مقالة منهجية

العزلة المادية من الأبواغ من العينات البيئية التي تستهدف تحلل من الخلايا النباتية

DOI:

10.3791/53411

⸱

يناير 21, 2016

 ,  ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, Macquarie University, 2Vital-IT group, Swiss Institute of Bioinformatics, 3Laboratory of Microbiology, University of Neuchatel

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تطوير طريقة لتمييز الأبواغ الداخلية البكتيرية من المجتمعات الميكروبية المعقدة لإجراء دراسات مزرعة أو جزيئية مخصصة لهذه المجموعة من البكتيريا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تكوين الأبواغ الداخلية هو استراتيجية بقاء موجودة بين بعض البكتيريا من شعبة Firmicutes. أثناء تكوين الأبواغ الداخلية ، تدخل هذه البكتيريا في حالة راحة مورفو فسيولوجية تعزز البقاء على قيد الحياة في ظل الظروف البيئية المعاكسة. على الرغم من أن Firmicutes المكونة للأبواغ الداخلية هي واحدة من أكثر المجموعات البكتيرية التي يتم إثرائها وعزلها في دراسات الاستزراع ، إلا أنها غالبا ما تكون غائبة عن دراسات التنوع القائمة على الطرق الجزيئية. تعتبر مقاومة لب البوغ أحد العوامل التي تحد من استعادة الحمض النووي من الأبواغ الداخلية. لقد طورنا طريقة تستفيد من المقاومة العالية للأبواغ الداخلية لفصلها عن الخلايا الأخرى في مجتمع ميكروبي معقد باستخدام طرق التحلل الفيزيائي والأنزيمي والكيميائي. يمكن استخدام المستحضر الداخلي فقط الذي تم الحصول عليه بهذه الطريقة لإعادة الزراعة أو لإجراء تحليل المصب مثل استخراج الحمض النووي المخصص الأمثل للأبواغ الداخلية وتسلسل الحمض النووي اللاحق. سمحت هذه الطريقة ، المطبقة على عينات الرواسب ، بتخصيب الأبواغ الداخلية وبعد التسلسل ، كشفت عن تنوع كبير في مشكلات الأبواغ الداخلية في رواسب بحيرة المياه العذبة. نتوقع أن يؤدي تطبيق هذه الطريقة على عينات أخرى إلى نتيجة مماثلة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والهدف من هذا العمل هو توفير بروتوكول لفصل الأبواغ الجرثومية من الخلايا البكتيرية الخضري في العينات البيئية. تشكيل الأبواغ البكتيرية هي استراتيجية البقاء على قيد الحياة، تسبب عادة عن طريق التجويع، وجدت في عدد من المجموعات البكتيرية التي تنتمي إلى الأسرة في اللغات افيرميكوتس 1. ومدروسة البكتيريا المكونة للأبواغ، وذلك بسبب عدد من سلالات هي مسببات الأمراض، وبالتالي من الأهمية الطبية (على سبيل المثال، عصيات الجمرة الخبيثة أو المطثية العسيرة). وقد تم عزل سلالات من البكتيريا البيئية تشكيل أبواغ من كل تقريبا البيئة (التربة والمياه والرواسب والهواء والجليد وأمعاء الإنسان والحيوان الأمعاء، وأكثر) 1-3. ولذلك، افيرميكوتس هي الثانية الأسرة في اللغات الأكثر وفرة في مجموعات ثقافة 4.

بسبب هاردي قشرة خارجية ولب واقية البروتينات، ويمكن البقاء على قيد الحياة الأبواغ الظروف البيئية القاسية الاب تتراوحام جفاف للإشعاع عالية، ودرجات الحرارة القصوى والمواد الكيميائية الضارة 5. هذه المقاومة الرائعة يجعل من التحدي لاستخراج الحمض النووي من الأبواغ 6-8. هذا على الأرجح ما يفسر لماذا تم التغاضي عنها في دراسة التسلسل البيئي 9،10. أساليب أخرى، مثل استهداف الأبواغ في عينات بيئية من قبل الأجسام المضادة الفلورسنت 11، الكمي للحمض dipicolinic (د ب أ) في التربة والرواسب 12 13، وتدفق الخلوي 14 أو استخدمت البسترة وزراعة اللاحقة 15،16 لاسترداد أو تحديد الأبواغ في العينات البيئية. في السنوات الأخيرة، وقد وضعت تسلسل الجينات أبواغ محددة 10،17-20 طرق استخراج الحمض النووي الأمثل وكذلك الاشعال الجزيئية محددة لاستهداف. وقد ساعد ذلك للكشف عن المزيد من التنوع البيولوجي بين هذه المجموعة من البكتيريا 21، وأدى أيضا إلى تطبيقات في الصناعة والطب للكشف عن الأبواغعلى سبيل المثال في الحليب المجفف 19.

