يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين

20.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53422

⸱

يناير 14, 2016

 ,  ,  , 
1Centro de Biotecnología y Genómica de Plantas (CBGP), Instituto Nacional de Investigación y Tecnología Agraria y Alimentaria (INIA)-Universidad Politécnica de Madrid

في هذه المقالة

ملخص

مناعي لونين هي تقنية قوية لتحديد المواقع DNA من البروتينات في الجسم الحي نبات الأرابيدوبسيس ملزمة. ويشمل هذا الإجراء لونين عبر ربط والتشرذم، مناعي مع الأجسام المضادة انتقائية ضد البروتين من الفائدة، وتحليل QPCR من الحمض النووي ملزمة. نحن تصف مقايسة الشذرة بسيط الأمثل لمحطات نبات الأرابيدوبسيس.

الملخص

تنسق الشبكات التنظيمية الجينية المعقدة العمليات البيولوجية والتحولات التنموية في النباتات. يتوسط التنشيط الانتقائي للنسخ وإسكات الجينات في استجابة النباتات للإشارات البيئية والإشارات التنموية. لذلك ، فإن الأفكار حول الآليات التي تتحكم في التعبير الجيني النباتي ضرورية لاكتساب فهم عميق لكيفية تنظيم العمليات البيولوجية في النباتات. تقنية الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) الموضحة هنا هي إجراء لتحديد مواقع ربط الحمض النووي للبروتينات في الجينات أو المناطق الجينومية للأنواع النموذجية نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا. يمكن تحليل التفاعلات مع الحمض النووي للبروتينات ذات الأهمية مثل عوامل النسخ أو بروتينات الكروماتين أو الإصدارات المعدلة بعد الترجمة من الهستونات بكفاءة باستخدام بروتوكول ChIP. تعتمد هذه الطريقة على تثبيت تفاعلات البروتين والحمض النووي في الجسم الحي ، والتجزئة العشوائية للكروماتين ، والترسيب المناعي لمجمعات البروتين والحمض النووي مع الأجسام المضادة المحددة ، والقياس الكمي للحمض النووي المرتبط بالبروتين محل الاهتمام بواسطة تقنيات تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). ساهم استخدام هذه المنهجية في نبات الأرابيدوبسيس بشكل كبير في الكشف عن آليات تنظيم النسخ التي تتحكم في مجموعة متنوعة من العمليات البيولوجية النباتية. سمح هذا النهج بتحديد مواقع ربط بروتين نبات الأرابيدوبسيس كروماتين EBS للمناطق التنظيمية للجين الرئيسي للمزهر FT. كما تم الكشف عن تأثير هذا البروتين في تراكم علامات هيستون معينة في المنطقة الجينومية ل FT من خلال تحليل ChIP.

المقدمة

خلال السنوات الأخيرة تم تطوير مجموعة واسعة من الأدوات الجينية، الجزيئية والجينوم في أنواع نموذج نبات الأرابيدوبسيس thaliana. هذه التكنولوجيا قد سهلت بشكل كبير من التقدم في فهم كيفية تنظيم تطوير المصنع. ومن بين العمليات التنموية المدروسة باستخدام نبات الأرابيدوبسيس كنموذج، والسيطرة الوراثية من الوقت المزهرة تم تحليلها على نطاق واسع. وقد أظهرت هذه الدراسات أن النباتات تعدل بدقة متناهية وقت المزهرة في استجابة لمنبهات الذاتية مثل الهرمونات وعمر النبات، وأيضا لإشارات البيئية مثل الإضاءة ودرجة الحرارة التي تزامن المزهرة الوقت مع الدورة الطبيعية للمواسم 1، 2. وقد تم عزل وتوصيف المسوخ نبات الأرابيدوبسيس مع بعض التعديلات في وقت الإزهار حاسما في كشف شبكة معقدة من الجينات التي تنظم للمرة المزهرة استجابة لعوامل داخلية والبيئية. هذه الدوائر الجينيةمتكاملة على مستوى عدد قليل من الجينات الرئيسية التي تكون بمثابة مفاتيح المزهرة، والتوقيت الدقيق لبدء الأزهار يعتمد على ميزان المزهرة تعزيز وقمع الأنشطة التي تعمل المنبع من الجينات تكامل الأزهار 1،3.

