان وزملاؤه في عام 2003. 4 وعلى النقيض من الكلاسيكية المجهري قوة الجر (TFM) حيث تستخدم ركائز لينة مستمرة لتقدير انقباض الخلايا nanonewton النطاق، تان وآخرون. وصف طريقة استخدام عدة عوارض رأسية متباعدة عن كثب مصنوعة من السيليكون والمطاط الصناعي. المزايا الرئيسية لهذه التقنية الخروج من اثنين من السمات الرئيسية. أولا من أجل تغيير خلايا واضحة الركيزة صلابة واحد يحتاج فقط إلى تغيير أبعاد micropost مع الحفاظتكوين الركيزة خلاف مستمر وبالتالي تجنب الاختلافات في طوبولوجيا السطحية والكيمياء. microposts الثانية تتصرف مثل الينابيع الفردية التي يمكن تحليلها بتحفظ مع قوة ودقة مكانية بناء على أمر من الالتصاقات البؤرية الفردية ويمكن أن تقلل من التحديات التحليلية التي هي ملازمة لتحليل مماثل من قبل ستاندرد TFM.
اليوم مجموعة من التطبيقات للصفائف micropost يتجاوز بكثير مجرد رسم الخرائط من القوات لبضع خلايا مفردة. على سبيل المثال، أكياما تقارير استخدام من الأنسجة سفينة ظهري معزولة عن يرقة العث بمثابة المحرك للمجموعة micropost، من أجل وضع الحشرات التي تعمل بالطاقة العضلية مستقلة الصغرى الروبوت. 5
ومع ذلك، فقد ركزت معظم التطبيقات المنشورة microposts على دراسات الحالات الطبية مثل العدوى أو السرطان. على سبيل المثال، تم استخدام المصفوفات micropost لدراسة توليد قوة المجمعة النوع الرابع الشعرة لبكتيريا gonorrhالمستعمرات أويا مقترن شلالات إشارة المعززة للعدوى. وقد استخدمت 6 آخرون microposts لدراسة خلايا سرطان الثدي تعامل مع المركبات الدوائية استهداف الهيكل الخلوي. 7
غالبا ما يوصف انحراف لmicropost باستخدام نظرية الكلاسيكية شعاع لناتئ مع نهاية الحمل على افتراض الخلية تعلق فقط على الحافة جدا من micropost. هنا F القوة المطبقة التي تسبب δ انحراف يعتمد على micropost في "الانحناء صلابة" ك ويحسب عن طريق:
(1)
مع E، I، وL يجري معامل يونغ، لحظة مجال الجمود وشعاع طول التوالي. ومع ذلك، النتائج من هذه المعادلة تعطي سوى تقريب العام للقوات في العمل منذ شعاع القص والثني وكذلك لا تؤخذ تزييفها الركيزة في ميلانالعد. وبالنظر إلى أن microposts تكون عادة مصنوعة من مواد لينة مثل polydimethylsiloxane (PDMS) المستندة مطاط السيليكون تحتاج هذه العوامل التي ينبغي إدراجها. . شوين آخرون أثبتت أن هناك مثل هذا عامل التصحيح بناء على نسبة العرض إلى الارتفاع micropost (L / D) والبوليمر المقابلة للنسبة بواسون ضد 8 وتعطى من قبل:
(2)
مع الميل T (ت) أن يكون معامل إمالة يتضمن كما يمكن العثور عليها في المادة نفسها المناسب المعلمة = 1.3:
(3)
وهذا يعني صلابة وmicropost لتصحيح ك المراسل هو نتاج خالص الانحناء صلابة ك = ك الانحناء ومعامل التصحيح نيوسقدمها:
(4)
لذلك، يجب أن يتم تنفيذ العمليات الحسابية قوة الخلية باستخدام الاختلاف أكثر دقة من المعادلة (1) القراءة الآن:
(5)
تأثير التصحيح يصبح أكثر وضوحا في أقرب وقت يتم استخدام القيم النموذجية لأبعاد micropost. على سبيل المثال، micropost 15 ميكرون طويل مع المقطع العرضي دائري وقطره 5 ميكرومتر المصنوعة من المطاط سيليكون القائمة على PDMS-يؤدي إلى معامل التصحيح 0.77 وبالتالي على حساب غير المصححة أن المبالغة قوات خلية المبذولة بنسبة 23٪. هذا يصبح أكثر حدة لmicroposts مع نسب أصغر.