ويستند بروتوكول المقدمة هنا على الاختلاف في مقاومة الظروف الفيزيائية الضارة (مثل الحرارة والمنظفات) من الأبواغ الجرثومية قريبة الإنباتي الخلايا. لتدمير الخلايا النباتية في عينة، ونحن نطبق التوالي الحرارة، والليزوزيم وتركيزات منخفضة من المنظفات. وقد تم تحسين الوقت وقوة هذه المعالجات حتى لا تدمر الجراثيم، ولكن لليز جميع الخلايا النباتية. بعض الخلايا في تجمع الخلايا البيئي هي أكثر مقاومة من غيرها، وذلك من أجل زيادة احتمال تدمير كل الخلايا النباتية، ونحن نطبق ثلاثة علاجات مختلفة. ميزة والجدة من هذا الأسلوب هو أن الأبواغ بعد العلاج لا تزال على حالها، ويمكن استخدامها لإجراء المزيد من التحليلات المصب. وتشمل هذه استخراج الحمض النووي، PCR الكمي (QPCR) وamplicon أو التسلسل metagenomic (تستهدف على وجه التحديد على مجموعة من الأبواغ وبالتالي تقليل دiversity، في حين أن زيادة التغطية). ويمكن أيضا أن تستخدم الأبواغ لزراعة المصب أو الكمي بواسطة المجهر مضان، التدفق الخلوي، أو الكشف عن اتفاق سلام دارفور. سمة هامة من سمات هذا الأسلوب هو أنه بمقارنة عينة غير المعالجة مع عينة المعالجة، يمكن للمرء أن يستنتج كمية وتنوع الأبواغ في عينة بيئية بالإضافة إلى عنصر الموافق الإنباتي الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. إعداد مواد كيميائية ومعدات

  1. جعل 500 مل من 1٪ فوسفات الصوديوم (SHMP) (نابو 3) ن الحل وتعقيم بواسطة التعقيم.
  2. تعقيم نتروسليلوز (NC) مرشحات (حجم المسام 0.22 ميكرون، وقطره 47 ملم) من خلال التعقيم في أطباق بتري الزجاج مغلقة.
  3. تعقيم الفلاتر NC (حجم المسام 0.22 ميكرون، وقطره 25 ملم) من خلال التعقيم في أطباق بتري الزجاج مغلقة.
  4. وزن ولاحظ الوزن الفارغ العقيمة 50 مل أنابيب (مع سقف) (أنبوب واحد لكل عينة).
  5. إعداد تريس، EDTA العازلة (TE-عازلة) 1X: جعل الحل من 10 ملي تريس (تريس (hydroxymethyl) aminomethane) و 1 ملي EDTA العازلة. ضبط درجة الحموضة إلى 8 وتعقيم بواسطة التعقيم.
  6. يعد حل الليزوزيم (20 ملغ / مل) عن طريق إذابة 0.02 غرام من الليزوزيم في 1 مل TE-العازلة. من الناحية المثالية، وجعل جديدة في كل مرة. تخزين عند 4 درجات مئوية لمدة لا تزيد عن 1 في الاسبوع.
  7. يعد حل الفسيولوجية عن طريق إذابة 8 ز / L كلوريد الصوديوم(كلوريد الصوديوم) في الماء المقطر. تعقيم بواسطة التعقيم.