وقد كشفت توصيف وظيفي من الجينات التي تم تحديدها لدورها في مراقبة المزهرة بدء، وبمساعدة من استخدام الأخير من النهج الجينومية، والدور المركزي للتنظيم النسخي في التشكيل من الوقت المزهرة. في الواقع، العديد من الجينات سيد المزهرة ترميز عوامل النسخ 4. وبالإضافة إلى ذلك، هناك عدد من لونين مجمعات البروتين إعادة تؤثر على التعبير عن الجينات سيد المزهرة. تحول عدد من المسوخ نبات الأرابيدوبسيس معزولة لمن تغير الوقت المزهرة إلى تحمل طفرات في جينات ترميز مجموعة متنوعة من معدلات الكروماتين. و remodelers لونين مختلفة إدخال تعديلات posttranslational في هيستونالبريد ذيول، أعد nucleosomes نسبة إلى DNA أو تبادل الهستونات الكنسي من قبل المتغيرات هيستون ضرورية لتنظيم السليم لالمزهرة في نبات الأرابيدوبسيس 5،6. بعض هذه الأنشطة إعادة عرض لونين تحفيز ترسب أو إزالة التعديلات التساهمية مثل أستلة أو مثيلة في بقايا هيستون محددة. يتم التعرف على هذه العلامات هيستون تحديدا مؤثرات المتخصصة التي تجند أخرى مجمعات ونين إعادة عرض، عوامل النسخ أو مكونات الآلات النسخي لتنظيم النشاط النسخي الجينات المزهرة.

لونين مناعي (رقاقة) يسمح بتحديد المواقع في الجسم الحي للبروتينات ذات الاهتمام ملزم الحمض النووي (الشكل 1). يأخذ هذا الإجراء الاستفادة من قدرة بعض المواد الكيميائية إلى عبر الارتباط البروتينات على الحمض النووي. مما أدى المجمعات الحمض النووي والبروتينات ويمكن بعد ذلك immunoprecipitated باستخدام الأجسام المضادة الآغا محددةالعوامل انست النسخ والبروتينات ملزم لونين، أو تعديلات معينة والحواتم مغاير (يشار اليه عادة باسم "العلامات") التي تعلق على البروتين في الاختيار. الحمض النووي تنقيته من هذه immunoprecipitates يمكن استخدامها كقالب في PCR (QPCR) ردود فعل الكمية لتقييم لإثراء تسلسل معينة من الاهتمام. وبهذه الطريقة، يمكن إنشاء مواقع الربط من عوامل النسخ أو توزيع علامات هيستون في جينات معينة 7،8. وبالإضافة إلى ذلك، جنبا إلى جنب مع الجيل التالي من التسلسل (خ ع) التي تمكن التسلسل الموازي ضخمة، جعلت تكنولوجيا رقاقة الممكن تحديد الجينوم على نطاق مواقع الربط من عوامل النسخ فضلا عن المناظر الطبيعية epigenomic الكشف عن التعديلات هيستون. وعلاوة على ذلك، فإن التحليل في وقت واحد في التعبير الجيني يسمح مراقبة كيفية الربط المنظمين النسخي أو ترسب معينة علامات هيستون ترتبط مع النسخي activiتاي من الجينات 9.

وقد سمح باستخدام بروتوكولات الشذرة في نبات الأرابيدوبسيس تقييم الأثر أن مجموعة متنوعة من المنظمين النسخي لها بشأن تنظيم لونين الجينات سيد المزهرة وكيف يمكن لهذه التغيرات الهيكلية تؤثر التعبير الجيني 5،6. وأظهرت النتائج السابقة أن انشقاقه المبكر نبات الأرابيدوبسيس مكان في أيام قصيرة (EBS) بمثابة كاظمة المزهرة والمسوخ في هذا المعرض الجينات تسارع المزهرة وupregulation من الجين سيد المزهرة FT. بالإضافة إلى ذلك، الخسارة من وظيفة الطفرات في FT قمع تماما النمط الظاهري المزهرة في وقت مبكر من النباتات EBS متحولة، مشيرا إلى أن FT مطلوب من أجل ازدهار سابق لأوانه من المسوخ EBS وأن EBS هو ضروري لقمع هذا الجين سيد المزهرة 10 11. بترميز EBS البروتين التي تحتوي على الدكتوراه التي يمكن أن تربط خصيصا هيستون H3 البروميد وtrimethylated في الالبريد يسين 4 بقايا (H3K4me2 / 3)، مما يشير إلى دور لEBS في قمع بوساطة لونين من FT 12. أظهر استخدام نهج الشذرة أن نبات الأرابيدوبسيس التي تحتوي على البروتين الدكتوراه EBS 10،11 يربط المناطق التنظيمية من الأزهار FT تكامل الجيني لقمع التعبير عنها 12. وأظهرت بيانات إضافية تم الحصول عليها من خلال استخدام تكنولوجيا رقاقة ما هو مطلوب هذا البروتين للحفاظ على مستويات منخفضة من أستلة هيستون، وهي السمة المميزة النسخ نشط، في لونين من هذا الجين سيد المزهرة خلال المراحل الأولى من تطوير نبات الأرابيدوبسيس. هذه الملاحظات، جنبا إلى جنب مع بيانات التعبير الجيني والجينات، وتثبت أن هذا نبات الأرابيدوبسيس الدكتوراه التي تحتوي على البروتين له دور مركزي في ضبط الوقت المزهرة عن طريق تحوير التعبير عن تكامل جين الأزهار FT 12. العمل المقدم هنا يوفر وسيلة الأمثل مفيد ليس فقط لتحليل الهستونات ولكن أيضا لأغراض أخرىلونين المرتبطة البروتينات، ومع زيادة الكفاءة وتقليل الوقت التجريبية. وعلاوة على ذلك، يوضح هذا التقرير كيف قدمت استخدام بروتوكولات الشذرة رؤى جديدة في العلاقة بين التغيرات في تعديلات لونين والدول النسخي من جينات النباتات، وكيف يمكن لهذه الآليات بوساطة لونين من تأثير السيطرة التعبير الجيني في بداية المزهرة في نبات الأرابيدوبسيس.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. يشابك من المواد النباتية (1 ساعة)

