سلوك الخلايا الليفية يكمن وراء مجموعة من الكيانات السريرية ، لكنها لا تزال سيئة الوصف ، ويرجع ذلك إلى حد كبير إلى عدم تجانسها المتأصل. تعتمد أبحاث الخلايا الليفية التقليدية على التلاعب في المختبر ، وإخفاء سلوك الخلايا الليفية في الجسم الحي. نصف بروتوكولا قائما على FACS لعزل الخلايا الليفية لجلد الفئران الذي لا يتطلب زراعة الخلايا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
الفئران عن طريق الجلد الخلايا الليفية العزلة التي FACS
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
الليفية هي نوع من الخلايا المسؤولة عن إفراز المبدأ المصفوفة خارج الخلية وهي عنصر حاسم في كثير من الأعضاء والأنسجة. علم وظائف الأعضاء وعلم الأمراض الليفية تكمن وراء مجموعة من الكيانات السريرية، بما في ذلك fibroses في أجهزة متعددة، تندب الضخامي الحروق التالية، وفقدان وظيفة القلب بعد نقص التروية، وتشكيل سدى السرطان. ومع ذلك، لا تزال الخلايا الليفية نوع رديء تتميز الخلايا، إلى حد كبير بسبب عدم التجانس الكامنة. الطرق الحالية لعزل الخلايا الليفية تتطلب وقتا في الثقافة الخلية التي تؤثر تأثيرا عميقا النمط الظاهري الخلية والسلوك. ونتيجة لذلك، فإن العديد من الدراسات التحقيق الليفية البيولوجيا تعتمد على التلاعب في المختبر وليس لالتقاط بدقة سلوك الخلايا الليفية في الجسم الحي. للتغلب على هذه المشكلة، قمنا بتطوير بروتوكول القائم على FACS لعزل الخلايا الليفية من الجلد الظهرية من الفئران الكبار التي لا تتطلب زراعة الخلايا، وبالتالي preserviنانوغرام النسخي فيزيولوجي و ملفه الشخصي البروتين من كل خلية. يسمح استراتيجيتنا لاستبعاد الأنساب غير الوسيطة عبر بوابة السلبية النسب (لين -) بدلا من استراتيجية انتقاء إيجابي لتجنب الاختيار أو تخصيب جزء من السكان من الخلايا الليفية التعبير عن علامات سطح معينة وتكون شاملة قدر الإمكان عبر هذا غير متجانسة نوع من الخلايا.
المقدمة
في كثير من الأحيان يتم تعريف الخلايا الليفية شكليا باسم خلايا مغزلية الشكل التي تلتزم ركائز بلاستيكية. الليفية هي نوع من الخلايا المبدأ مسؤولة عن تجميع وإعادة عرض المصفوفة خارج الخلية في الجنينية والكبار الأجهزة 1. الليفية هي بالتالي حاسمة للتنمية الثدييات وتساهم إلى حد كبير في الوسط خارج الخلية التي تؤثر على سلوك أنواع الخلايا الموجودة في كل الأنسجة والأعضاء المجاورة.
الليفية هي أيضا نوع من الخلايا الرئيسي وراء مجموعة متنوعة من الظروف الطبية التي تسبب عبئا هائلا السريري. النشاط الليفية مرضية يضعف وظيفة الأنسجة الطبيعية، وتشمل الأنسجة وتليف الجهاز (....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول يتبع الأساليب التي أقرها الفريق الإداري جامعة ستانفورد في مختبر رعاية الحيوان.
1. الهضم الفئران الأدمة
- الموت ببطء الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم بعد التخدير مع حقنة داخل الصفاق من الكيتامين 100 ملغ / كغ + زيلازين 20 مغ / كغ + آسيبرومازين 3 ملغ / كغ.