2. فصل الكتلة الحيوية من الرواسب

  1. إضافة 3 غرام من عينة الرواسب إلى وزنه مسبقا معقمة 50 مل أنابيب باستخدام المجارف المعدنية ملتهب الإيثانول. تنفيذ هذا في نظيفة، والأشعة فوق البنفسجية تعقيم الوزراء للسلامة الأحيائية لتجنب التلوث.
  2. إضافة 15 مل من 1٪ معقم (تعقيمها) حل SHMP إلى العينة باستخدام تخرج العقيمة السحاحة. ويمكن أيضا أن الحل SHMP تتم تصفيته لتجنب التلوث.
  3. التجانس الرواسب وحل SHMP مع المفرق السائل / الخالط (على سبيل المثال، الترا Turrax الخالط). 70٪ من الإيثانول تعقيم الأوتوكلاف أو الدوار تشتت قبل استخدامها. تشغيل التجانس لمدة 1 دقيقة في 17500 دورة في الدقيقة. السماح للعينة راحة لمدة 2 دقيقة، وتكرار التجانس لمدة 1 دقيقة في نفس السرعة الدوار.
  4. اسمحوا الوقوف العينة لمدة 10 دقيقة. في هذه الخطوة، فإن أثقل الجسيمات (المعادن) تسوية. الخلايا وأي مكون من مكونات العضوية من العينة ولكن ثتبقى سوء في الحل. بعد ذلك، نقل الحل طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية) إلى نظيفة أنبوب 50 مل، مع الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الرواسب.
  5. لبيليه الرواسب إضافة مرة أخرى 15 مل من 1٪ معقم (تعقيمها) حل SHMP باستخدام تخرج العقيمة السحاحة. ثم كرر الخطوات من 2.3 و 2.4. هذا التكرار يضمن الفصل بين أكبر قدر ممكن من الخلايا والجزيئات العضوية من المكون المعدنية في الرواسب. طاف من هذا الفصل الثاني يمكن دمجها مع طاف من الفصل الأول.
    ملاحظة: الخطوات التالية تتم كل يوم طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية). المكون المعدني (الرواسب بيليه) يمكن التخلص منها.
  6. الطرد المركزي العينة في 20 x ج لمدة 1 دقيقة. هذه الخطوة تزيد من ز-ما يكفي من القوة لتسوية الجزيئات المعدنية الصغيرة في حين أن المواد خلية بيولوجية لا يزال في الحل. بعد الطرد المركزي، ونقل الحل طاف (التي تحتوي على الكتلة الحيوية الخلية) إلىنظيفة أنبوب 50 مل. تجاهل بيليه المعدنية.
  7. تحديد الحجم النهائي من محلول يحتوي على الكتلة الحيوية عن طريق وزن العينة. تحديد الوزن يتجنب الحاجة إلى نقل العينة إلى الاسطوانة، ويقلل من مخاطر التلوث.

3. جمع من الكتلة الحيوية على تصفية غشاء

  1. تحضير وحدة الترشيح (47 ملم الأغشية قطر) ومضخة فراغ. تعقيم وحدة الترشيح إما عن طريق التعقيم أو (إذا بيركس زجاج) عن طريق الرش مع الايثانول 70٪ والمشتعلة ذلك مع موقد بنسن. ندعه يبرد قبل الاستمرار في البروتوكول.
  2. إضافة غشاء NC العقيمة إلى وحدة الترشيح باستخدام ملقط ملتهب الإيثانول تعقيمها.
  3. إضافة نصف العينة طاف (من الخطوة 2.6) على وحدة الترشيح الغشائي وجمع الخلايا في الغشاء باستخدام مضخة فراغ.
  4. عندما اجتاز السائل بالكامل من خلال التصفية، ووقف ضخ فراغ وإزالة الغشاء بعناية باستخدام إيثانرأ اللهب تعقيم الملقط. وضع الغشاء في طبق بتري معقمة.
    1. قطع الغشاء في نصف باستخدام مقص ملتهب الإيثانول تعقيمها. إضافة كل نصف الغشاء إلى منفصل أنبوب 2 مل. وسيتم استخدام نصف من الغشاء لاستخراج الحمض النووي وتحليل المجتمع البكتيريا بكامله. سيتم تخزين النصف الآخر من مرشح في -80 ° C وبمثابة نسخة احتياطية.
  5. وضع غشاء NC الجديد على وحدة الترشيح وجمع الكتلة الحيوية من النصف الثاني من حجم العينة (من الخطوة 2.6) باستخدام مضخة فراغ.
  6. عندما اجتاز السائل بالكامل من خلال التصفية، ووقف ضخ فراغ وإزالة الغشاء بعناية باستخدام ملقط ملتهب الإيثانول تعقيمها. وضع الغشاء بأكمله إلى منفصل أنبوب 2 مل. وسوف تستخدم هذه العينة لعلاج لفصل الأبواغ من الخلايا النباتية. يمكن تخزين العينة عند -20 درجة مئوية حتى الاستخدام.