  1. ينمو نبات الأرابيدوبسيس خطوط المستخدمة في التجربة (النوع البري - WT - مقابل المسوخ، و / أو خطوط معربا عن النسخة الموسومة البروتين الخاص بك من الفائدة مقابل خطوط معربا عن العلامة لا تنصهر إلى أي بروتين) لمدة 12-18 يوما على أطباق بتري كبيرة (150 ملم) مع MS-أجار المتوسطة (1 L: 1X Murashige وسكوغ أملاح، 10 غرام السكروز، 0.5 غرام MES، ودرجة الحموضة 5.7 (KOH)، 1٪ أجار). بدلا من ذلك، وتنمو النباتات على الأواني التي تحتوي على 3: 1 مزيج من التربة والخس.
    تنبيه! الفورمالديهايد السامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد وإن بلع، وينبغي التعامل معها في غطاء الكيميائية ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة. خطوات 1،2-1،6 يجب أن يتم تنفيذ تحت غطاء الدخان.
  2. جعل ثقوب صغيرة في غطاء من 50 مل الأنابيب مع مختبر الموقد ساخنة إبرة. إضافة 40 مل من برنامج تلفزيوني 1X العازلة و1.08 مل من الفورمالدهيد إلى تركيز النهائي من 1٪ (الأسهم 37٪ الصورةolution). جمع 1.5 غرام من المواد النباتية في تلك 50 مل أنابيب. إبقاء الأنابيب على الجليد خلال يشابك.
  3. إغلاق 50 مل الأنابيب مع الغطاء. وضع الأنابيب في مجفف وتطبيق فراغ. فراغ التسلل الأنسجة لمدة 10 دقيقة، ثم حرر فراغ بعناية، لمنع متماوج تصل الحل. خلط العينة. كرر مرتين. بعد تسلل، ومراقبة المواد النباتية وتأكيد أن يصبح شفافة قليلا وتميل إلى تنزل الى قاع الأنبوب (الشكل 2).
  4. إضافة 2.5 مل من 2 M جليكاين لتحقيق تركيز النهائي من 0.125 M. تطبيق فراغ لمدة 5 دقائق. يعمل الجلايسين كمثبط تنافسي من الفورمالديهايد يشابك.
  5. تجاهل حل الفورمالديهايد جليكاين PBS التي كتبها قلب المغلقة أنبوب 50 مل مع ثقوب في الغطاء.
  6. شطف شتلات مرتين مع 1X PBS ومرة ​​مع الماء نبذ الحل الغسيل كما هو موضح في الخطوة 1.5. تجفيفها على منشفة ورقية وتجميد السائل في nitrogeن.
    ملاحظة: الأنسجة المجمدة يمكن أن تظل في -80 درجة مئوية لمدة أسابيع.

2. إعداد الأجسام المضادة (1 اليوم)

ملاحظة: للحصول على مناعي، فمن المستحسن استخدام حبات مغناطيسية مترافق مع الأجسام المضادة عبر بروتين G أو البروتين A رابط مع قابلية عالية للمجال مستمر من السلسلة الثقيلة الأجسام المضادة. يمكن المجمعات الحمض النووي والبروتينات إرفاق unspecifically إلى سطح تقارن الخرز الأجسام المضادة. لهذا السبب، فمن الضروري لأداء الضوابط دون الاجسام المضادة المحددة لقياس خلفية غير محددة ملزمة.