ملاحظة: مختلف الأعمار والخلفيات يمكن استخدامها. - حلاقة ويزيل الشعر على الجلد الظهرية. حوالي 100،000 الخلايا يمكن عزلها عن قطعة من الجلد الظهري 60 مم × 1....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تم التحقق من صحة هذا النهج (الشكل 1) في عدد من الطرق، التي يمكن دراستها في التفاصيل في موقعنا نشر مؤخرا 27. وتشمل هذه مناعية الخلايا مرتبة وخلية الإعلام وحيد الخلية تحليل النسخي الخلايا مرتبة حديثا. فرز الخلايا الليفية مباشرة بدلا من الاعتماد على الثقافة بشكل أكثر دقة يلتقط في الجسم الحي على النمط الظاهري. باستخدام نهج النسب السلبية استنزاف (الشكل 2A) بدلا من نهج اختيار إيجابي يتجنب ما قبل اختيار لمجموعات سكانية فرعية معينة. وقد تجلى قيمة هذا النهج.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
بروتوكول صفها في هذه المخطوطة يوفر وسيلة لعزل الخلايا الليفية عن طريق الفرز على أساس FACS، بالمقارنة مع الطرق القائمة، والتي إما تحديد لجزء من السكان أو تتطلب وقتا في ثقافة الخلية قبل التحليلات اللاحقة. الوقت اللازم من حصاد الجلد لفرز الخلايا الليفية ما يقرب من 6 ساعات. ومع ذلك، فإن عدد الفئران المستخدمة في الحصاد يؤثر هذا التقدير.
تتطلب العديد من النقاط في بروتوكول عناية خاصة. الأول هو الحد من التلوث خلية شحمية .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل في جزء من منحة مقدمة من المعاهد الوطنية للصحة المنحة R01 GM087609 (لهبل)، وهي هدية من انغريد لاي وبيل شو تكريما لأنتوني شو (لهبل)، NIH منحة U01 HL099776 (لMTL)، ومختبر Hagey ل طب الأطفال الطب التجديدي، ومؤسسة أوك (لMTL، GCG وHPL). وأيد GGW من كلية ستانفورد للطب، وبرنامج التدريب ستانفورد عالم الطبية، ومنحة تدريبية NIGMS GM07365. وأيد ZNM من قبل جراحة التجميل مؤسسة أبحاث زمالة غرانت وصندوق الأسرة Hagey. وأيد MSH من معهد كاليفورنيا للطب التجديدي (CIRM) زميل السريرية منحة تدريبية TG2-01159، والجمعية الأمريكية لجراحي الوجه والفكين (ASMS) / الوجه والفكين الجراحين مؤسسة (MSF) جائزة منحة بحثية، وزراعة الأنسجة وجائزة الهندسة الزمالة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| ملقط جراحي كينت | INS650916 | مقص | |
| دقيق | كينت ساينتفيك | INS600127 | |
| بوفيدون محلول إعداد اليود | Dynarex | 1415 | |
| Nair (كريم مزيل الشعر) | شركة Church and Dwight Co. | 22600267058 | |
| كولاجيناز IV | Gibco | 17104-019 | |
| Elastase | Abcam | ab95133 | |
| DMEM | Life Technologies | A14430-01 | |
| مصل الأبقار الجنيني | Gibco | 16000-044 | |
| عازلة التحلل الأمونيوم كلوريد البوتاسيوم (ACK) | Gibco | A10492-01 | |
| 40 & mu ؛ مرشحات م | فيشر Scientific | 08-771-1 | |
| 70 & م مرشحات | فيشر Scientific | 08-771-2 | |
| 100 & مرشحات m | فيشر Scientific | 08-771-19 | |
| CD31 | BioLegend | 102421 | |
| CD45 | BioLegend | 103125 | |
| Tie2 | BioLegend | 124005 | |
| Ter-119 | BioLegend | 116233 | |
| EpCAM (CD326) | eBioscience | 48-5791 | |
| DAPI | Invitrogen | D3571 | |
| يوديد البروبيديوم (صبغة PI قابلية للحياة) | BioLegend | 421301 |
المراجع
- Sorrell, J. M., Caplan, A. I. Fibroblasts-a diverse population at the center of it all. International review of cell and molecular biology. 276, 161-214 (2009).
- Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