تقليديا، كما تم على أساس micropost تحليل الصورة على شعاع المثالي نظرية الانحناء. في عام 2005 المجموعة التي كانت رائدة في استخدام ميكرصفائف opost نشرت برمجيات تحليل صورة مناسبة لتحليل micropost 9 البرنامج يتطلب ترخيص البرمجيات ويجب على المستخدم أن تأخذ ثلاث صور لكل موقف؛ واحد من كل من أعلى وأسفل طائرات micropost في اسطة نقل واحدة أخرى في وضع مضان مع الخلية الملون. بعد مقارنة المناصب العليا والسفلي لكل micropost البرنامج يحدد حقل القوة ناقلات ويحسب المعلمات ذات الصلة مثل قوة لكل وظيفة. وجود حزم البرامج الأخرى وذكرت المبادئ تحليلهم لفترة وجيزة في المواد ذات الصلة التي تصف لهم، ولكن هذه حزم البرامج التحليلية هي عموما ليست متاحة للجمهور. 10،11
ويمكن تصنيف صفائف micropost مصممة للقوات خلية رسم الخرائط إما يجري في تخطيط micropost متعامد أو أحد سداسية، وهذه الأخيرة التي لديها ميزة الثغرات مسافة واحدة بين جميع microposts الجار. microposts نموذجية هكتارلقد مقطع عرضي دائري وأبعادها تتراوح من 1.0 ميكرون إلى 10 ميكرون في القطر و2-50 ميكرون في الطول. 4 ومع ذلك، كما تم الإبلاغ عن microposts مع المقطع العرضي بيضاوي الشكل أو مربع. 12،13
استخدام مخاليط سيليكون استنادا PDMS-كمادة micropost يسمح لإضافة النانوية إلى الخليط. على سبيل المثال إضافة الكوبالت النانو قضبان تمكن التنشيط المغناطيسي للmicropost وبالتالي يعطي آخر درجة من الحرية للتصاميم تجريبية المحتملة. 14 معظم الجماعات تنتج صفائف micropost على ركائز صلبة مسطحة مثل غطاء زجاجي أو داخل طبق بتري. ومع ذلك، ذكرت مان وزملاء العمل مؤخرا مجموعة micropost شكلت على غشاء لمط 15 يسمح هذا التطبيق من خلية القوات تمتد إلى الخلايا الملتصقة أثناء دراسته يعيش خلايا التحت خلوية الردود ديناميكية من حيث انقباض الخلايا.
العاملين على نطاق واسع، ومعظم إنشوتستند عملية أسسنا لجعل صفائف micropost على الطباعة الحجرية الناعمة كما هو موضح في البروتوكولات الثاقبة من Sniadecki والزملاء. 16-18 في عمليات غرف الأبحاث قياسية قصيرة وتستخدم لتوليد المجهرية على رأس رقاقة السيليكون باستخدام مقاومة للضوء SU8. ويلي ذلك عملية النسخ حيث يلقي المطاط سيليكون على هياكل نقلها إلى قوالب. في الخطوة الثانية وتستخدم هذه القوالب لتكرار المجهرية الأولية باستخدام المطاط سيليكون على رأس الركيزة المختار. ولكن على الرغم من العدد الكبير والمتزايد من المنشورات المتعلقة تطبيقها، وإنشاء عملية التصنيع لmicroposts يأخذ قدرا كبيرا من الوقت حتى لخبراء الهندسة الدقيقة. هناك العديد من الخطوات العملية التي تتطلب التحسين والتكيف مع بيئة معملية محددة وتخطيط micropost أن يؤديا إلى مستوى جودة مقبول.