  1. لكل مناعي، وإعداد 15 ميكرولتر من حبات مغناطيسية في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. كمية من الخرز يعتمد على كمية من لونين تستخدم لمناعي وأيضا على الأجسام المضادة.
  2. أن يغسل، إضافة 1 مل من لونين مناعي (رقاقة) عازلة التخفيف من الخرز، مزيج بالتناوب ووضع microcentrifuge ل1.5 مل توأن تكون في الرف المغناطيسي. الانتظار حوالي 1 دقيقة للسماح للالخرز نعلق على المغناطيس. مع 1.5 مل أنابيب microcentrifuge لا يزال في الرف، وإزالة طاف قبل pipetting. كرر مرتين.
    ملاحظة: للحصول على كل سطر مصنع هناك حاجة إلى مجموعتين مناعي: واحد مع الخرز والأجسام المضادة (أب)، والثاني لا الأضداد (لا-أب) التحكم مع حبات مغناطيسية فقط.
  3. resuspend والخرز في 200 ميكرولتر من العازلة الشذرة التخفيف. إضافة المبلغ المطلوب من أب معين إلى واحد من اثنين من أنابيب أعدت لكل خط محطة (التخفيف المحدد يختلف لكل أب وأن يكون الأمثل تجريبيا أو، في حالة الأجسام المضادة التجارية، اتبع تعليمات الشركة المصنعة). استخدام هذا النموذج لمناعي. إضافة نفس الكمية من غير محددة مفتش إلى أنبوب آخر، والتي سيتم استخدامها في مراقبة سلبية.
  4. احتضان O / N على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية للسماح للأضداد إرفاق الخرز.

3. لونين استخراج (4 ساعات)

  1. تطحن جيدا المواد النباتية المجمدة في النيتروجين السائل باستخدام هاون ومدقة حتى يصبح مسحوق متجانس والضوء الأخضر. نقل مسحوق لأنبوب جديد 50 مل.
  2. للحصول على خطوات 3،2-3،6، والعمل تحت غطاء الدخان. إضافة 30 مل من استخراج العازلة 1 (EXB 1)، وتخلط جيدا لامتصاص مسحوق الأنسجة. من هذه الخطوة على، والحفاظ على العينات عند 4 درجات مئوية في جميع الأوقات. سوف الأنسجة المجمدة وبقايا النيتروجين السائل يسبب المخزن المؤقت للتجميد. تأكد من ذوبان الجليد الأنسجة المجمدة تماما عكس أنابيب 4-5 مرات كل 2 دقيقة.
  3. مسح الطين بتمريرها من خلال الأنسجة الترشيح مع حجم المسام من 22-25 ميكرومتر في أنبوب جديد 50 مل وأجهزة الطرد المركزي أنه في 1000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: في هذه الخطوة، فإن نوى وجميع العضيات بيليه. EXB 1 يحتوي على السكروز كافية لتوفير عالية الكثافة ومنع اختلال هيكل عضية.
  4. بلطف إزالة طاف عن طريق الترقيد. في هذه ستاشركة جنرال الكتريك، ومراقبة بيليه الأخضر حوالي 2 مل.
  5. Resuspend وبيليه في 5 مل من EXB 2. إعادة تعليق من بيليه سيكون من الصعب في هذه المرحلة. الطرد المركزي في 1000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: EXB 2 يحتوي على 1٪ تريتون X-100 للمساعدة في انفجار البلاستيدات الخضراء المفتوحة وإزالة الكلوروفيل.
  6. Resuspend وبيليه في 300 ميكرولتر من استخراج العازلة 3 (EXB 3).
  7. في أنبوب microfuge نظيف، إضافة 600 ميكرولتر من EXB 3. خذ بيليه معلق من الخطوة 3.6 و بعناية طبقة على رأس نظيفة EXB 3.
  8. تدور لمدة 1 ساعة على 16000 x ج في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: هذه الخطوة تساعد إزالة المنظفات من العينة.
  9. إزالة طاف بواسطة الشفط مع ماصة. resuspend الكرية النووي في 300 ميكرولتر من العازلة صوتنة قبل pipetting ببطء صعودا وهبوطا لتجنب تشكيل فقاعة، والتي قد تؤثر على كفاءة صوتنة. ماصة بعناية كل تعليق خارج وتحويلها إلى بيئة نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge.
    ملاحظة: هذاعازلة يحتوي SDS، ليز نوى والافراج عن لونين.
  10. يصوتن تعليق ليز نوى وبشكل عشوائي القص لونين إلى أجزاء صغيرة. استخدام الظروف صوتنة التي تجعل لونين المخصب في شظايا بين 200-800 سنة مضت (20-30 دورات بالإعدادات 30 ثانية ON / OFF 30 ثانية في 4 درجة مئوية لمدة الجهاز صوتنة متاح موضح في الجدول المواد / الكواشف). تحقق كفاءة صوتنة قبل الفصل الكهربي من شظايا الحمض النووي التي تم الحصول عليها على هلام الاغاروز 13، تحميل 2 ميكرولتر من لونين sonicated (الشكل 3).
    تنبيه! تأكد من ارتداء معدات حماية الأذن أثناء الخطوة صوتنة في حال لم يتم احتواء جهاز الموجات فوق الصوتية في خزانة عازلة للصوت.
    خطوة حاسمة! تفتيت لونين يعتمد إلى حد كبير على المعدات صوتنة. ينبغي تعديل الشروط صوتنة لتحقيق تخصيب اليورانيوم في أحجام DNA المناسبة. شاهدالرقم 3 مثالا لكيفية تحسين تجزئة لونين.
  11. تدور حل مرة واحدة على 12000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. نقل طاف قبل pipetting إلى نظيفة 1.5 مل أنبوب microcentrifuge. تجاهل بيليه. اتخاذ 1/10 من طاف لجديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge، علامة على أنها المدخلات وتجميد في -20 ° C.
  12. تمييع لونين 10X مع العازلة الشذرة تخفيف لتخفيف SDS إلى تركيز النهائي من 0.1٪.
    ملاحظة: عينات يمكن تجميد وتخزين في -20 درجة مئوية لعدة أسابيع.