4. تحلل من الخلايا النباتية

  1. أداءالعلاج لفصل الأبواغ من الخلايا النباتية على الكتلة الحيوية التي تم جمعها سابقا على غشاء NC (الخطوة 3.6).
    1. إذا تم تجميد الغشاء، وترك الأمر في RT لمدة 10 دقيقة إلى ذوبان الجليد. ثم وضع الغشاء في طبق بتري معقمة وقطع عليه (ما يقرب من 4 مرات) إلى أجزاء أصغر باستخدام مقص ملتهب الإيثانول تعقيمها. ثم ضع كل قطعة فلتر الغشاء في أنبوب معقم 2 مل.
  2. إضافة 900 ميكرولتر من 1X TE (تريس، EDTA) العازلة (انظر 1.5) إلى الأنبوب الذي يحتوي على غشاء عينة ومزيج دقيق من قبل دوامة. في هذه الخطوة، تتم إزالة الكتلة الحيوية من الغشاء في حل TE-العازلة.
  3. وضع أنبوب في حاضنة عند 65 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة. بعد ذلك إزالة أنبوب من الحاضنة وندعه يبرد لمدة 15 دقيقة.
  4. إضافة 100 ميكرولتر من الطازجة الليزوزيم (انظر 1.5) للوصول إلى تركيز النهائي من 2 ملغ / مل. لا تقم بإضافة الليزوزيم قبل أن تبرد العينة إلى 37 درجة مئوية، وهذا يمكن أن تنكسرادي الانزيم.
  5. احتضان العينة على 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة، والظروف المثلى لالليزوزيم إلى ليز الخلايا النباتية.
  6. بعد تحلل كامل، إضافة 250 ميكرولتر من 3 هيدروكسيد الصوديوم N (هيدروكسيد الصوديوم) و 250 ميكرولتر من 6٪ سلفات الصوديوم دوديسيل (SDS) حل للعينة. بإضافة هذه، وحجم عينة يبلغ 1.5 مل، وهناك تركيز النهائي من 0.5 N هيدروكسيد الصوديوم وتركيز النهائي من 1٪ SDS.
  7. احتضان هذا المزيج في RT لمدة 60 دقيقة و 80 دورة في الدقيقة. مضيفا القاعدة والمنظفات تساعد في تحلل الخلايا النهائي. وقد تم تحسين تركيز هذه المنظفات حتى لا تضر الأبواغ، بينما الناشر الخلايا النباتية.
  8. تحضير وحدة الترشيح العقيمة التي تملك 25 مم الأغشية قطر قبل التعقيم، أو (إذا بيركس زجاج) الرش مع الايثانول 70٪ والمشتعلة ذلك مع موقد بنسن. ندعه يبرد.
  9. وضع 0.2 ميكرون NC غشاء (25 مم) على وحدة الترشيح باستخدام ملقط الإيثانول اللهب تعقيمها.
  10. إضافة عينة من الخطوة 4.7 على الغشاء وتصفية السائل باستخدام مضخة فراغ. عندما اجتاز السائل من خلال إيقاف مضخة فراغ. في هذه الخطوة، تتم إزالة المواد الخلية النباتية هي lysed، كما لا يتم الاحتفاظ على الغشاء. فقط سوف تبقى الأبواغ على الغشاء.
  11. إضافة 2 مل من محلول معقم الفسيولوجية ليغسل المنظفات المتبقية وتصفية السائل باستخدام مضخة فراغ.
  12. عندما السائل تمت تصفيتها بالكامل، إيقاف مضخة فراغ. ترك غشاء على وحدة الترشيح.

5. الدناز العلاج

ملاحظة: إجراء العلاج الدناز مباشرة على الغشاء التصفية. من المهم أن وحدة الترشيح لا تسرب ويتم تشغيل المضخة فراغ قبالة.

  1. إضافة 450 ميكرولتر من الماء المعقم، 50 ميكرولتر من رد فعل العازلة الدناز (1X) و 0.5 ميكرولتر انزيم الدناز مباشرة على الغشاء مرشح والسماح لها الوقوف لمدة 15 دقيقة. إذا كان ذلك ممكنا، القيام بذلك الهضم في الغرفة التي هو قليلا الحربمير من المتوسط ​​RT، منذ انزيم يعمل بشكل أفضل عند درجة حرارة 25 درجة مئوية وما فوق.
    ملاحظة: الحفاظ على موقد بنسن جانبا وحدة الترشيح أيضا يزيد من درجة الحرارة وله فائدة إضافية تتمثل في الحفاظ على البيئة المحيطة عقيمة، وبالتالي تقليص خطر التعرض للتلوث العينات.
  2. عند الانتهاء من عملية الهضم الدناز، بدوره على مضخة فراغ لإزالة الانزيم من العينة.
  3. يغسل انزيم المتبقية عن طريق إضافة وتصفية 1 مل من محلول فيزيولوجي.
  4. إذا اجتاز السائل تماما، إيقاف مضخة الفراغ وإزالة غشاء فلتر تحتوي على الأبواغ باستخدام ملقط معقم ووضعه في طبق بتري معقمة.
    ملاحظة: عينة من الأبواغ فصل مستعدة الآن لتحليل المصب. مخزن في -20 درجة مئوية إذا استخدمت لاستخراج الحمض النووي أو بدلا من ذلك في 4 درجات مئوية إذا تم استخدامها لإنبات وزراعة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد نشرت النتائج المقدمة هنا في وقت سابق 10،21. يرجى الرجوع إلى تلك المواد لتفسير البيئي ومناقشة البيانات.