صفائف micropost التجارية متوفرة الآن في استعداد رس استخدام ("خارج على الرف") تنسيق مع جودة عالية على الدوام. على هذا النحو فهي بديل لعملية التصنيع المعقدة والطويلة اللازمة لإنتاج في الموقع. في هذه الورقة تم استخدام مجموعة micropost المتاحة تجاريا لرسم خرائط القوات الخلوية باستخدام مشرق الميدان صورة واحدة المجهري. الأهم توضح هذه المادة ويوثق تماما وظيفية برمجيات المصدر المفتوح اسمه MechProfiler، والذي يتوفر للتحميل كمادة تكميلية لهذه المخطوطة. نسخة الحفاظ بنشاط من البرنامج يمكن أيضا الاطلاع على http://www.orthobiomech.ethz.ch.
مزيج من "حاضرة" فحص وتحليل البرمجيات مفتوحة المصدر متوافق يخفض بشكل ملحوظ العقبة دخول إلى تحقيق تجارب TFM دقيقة. يمكن للباحثين من دون الوصول إلى أي مرافق غرفة نظيفة أو الخبرة لتطوير البرمجيات تحليل قوات الخلوية بنجاح. انها تمكن المستخدم من التركيز على mechanosensitivity الناتج الفحص بدلا من التكنولوجيا في حد ذاتها، ويجعل قياسات قوة الجر المتاحة للمجتمع الأوسع. وعلاوة على ذلك، وهذا هو خطوة هامة لتمهيد الطريق نحو الفحص التلقائي بالكامل من صفائف micropost.
برامج التحليل MechProfiler بمعالجة الصور في ملف تنسيق TIFF، PNG، BMP و JPG. يمكن أن تؤخذ الصور باستخدام مضان، الطوري أو مشرق الميدان المجهر الضوئي. تشغيل برنامج مستقل مع حرية ماتلاب مترجم وقت التشغيل (متوفر على العنوان التالي: الشكل 12) والخوارزميات الكامنة تسمح لمعالجة الصور مبسط، والتي تمكن المستخدم من معالجة الصور مع الخلايا وحيدة أو متعددة في حوالي 1 دقيقة. وعلاوة على ذلك، وهذه الخلايا قد تكون إما يعيشون أو "ثابتة".
برنامج MechProfiler قادر على زيادة كبيرة في تحليل البيانات الإنتاجية من خلال الاعتماد على استنساخ صفائف micropost التجاري الجودة، وبشكل أكثر تحديدا، الافتراضي & #8220؛ غير نحيد "موقف كل وظيفة في مجموعة يمكن افتراض ضد شبكة مثالية (الانحرافات التصنيع للحصول على الشبكة في صفائف المستخدمة في هذه الدراسة كانت أقل من 100 نانومتر).
في واحد قصير يفتح مجموعة مختارة من ملفات الصور لتحليل والمحاصيل منهم إلى المنطقة من الفائدة، ويحدد المشاركات التي كتبها مغطاة بخلايا أو التي تحتاج إلى التخلص منها، ويحدد المواقف آخر، وحساب الانحرافات / القوات ضد الشبكة المثالية، وأخيرا يوفر جميع البيانات خلية محددة مع وجود إمكانية للتصدير، بما في ذلك جدول المكتبية العادية.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. خلايا التثقيف على Micropost صالحة
ملاحظة: يجب تنفيذ جميع الخطوات في مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية لضمان العقم. وبالنظر إلى الكميات هنا هي لT25 قوارير زراعة الخلايا. هي الأمثل والمتوسطة وصفة وبذر خلية كثافة زراعة الخلايا للخطوط الخلايا السرطانية العظام HuO9 وM132.
- إعداد ثقافة خلية لزرع البذور على مجموعة micropost.
- تفقد نوعية ثقافة الخلية عن طريق وضع قارورة الثقافة على المجهر ضوء معيار. تأكد من أن الخلايا تظهر نمو نموذجي والتشكل من خلال تقدير كم من أسفل قارورة الثقافة وتغطيتها. A تغطية 70٪ -80٪ تعكس معدل نمو صحي. إيلاء الاهتمام لكمية من الخلايا العائمة لأنها تمثل الخلايا الميتة و / أو ثقافة متضخمة.