4. مناعي من البروتين من الفائدة والإنقاذ من الحمض النووي (1 يوم، 3 ساعة)

  1. تغسل حبات المغلفة مع أب من الخطوة 2.4 ثلاث مرات مع 1 مل من الشذرة العازلة تخفيف لإزالة الفائض من الأجسام المضادة كما هو موضح في الخطوة 2.2. resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة الشذرة التخفيف. إضافة 50 ميكرولتر من لونين معزولة. احتضان O / N على عجلة دوارة في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: التحقق من concentratiعلى من لونين في microvolume أشعة فوق البنفسجية فيس معمل. يجب أن 50 ميكرولتر من لونين معزولة تحتوي على أكثر من 10 ميكروغرام من الحمض النووي.
  2. لخطوات العمل 4،2-4،5 في 4 ° C. تغسل حبات مرتين في 1 مل من الملح منخفضة العازلة الغسل كما هو موضح في الخطوة 2.2.
  3. تغسل حبات مرة واحدة في 1 مل من الملح العالية العازلة غسل.
  4. تغسل حبات مرة واحدة في 1 مل من LiCl غسل العازلة.
  5. تغسل حبات مرتين في 1 مل من TE العازلة. بعد غسل الماضي، للتأكد من إزالة تماما العازلة TE المتبقية في الأنبوب بواسطة الشفط مع ماصة.
  6. اخراج عينات INPUT (الخطوة 3.9). نقل 5 ميكرولتر من INPUT إلى الجديد 1.5 مل أنبوب microcentrifuge والاستمرار كما هو الحال مع عينات رقاقة. عكس يشابك بإضافة 200 ميكرولتر من 5٪ خالب أيون راتنج التبادل، واحتضان لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة 95 درجة مئوية تهز كل 2-3 دقيقة. تدور باستمرار في 16000 x ج لمدة 30 ثانية، ونقل بعناية طاف في أنبوب microcentrifuge جديد من قبل pipetting.
    ملاحظة: على الرغم من أن هيئة تنظيم الاتصالاتطريقة المشروط ليشابك عكس ينطوي على O / N الحضانة مع كلوريد الصوديوم، والحضانة مع راتنج خالب أيون في 95 ° C يسمح للdecrosslinking كفاءة وشطف من الحمض النووي في 10 دقيقة، مما يجعل اليوم بروتوكول واحد أقصر.
  7. إضافة 2 ميكرولتر من بروتين K (10 ملغ / مل)، واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لهضم البروتينات وإطلاق سراح DNA.
  8. وقف رد فعل من جانب تفرخ في 95 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
  9. تدور بسرعة في 16000 x ج لمدة 30 ثانية ونقل طاف لأنبوب جديد من قبل pipetting.
  10. تنظيف عزل الحمض النووي باستخدام معيار شظايا الحمض النووي عدة تنقية.
    ملاحظة: المضي قدما وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  11. نقل العمود ملزمة DNA من عدة إلى 1.5 مل جديد أنبوب microcentrifuge. أزل الحمض النووي تنقيته من خلال إضافة 20 ميكرولتر من المياه خالية من الدناز إلى مركز العمود والغزل في 16000 x ج لمدة 60 ثانية. وقف النقطة: يمكن تخزين العينات في -80 درجة مئوية لعدة أسابيع.