وتتلخص إجراءات الشامل في الشكل (1) ويتوافق مع ثلاث خطوات رئيسية: أولا، وفصل من الكتلة الحيوية من الرواسب أو أي مصفوفة البيئية الأخرى. الثانية، وتدمير الخلايا النباتية. وثالثا، تحليل المصب من الأبواغ فصل. يمكن أن تتكون تحليل المصب، على سبيل المثال، لاستخراج الحمض ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

واستخدمت المقاومة من الأبواغ إلى العوامل الفيزيائية العدوانية الخارجية (على سبيل المثال، درجة الحرارة أو المنظفات) إلى ابتكار طريقة لفصل الأبواغ الجرثومية من الخلايا النباتية في عينات بيئية. هذا هو الأسلوب الشامل الأول لعزل الأبواغ من العينات البيئية بطريقة غير مدمرة. واستندت الطرق السابقة لتحديد وكشف تحليل أو الأبواغ في عينات على قياس الوكلاء محدد لالأبواغ مثل حمض dipicolinic أو الجينات علامة معينة. في المقابل، مع بروتوكول المعروضة هنا، تتم إزالة مكونات عينة أخر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المؤلفون تعترف مؤسسة العلوم الوطنية السويسرية للمنحة رقم 31003A-132358/1، 31003A_152972 ورقم 151948، والمباركيه بيير مرسييه صب لا العلم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مرشحات غشاء واتمان نيتروسليلوز ، 0.2 &# 956 ؛ م حجم المسام ، قطر 47 ممSigma-AldrichWHA7182004 Aldrich & nbsp ؛
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثانسيجما ألدريتش252859 سيجما ألدريتشCAS 77-86-1
EDTAسيجما ألدريتشE9884 سيجما ألدريتشCAS   ؛ 60-00-4   ؛
الليزوزيم من بياض بيض الدجاجSigma-Aldrich62971 مسحوق فلوكا, CAS  12650-88-3 
الخالط الفائق Turrax T18 الأساسيIKA3720000
حاملي فلتر الزجاج ل 47 & nbsp ؛ أغشية مم ، زجاج بيركسEMD MilliporeXX10 047 00
مضخة فراغ واجب كيميائيMilliporeWP6122050220 فولت / 50 هرتز
ترشيح أخذ العينات المشعب ل 25 & nbsp ؛ أغشية ممMillipore1225 أخذ العينات المشعبالبولي بروبيلين
Dnaseنيو إنجلاند BiolabsM0303SRnase خالي
من NaOHSigma-AldrichS5881 Sigma-AldrichCAS  1310-73-2 
كبريتات دوديسيل الصوديوم (SDS)Sigma-AldrichL3771 Sigma 
مرشحات غشاء واتمان نيتروسليلوز ، 0.2 &# 956 ؛ م حجم المسام ، قطر 25 ممسيجما ألدريتشWHA7182002 ألدريتش

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Nicholson, W. L. Roles of Bacillus endospores in the environment. Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).
  2. Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. Microflora of extreme arid Atacama Desert soils. Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).
  3. Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring. Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).
  4. Hugenholtz, P. Exploring prokaryotic diversity in the genomic era. Genome Biol. 3 (2), (2002).
  5. Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes). Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).
  6. Delmont, T. O., et al. Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity. Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).
  7. Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , Horizon Bioscience. (2004).
  8. Kuske, C. R., et al. Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil. Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).
  9. von Mering, C., et al. Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments. Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).
  10. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes. Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).
  11. Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis. J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).
  12. Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence. Int J Microbiol. , 435281(2011).
  13. Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid. Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).
  14. Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus. J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).
  15. de Rezende, J. R., et al. Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years. ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).
  16. Hubert, C., et al. Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature. Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).
  17. Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE. Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).
  18. Brill, J. A., Wiegel, J. Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method. J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).
  19. Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder. Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).
  20. Bueche, M., et al. Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A. Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).
  21. Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments. Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).
  22. Nicholson, W. L., Law, J. F. Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168. J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

SDS DNase

مقالات ذات صلة