- يعرض للتريبسين الخلايا عن طريق إزالة المتوسطة وغسل 4 مل 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) العازلة. إضافة 0.8 مل 1X التربسين / ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA) واحتضان في RT حتى الخليةالصورة طرد، والتي تأخذ حوالي 2-4 دقائق. تحقق من هذه العملية مع المجهر وأحيانا الاستفادة من القارورة بلطف لدعم تهجير.
- إضافة 5 مل مستنبت الخلية (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط (DMEM) / F12 مع المصل 10٪ بقري جنيني (FBS)، 1٪ البنسلين / streptavidin (القلم / بكتيريا)) لوقف رد فعل ويغسل الخلايا المتبقية التي لا تزال الجلوس في أسفل القارورة. وفي وقت لاحق ماصة هذا التعليق صعودا وهبوطا عدة مرات للحصول على مزيج متجانس. تأكد من ماصة جميع الحلول في جميع أنحاء منطقة نمو الأصلية للقارورة لكسب تهجير فعال.
- نقل تعليق خلية في لأنبوب 15 مل وأجهزة الطرد المركزي باستخدام أحد كبار الطرد المركزي في الجدول 0.5 x ج لمدة 3 دقائق.
- إزالة طاف واعادة تعليق بيليه خلية في 5 مل المتوسطة من قبل pipetting صعودا وهبوطا 5 مرات. تأكد لتجنب توليد فقاعات أثناء القيام بذلك.
- تحديد كثافة الخلية باستخدام غرفة عد الخلايا وmicrosco خفيفةالمؤسسة العامة. تحقق من تعليق خلية في غرفة العد خلية لخلية المجاميع وضمان أن يكون الخلايا واحدة فقط للتجربة لاحقة. ماصة مرة أخرى صعودا وهبوطا عدة مرات إذا كانت الخلايا تميل الى تشكيل مجاميع للفصل بينهما.
- تمييع تعليق الخلية مع متوسط كافية للحصول على حل الخلية من 25000 خلية / مل. يخلط المزيج جيدا بواسطة أنبوب عكس مغلقة عدة مرات.
- إعداد مجموعة micropost لزرع الخلايا.
الحرجة ملاحظة: لا ماصة على مجموعة micropost مباشرة وهذا يحتمل أن تضر microposts، وخصوصا عندما يتم إدخال فقاعات غير المرغوب فيها. وعلاوة على ذلك، تأكد من أن مجموعة micropost أبدا يجف كما تحدث قوات الشعرية تؤدي إلى الانهيار من microposts.- وضع الركيزة الزجاج مع مجموعة micropost مواجهة في بئر من لوحة 12-جيدا باستخدام زوج من ملاقط والرطب عن طريق إضافة 1 مل ايثانول (99٪). في احتضان RT لمدة 20-30 ثانية.
- تمييع الإيثانولالتدرجي عن طريق إضافة حوالي 1 مل-المتأينة الماء المعقم (DI الماء) على الجانب جيدا والشفط ما يقرب من 1 مل باستخدام ماصة نقل أو الجهاز التنفسي. كرر هذه الخطوة 3 مرات على الأقل.
- استبدال DI-الماء مع PBS العازلة بنفس الطريقة عن طريق إضافة والشفط حوالي 1 مل. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
- استبدال PBS عازلة مع المتوسط عن طريق إضافة والشفط حوالي 1 مل من المتوسط. كرر هذه الخطوة 3 مرات.
- ماصة الحل 1 مل الخلية (25000 الخلايا) على رأس كل مجموعة micropost المعدة. إغلاق لوحة متعددة جيدا وتحويلها إلى حاضنة (CO 2 5٪، 37 ° C). السماح للخلايا الالتزام وتنمو على رأس microposts لمدة 6 -7 ساعة.
- تفقد عملية التصاق بعض الأحيان باستخدام ضوء المجهر. تحقق من أن معظم الخلايا تظهر انتشرت عبر microposts متعددة.