    12. 5. قياس وفرة ملزم مواقع في DNA Immunoprecipitated التي كتبها QPCR (4 ساعات)

    ملاحظة: الحمض النووي معزولة عن لونين عجل لابد من تحليلها لتحديد الحمض النووي شظايا كانت رقاقة إد من لونين الكلي، وذلك بسبب ملزما للبروتين من الفائدة.

    1. الاشعال التصميم للمناطق الجينوم في المصالح مع درجة حرارة انصهار (TM) 60 ° C ومحتوى GC من 30٪ -80٪. كما تم تجزئة لونين صوتنة، لا ينبغي أن يكون طول تسلسل تضخيمها أطول من 150-200 النيوكليوتيدات (الجدول 1).
      ملاحظة: هناك أداة مفيدة لتصميم التمهيدي هو التمهيدي 3 برنامج (http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/). إرشادات إضافية لتصميم التمهيدي المتاحة في التقارير السابقة 8، 14،15.
    2. استخدام برنامج BLAST للتأكد من أن الاشعال محددة (وخاصة المروجين يمكن أن تشترك TF مماثل تسلسل ملزمة) واختبار كفاءة النقيب التمهيديز 1:10 التخفيفات في الماء من الحمض النووي المدخلات (الخطوة 4.9). سيتم تنقية مناطق معينة من الجينوم أفضل من غيرها. ولذلك فمن المهم أن تصميم الاشعال PCR والتحقق منها على DNA المدخلات المخفف.
    3. تمييع DNA النقي 01:10 بالماء وماصة 5 ميكرولتر من الحمض النووي المخفف في أنبوب PCR لكل رد فعل.
      ملاحظة: تمييع فقط المبلغ المطلوب، والحمض النووي يمكن أن نعلق على جدران 1.5 مل أنابيب microcentrifuge. دورات تجميد ذوبان متعددة زيادة عدد جزيئات DNA المرفقة. لكل زوج التمهيدي، والتضخيم في المدخلات، لابد من تحليلها أب رقاقة وبلا أب الشذرة.
    4. لاستكمال مزيج PCR، إضافة SYBR الخضراء PCR مزيج الرئيسي لتركيز النهائي من 1X، و 0.5 ميكرومتر من كل التمهيدي. ملء تصل إلى 20 ميكرولتر مع المياه خالية من الدناز.
    5. نفذ رد فعل QPCR اتباع التعليمات من SYBR الخضراء PCR مصنع مزيج الرئيسي.

    تحليل 6. البيانات

    ملاحظة: من بين السابقينisting طرق تحليل البيانات الشذرة، هي الأكثر شيوعا اثنين. أولهم هو الأسلوب تخصيب أضعاف، ويسمى أيضا "تخصيب النسبي '،' إشارة على خلفية" أو "نسبة إلى السيطرة عدم الضد. يدعى الطريقة الثانية باسم "٪ من مدخلات".

    1. تحليل البيانات باستخدام طريقة تخصيب أضعاف.
      1. إنشاء جدول مع أسماء العينات والقيم ط الخام التي تم الحصول عليها بعد رد فعل QPCR.
      2. لكل عينة، طرح من قيمة الخام ط ط قيمة خام يتم الحصول عليها عن المقابلة سيطرة بلا أب. ملاحظة: بعد هذه العملية الحسابية، فإن قيمة ط م لعينة لا-أب يساوي 0.
      3. حساب تخصيب أضعاف بحلول عملية الأسية مع قاعدة 2 والأس (السلطة) مساو لبقية السلبية التي تم الحصول عليها في الخطوة 6.1.2 (الجدول 2).
        أضعاف تخصيب = 2 - (ط م (عينة) - ط (لا-أب))
        ملاحظة: في هذا methoد مقارنة وفرة جزء DNA محددة في نموذج رقاقة إد مع وفرة من هذه القطعة في السيطرة بلا أب. افتراض من هذا الأسلوب هو أن مستوى إشارة الخلفية غير قابلة للتكرار بين مجموعات مختلفة التمهيدي، والعينات، وتكرار التجارب. ومع ذلك، هذه المستويات إشارة'noise' لا تختلف بين مجموعات التمهيدي، والعينات، والتجارب.
    2. تحليل البيانات عن طريق٪ من طريقة الإدخال.
      1. إنشاء جدول مع أسماء العينات والقيم ط الخام التي تم الحصول عليها بالنسبة لهم بعد رد فعل QPCR.
      2. ضبط القيم ط الخام لعينات المدخلات عن طريق طرح قيمة من قاعدة اللوغاريتم 2 من جزء من مجموع ونين المستخرج الذي اتخذ كمدخل.
        ملاحظة: في هذا البروتوكول تساوي قيمة طرح 3.32، كما تم أخذ 10٪ من إجمالي ونين كمدخل في هذا البروتوكول. تسجيل 2 (10) يساوي 3.32.
      3. حساب٪ من المدخلات عن طريق ضرب من قبل 100 قيمة العملية الأسية مع ببورصة عمان 2 والأس (السلطة) يساوي ما تبقى من قيم الإدخال المعدلة تطرح من القيم ط الخام من العينة (الجدول 3).
        ٪ من مدخلات = 100 * 2 (المدخلات المعدلة - ط (عينة))
        ملاحظة: مع هذا الإجراء، يتم احتساب العلاقة بين وفرة DNA محددة في نموذج رقاقة إد إلى إجمالي ونين معزولة (عينة المدخلات). مزيد من التفاصيل حول تحليل البيانات رقاقة يمكن العثور عليها في هارينغ وآخرون. 8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