2. إصلاح وتلطيخ الخلايا
ملاحظة: جميع الخطوات ووبالنظر إلى الكميات هنا هي لبئر واحدة من لوحة 12-جيدا. فمن المستحسن أن العملية لا يزيد عن أربعة من اثني عشر بئرا في وقت لتجنب جفاف الآبار بعد تطلع أي سائل، الأمر الذي سيؤدي في انهيار microposts.
- نضح المتوسطة من البئر وغسل خلايا 2X مع 1 مل PBS عازلة. للتأكد من تطبيق قوة لطيف في حين غسل مع PBS لإزالة الحطام الخلية التي تراكمت على مجموعة micropost أثناء الحضانة وفصل الخلايا الميتة.
- إصلاح الخلايا مع 0.5 مل 3.7٪ محلول الفورمالديهايد مخزنة لمدة 5 دقائق.
- استبدال حل الفورمالديهايد من قبل غسل 2X مجموعة micropost مع 1 مل من الماء DI العقيمة.
- وصمة عار على الخلايا مع صبغة (0.05٪ Coomassie بريليانت الأزرق في الماء 50٪، 40٪ من الإيثانول وحمض الخليك 10٪) لمدة 90 ثانية. غسل حل تلطيخ الزائد 2X مع 1 مل من الماء DI العقيمة. إضافة 1 مل من الماء DI إلى micropost مجموعة.
- تحقق نتيجة تلطيخ باستخدام المجهر الضوئي. كرر رانه تلطيخ الخطوة، إذا خلايا الجسم هو خافت جدا بحيث لا يمكن تصور.
- صفائف مخزن micropost مع الخلايا الملون على رأس القائمة في الثلاجة على 4 درجات مئوية. ضمان لإبقائهم تحت الماء في جميع الأوقات.
التصوير 3. خلية
ملاحظة: الخطوة 4 يطبق فقط على المجاهر دون اللانهاية تصحيح البصريات.
- إضافة 2 مل DI-المياه إلى طبق بيتري مع قاع زجاجي رقيق للالتصوير عالية الدقة.
- نقل مجموعة micropost باستخدام زوج من الملقط في طبق التصوير مع microposts مواجهة.
- وضع التصوير طبق بتري على خشبة المسرح المنقولة من المجهر الضوئي.
- تحويل عصابة تعويض العدسة المستخدمة في التصوير حتى الرقم على نطاق ويمثل سمك الكلي لجميع المواد على طول مسار بصري للتعويض عن عدم تطابق في مؤشرات الانكسار الركيزة الزجاج، والمطاط الصناعي السيليكون والسائل على القمة. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى مظهر مشرق من micropostsالنوى.
- إغلاق القزحية على الجانب الإضاءة وصولا الى 50٪ وإزالة أي حلقات المرحلة النقيض من مسار بصري تمكن من وضع مشرق الميدان العاديين.
- محاذاة مجموعة micropost أن microposts شكل خط أفقي عبر مجال المراقبة. تحديد نقطة البداية (على سبيل المثال، أعلى اليسار) ونقل طبق بيتري تدريجي عبر المرحلة مسح مجموعة micropost في حين أخذ العديد من الصور.
- اتخاذ جميع الصور مع أعلى دقة الإعداد للكاميرا باستخدام الهدف 20X 40X أو. نهدف إلى أن خلية واحدة في وسط الصورة.
- اكتساح على طول محور Z من خلال الركيزة حتى نصائح micropost هي في التركيز. استخدام غرامة عجلة ضبط تركيز المجهر وتحويلها نحو التركيز على الجزء السفلي micropost لحوالي 2-3 ميكرون.
- وضع إجراء التصوير القياسية من خلال اتخاذ سلسلة من الصور اختبار واحد قسم مجموعة تجتاح المعلمات التصوير في وقت واحد (على سبيل المثال، وقت التعرض،وضع قزحية، إعدادات مصباح الخ). تحليل الصور مع MechProfiler وتحديد مجموعة المعلمة مناسبة لتحليل سريعة وموثوق بها.