يمكن خص ثمانية خطوات رئيسية في هذا البروتوكول رقاقة لتحديد المجراة التفاعلات DNA البروتين، بما في ذلك زراعة وحصاد المواد النباتية، عبر ربط لونين، والعزلة لونين، تجزئة لونين، والعزلة انتقائية من المجمعات بين الحمض النووي و البروتين من الاهتمام من قبل مناعي، هضم البروتين، وتنقية الحمض النووي، وتحليل QPCR (الشكل 1). خطوة حاسمة في بروتوكول الشذرة هي تثبيت للتفاعلات الحمض النووي والبروتينات في رد فعل عبر ربط. عادة، يتم استخدام الفورمالديهايد عبر ربط في مصنع رق...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول الشذرة الموصوفة هنا هو أسلوب استنساخه وقوية لتحليل التفاعلات بين البروتينات وتسلسل الحمض النووي محددة في الجسم الحي في النباتات نبات الأرابيدوبسيس. A تحديد الناجح لمواقع الربط للبروتينات ذات الاهتمام يتطلب اختيار كافية من أجهزة النبات أو مراحل النمو حيث التفاعلات ذات الصلة وتتخذ فعلا. وبالإضافة إلى ذلك، من المهم جدا للحصول على التثبيت المناسب من المواد النباتية والقص الأمثل للونين صوتنة. أجسام مضادة محددة للغاية للمناعي فعال لاختيار بروتين / العلامة ضرورية أيضا. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

يود المؤلفون الاعتراف ب The Plant Cell للسماح باستخدام بعض البيانات المنشورة في هذه المجلة لتوضيح النتائج التمثيلية الموضحة هنا في الشكل 4. تم دعم هذا العمل من قبل الاتحاد الأوروبي 7FP Marie Curie-Initial Training Network EpiTRAITS (اتفاقية المنح 316965), ومن قبل وزارة الاقتصاد والاقتصاد الإسبانية (المنح BIO2010-15589 و BIO2013-43098-R).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
MESSigmaM8250
MS (خليط الملح القاعدي Murashige و Skoog)SigmaM5524
الفورمالديهايد 37٪ سيجماF8775-25استخدم تحت غطاء الدخان
مزيج مثبطات البروتياز cOmplete ULTRA Tablets ، Mini ، خالية من EDTA ، EASYpackRoche5892791001
Bioruptor جهاز صوتنة قياسيDiagenodeB01010002 (UCD200TO) Glycine
Sigma50046
QIAquick PCR Purification KitQiagen28104
حبات Dynabeads المغناطيسية إلى جانب البروتين A أو البروتين GLife Technologies10003D / 10001Dتحقق من الشركة المصنعة دليل s لتقارب الأجسام المضادة
MiraclothMerck Millipore475855
Triton X-100 Surfact-Amps DetergentSolution Life Technologies85112
(فأر ، فأر ، أرنب & hellip ؛)-IgGDiagenodeC15400001 ، C15420001 ، C15410206
الرف المغناطيسي - DynaMag-2Life Technologies12321D
H3K9 / 14ac الأجسام المضادة متعددة النسيلة - Premium & nbsp ؛دياجينودC15410200-10
Chelex 100 ResinBio-Rad142-2832
Proteinase KLife Technologies17916
Anti-Myc Tag Antibody ، استنساخ 4A6Millipore05-724
LightCycler 480 SYBR Green I MasterRoche4707516001