تحليل 4. صورة مع برامج المصدر المفتوح "MechProfiler"
ملاحظة: يمكن تفعيل جميع وظائف البرنامج مع جهاز تأشير باستخدام زر الماوس الأيسر. ومع ذلك، فإن عامل المدربين استخدام مفاتيح الاختصار وثقت مصممة لتكون على النصف الأيسر من لوحة المفاتيح لتمكين باليدين معالجة الصور كفاءة.
- بدء تحليل الصور برنامج MechProfiler وفتح مجموعة من الصور التي تحتاج إلى تحليل بالنقر على "فتح".
- إدراج جميع المعلمات في قسم "الإعدادات" التي قدمها مطور برمجيات. تحديد المعايير التي يجب تكوين مخصص (أي عتبة كفاف والحد الأدنى من المسافة) وفقا للإجراءات وصفها بالتفصيل دليل البرامج.
- تحليل صورةالصورة واحدة تلو الأخرى من قبل الاقتصاص منهم لمجال الاهتمام باستخدام "اقتصاص" (انقر واسحب مع ضغط زر الماوس لأسفل). انقر مرتين داخل المستطيل رسمها لإنهاء هذا الإجراء.
- بمناسبة كل مخطط الخلية مرئية واحدة من جانب واحد عن طريق النقر على "رسم الخطوط العريضة خلية" واستخدام المؤشر الشعر عبر عن الرسم بما في ذلك جميع microposts يتم إرفاق الخلية.
- تجاهل أي microposts غير المرغوب فيها بالنقر على "تجاهل المشاركات" واستخدام المؤشر الشعر عبر عن رسم. أرفق كل microposts التي تنتمي إلى خلية خارج القسم صورة أو التي تهرب لأي سبب آخر ولكن ليس من قبل خلية من الفائدة.
- بدء برنامج فرعي "البحث Centroids" عن طريق النقر بالماوس. ضبط مرشح وضع بجوار زر "البحث Centroids" حتى يتم تسجيل جميع microposts، وهو أمر واضح من قبل الصليب الأحمر في مركزهم. إذا كان الإعداد المرشح هو أيضا سيتم تجاهل microposts منخفضة، وإذا كان مو عالية جداسيتم وضع علامة مواقف ltiple لmicropost واحد. الحفاظ على تصفية وضع ثابت خلال جلسة التحليل.
- استخدام دليل وظيفة تحرير "تحرير يدوي" لcentroids مع مواقف micropost متعددة أو غاب. استخدام الماوس عبر الشعر لتحديد micropost في السؤال عن طريق النقر وسحبه عبر. انقر مرتين داخل المستطيل ووضع علامة حمراء في عداد المفقودين في قسم صورة الموسع، الذي يغلق تلقائيا. تجاهل مثل هذه micropost إذا كان خارج المخطط التفصيلي الخلية تعادل (راجع الخطوة 4.5) قبل المتابعة.
- العثور على شبكة micropost مثالية من خلال تفعيل "إنشاء شبكة" وظيفة مع النقر بالماوس. ضمان موقف يتوافق مع رئيس micropost صحيح، كما هو موضح من قبل عصابة زرقاء، داخل المخطط التفصيلي الخلية استخلاصها.
- تصحيح أي صانع الشبكة في غير محله داخل منطقة الخلية حيث الحاجة باستخدام الدالة المناظرة "مانويل تحرير" مع النقر بالماوس. استخدام الشعر عبر لتحديد micropost في تشوestion عن طريق النقر وسحبه عبر. انقر مرتين داخل المستطيل الظهور ووضع علامة زرقاء المفقودة في القسم صورة الموسع، الذي يغلق تلقائيا.
- استخدم زر "حساب الإمالات" عن طريق النقر بالماوس للحصول على الرسم البياني للانحراف القيم محسوبة على أساس الفرق بين موقف وmicropost من داخل قسم صورة وشبكة مثالية ولدت.
- حفظ تحليل كامل بما في ذلك جداول القيم عن طريق النقر بالماوس على "حفظ".
- مواصلة تحليل الصور إما عن طريق النقر على "إعادة نظر" وتحليل قسم آخر صورة أو النقر بالماوس على "الصورة التالية"، الذي مريح يمكن أن يتم ذلك باستخدام مفتاح القاذف لوحة المفاتيح الصحيح.
5. تحليل البيانات - Mechanoprofiling
- فتح ملف "results.xls" مع برنامج جدول بيانات مكتب من المجلد الذي يحتوي على الصور التي تم تحليلها. أنه يحتوي على البيانات مع تنظيم القاعدةل القيم المحسوبة بما في ذلك جميع الانحرافات micropost والتدابير المشتقات القياسية مثل العمل (أي الطاقة الركيزة تشوه) من قبل خلية تحليلها.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
والميزة الرئيسية لهذه التقنية وصفها تكمن في بساطته وإمكانية الاندماج السريع والفعال في العمل في المعمل الروتيني. مزيج من جودة عالية صفائف استشعار التجارية يقترن برمجيات المصدر المفتوح يوفر معلومات حول والميكانيكية الحساسية التي من شأنها أن تتطلب خلاف ذلك إمكانية الوصول إلى مرافق غرف الأبحاث والمعرفة المتعمقة من تحليل الصور وتطوير البرمجيات. الشكل 1 يوضح سير العمل وطريقة عرضها. وهي تبدأ مع إعداد وبذر خلايا على مجموعة micropost. بعد تحديد وتلطيخ الخلايا صفائف microp...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
ويسعى هذا العمل للمضي قدما في مجال قوة الجر المجهري عن طريق خفض كبير الحواجز التقنية والعملية للدخول. هذه الحواجز تأتي من الجانبين. أولا وقبل كل شيء هي العديد من التحديات التقنية غير تافهة التي يجب التغلب عليها لتصنيع بتكاثر وتكليف مجموعة micropost تجريبيا. الثاني، هو الحاجة بالمثل غير تافهة لتحليل شبه الآلية يمكن الاعتماد عليها القوات خلية واحدة - مع الأخذ في الاعتبار أن تجربة نموذجية قد يتطلب تحليل مئات أو حتى آلاف من الخلايا. وقد وضعت هذه الأساليب المذكورة أعلاه لجعل micropost ...
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
المؤلف الرئيسي (NG) هو المؤسس المشارك لشركة MicroDuits GmbH ، المورد التجاري لمصفوفات micropost المستخدمة في هذه الدراسة. لا يوجد مؤلف آخر لديه أي تضارب محتمل في المصالح مع هذا العمل.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من قبل منحة لجنة التكنولوجيا والابتكار (CTI) السويسرية 14796-PFLS-LSCTI. تم توفير مصفوفات MicroPost بسخاء بواسطة MicroDuits GmbH.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| قوارير زراعة الخلايا T25 | Nunc | 156367 | |
| 1x PBS-buffer | Sigma | D8537 | |
| 0.5٪ Trypsin-EDTA | Life Technologies | 15400054 | |
| متوسط DMEM / F12 | Sigma | D8437 | |
| FBS South America | Life Technologies | 10270106 | |
| Penicillin-Streptomycin 100x | Sigma | P4333 | |
| 15 مل قوارير الطرد المركزي | Sarstedt | 62.554.502 | |
| مجموعة Micropost مطلية مسبقا بالكولاجين I / Fibronectin | MicroDuits | MPA-col1 / FN | أبعاد Micropost: Ø ؛ = 6.4 & # 160 ؛ ومايكرو. م ، L = 18.2 & m; الشبكة = 13 & م ، ك < ساب > كور < / ساب > = 2.87 &# 160 ؛ nN/µ م |
| الإيثانول القيمة المطلقة p.A. | Merck | 100.983 | |
| 12 بئر لوحة | Nunc | 150628 | |
| محلول الفورمالين ، محايد مخزن مؤقت 10٪ | Sigma | HT5011 | |
| Brilliant Blue G-250 | Sigma | 27815 | Coomassie Blue |
| Methanol ACS p.A. | ميرك | 1.06009 | |
| حمض الخليك | سيجما | 695092 | |
| طبق سفلي زجاجي | WillCo Wells BV | GWSb-3522 | قطر 35 مم ، فتحة 22 ؛ مم |
| T-100 كسوف | نيكون | غير | مجهر مقلوب |
| D3-L3 | نيكون | n / A | التحكم في الكاميرا |
| DS Fi2 | كاميرا | نيكون |
المراجع
- Sharma, R. I., Snedeker, J. G. Biochemical and biomechanical gradients for directed bone marrow stromal cell differentiation toward tendon and bone. Biomaterials. 31 (30), 7695-7704 (2010).