المراجع

  1. Andres, F., Coupland, G. The genetic basis of flowering responses to seasonal cues. Nat Rev Genet. 13 (9), 627-639 (2012).
  2. Capovilla, G., Schmid, M., Pose, D. Control of flowering by ambient temperature. J Exp Bot. 66 (1), 59-69 (2015).
  3. Jarillo, J. A., Piñeiro, M. Timing is everything in plant development. The central role of floral repressors. Plant Science. 181 (4), 364-378 (2011).
  4. Pajoro, A., et al. The (r)evolution of gene regulatory networks controlling Arabidopsis plant reproduction: a two-decade history. J Exp Bot. 65 (17), 4731-4745 (2014).
  5. He, Y. Chromatin regulation of flowering. Trends Plant Sci. 17 (9), 556-562 (2012).
  6. Jarillo, J. A., Pineiro, M., Cubas, P., Martinez-Zapater, J. M. Chromatin remodeling in plant development. International Journal of Developmental Biology. 53 (8-10), 1581-1596 (2009).
  7. Saleh, A., Alvarez-Venegas, R., Avramova, Z. An efficient chromatin immunoprecipitation (ChIP) protocol for studying histone modifications in Arabidopsis plants. Nat Protoc. 3 (6), 1018-1025 (2008).
  8. Haring, M., et al. Chromatin immunoprecipitation: optimization, quantitative analysis and data normalization. Plant Methods. 3, 11(2007).
  9. Kaufmann, K., et al. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) of plant transcription factors followed by sequencing (ChIP-SEQ) or hybridization to whole genome arrays (ChIP-CHIP). Nat Protoc. 5 (3), 457-472 (2010).
  10. Gomez-Mena, C., et al. early bolting in short days: An Arabidopsis mutation that causes early flowering and partially suppresses the floral phenotype of leafy. Plant Cell. 13 (5), 1011-1024 (2001).
  11. Piñeiro, M., Gomez-Mena, C., Schaffer, R., Martinez-Zapater, J. M., Coupland, G. EARLY BOLTING IN SHORT DAYS is related to chromatin remodeling factors and regulates flowering in Arabidopsis by repressing FT. Plant Cell. 15 (7), 1552-1562 (2003).
  12. Lopez-Gonzalez, L., et al. Chromatin-dependent repression of the Arabidopsis floral integrator genes involves plant specific PHD-containing proteins. Plant Cell. 26 (10), 3922-3938 (2014).
  13. Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. , Cold Spring Harbor. Laboratory Press. Cold Spring Harbor, NY. (1989).
  14. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. , e3998(2012).
  15. Wong, M. L., Medrano, J. F. Real-time PCR for mRNA quantitation. Biotechniques. 39 (1), 75-85 (2005).
  16. Dedon, P. C., Soults, J. A., Allis, C. D., Gorovsky, M. A. A simplified formaldehyde fixation and immunoprecipitation technique for studying protein-DNA interactions. Anal Biochem. 197 (1), 83-90 (1991).
  17. Yu, C. W., et al. HISTONE DEACETYLASE6 interacts with FLOWERING LOCUS D and regulates flowering in Arabidopsis. Plant Physiology. 156 (1), 173-184 (2011).
  18. Zhou, J., et al. Genome-wide profiling of histone H3 lysine 9 acetylation and dimethylation in Arabidopsis reveals correlation between multiple histone marks and gene expression. Plant Mol Biol. 72 (6), 585-595 (2010).
  19. Lafos, M., et al. Dynamic regulation of H3K27 trimethylation during Arabidopsis differentiation. PLoS Genet. 7 (4), e1002040(2011).
  20. Barcala, M., Fenoll, C., Escobar, C. Laser microdissection of cells and isolation of high-quality RNA after cryosectioning. Methods Mol Biol. 883, 87-95 (2012).
  21. Carter, A. D., Bonyadi, R., Gifford, M. L. The use of fluorescence-activated cell sorting in studying plant development and environmental responses. Int J Dev Biol. 57 (6-8), 545-552 (2013).
  22. Deal, R. B., Henikoff, S. The INTACT method for cell type-specific gene expression and chromatin profiling in Arabidopsis thaliana. Nat Protoc. 6 (1), 56-68 (2011).
  23. Zeng, P. Y., Vakoc, C. R., Chen, Z. C., Blobel, G. A., Berger, S. L. In vivo dual cross-linking for identification of indirect DNA-associated proteins by chromatin immunoprecipitation. Biotechniques. 41 (6), 694-698 (2006).
  24. Das, P. M., Ramachandran, K., vanWert, J., Singal, R. Chromatin immunoprecipitation assay. Biotechniques. 37 (6), 961-969 (2004).
  25. Kaufmann, K., et al. Target genes of the MADS transcription factor SEPALLATA3: integration of developmental and hormonal pathways in the Arabidopsis flower. PLoS Biol. 7 (4), e1000090(2009).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

*Arabidopsis Thaliana*ارتباط عامل النسختحليل تعديل الهيستونإجراء الربط التشابكيالتجزئة بالسونيكاتالترسيب المناعي باستخدام الخرز المغناطيسيالتكميم بواسطة qPCRتنظيم جين FT
مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.