- Suresh, S. Biomechanics and biophysics of cancer cells. Acta Biomater. 3 (4), 413-438 (2007).
- Bartalena, G., et al. A novel method for assessing adherent single-cell stiffness in tension: design and testing of a substrate-based live cell functional imaging device. Biomed Microdevices. 13 (2), 291-301 (2011).
- Tan, J. L., et al. Cells lying on a bed of microneedles: An approach to isolate mechanical force. PNAS. 100 (4), 1484-1489 (2003).
- Akiyama, Y., Hoshino, T., Iwabuchi, K., Morishima, K. Room Temperature Operable Autonomously Moving Bio-Microrobot Powered by Insect Dorsal Vessel Tissue. PloS ONE. 7 (7), (2012).
- Biais, N., Ladoux, B., Higashi, D., So, M., Sheetz, M. Cooperative retraction of bundled type IV pili enables nanonewton force generation. Plos Biology. 6 (4), 907-913 (2008).
- Wuang, S. C., Ladoux, B., Lim, C. T. Probing the Chemo-Mechanical Effects of an Anti-Cancer Drug Emodin on Breast Cancer Cells. Cell Mol Bioeng. 4 (3), 466-475 (2011).
- Schoen, I., Hu, W., Klotzsch, E., Vogel, V. Probing Cellular Traction Forces by Micropillar Arrays: Contribution of Substrate Warping to Pillar Deflection. Nano Lett. 10 (5), 1823-1830 (2010).
- Lemmon, C. A., et al. Shear Force at the Cell-Matrix Interface: Enhanced Analysis for Microfabricated Post Array Detectors. Mech Chem Biosyst. 2 (1), 1-16 (2005).
- Lam, R. H. W., Weng, S. N., Lu, W., Fu, J. P. Live-cell subcellular measurement of cell stiffness using a microengineered stretchable micropost array membrane. Integr Biol-UK. 4 (10), 1289-1298 (2012).
- Roure, O., et al. Force mapping in epithelial cell migration. PNAS. 102 (39), 14122-14122 (2005).
- Papenburg, B. J., Rodrigues, E. D., Wessling, M., Stamatialis, D. Insights into the role of material surface topography and wettability on cell-material interactions. Soft Matter. 6 (18), 4377-4388 (2010).
- Badique, F., et al. Directing nuclear deformation on micropillared surfaces by substrate geometry and cytoskeleton organization. Biomaterials. 34 (12), 2991-3001 (2013).
- Sniadecki, N. J., et al. Magnetic microposts as an approach to apply forces to living cells. PNAS. 104 (37), 14553-14558 (2007).
- Weng, R. H. W. A silicone-based stretchable micropost array membrane for monitoring live-cell subcellular cytoskeletal response. Lab Chip. 12, 731-740 (2012).
- Desai, R. A., Yang, M. T., Sniadecki, N. J., Legant, W. R., Chen, C. S. Microfabricated Post-Array-Detectors (mPADs): an Approach to Isolate Mechanical Forces. J Vis Exp. (8), e311(2007).
- Yang, M. T., Fu, J. P., Wang, Y. K., Desai, R. A., Chen, C. S. Assaying stem cell mechanobiology on microfabricated elastomeric substrates with geometrically modulated rigidity. Nat Protoc. 6 (2), 187-213 (2011).
- Sniadecki, N. J., Han, S. J., Ting, L. H., Feghhi, S. Micropatterning in Cell Biology. Methods in Cell Biol. 121, 61-73 (2014).
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
