Method Article

بناء المهندسة القلب الأنسجة تعريف الإنسان لدراسة آليات العلاج الخلوي القلب

DOI:

10.3791/53447

⸱

March 1st, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Cardiovascular Research Center, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 2The Mindich Child Health and Development Institute, Icahn School of Medicine at Mount Sinai, 3Stem Cell & Regenerative Medicine Consortium, LKS Faculty of Medicine, University of Hong Kong

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصف هذه المخطوطة إنشاء أنسجة قلبية هندسية محددة باستخدام تعبير علامات السطح وفرز الخلايا. يمكن بعد ذلك استخدام الأنسجة المحددة في مفاعل حيوي متعدد الأنسجة للتحقيق في آليات العلاج بخلايا القلب من أجل توفير نظام نموذجي وظيفي ، ولكن خاضع للرقابة ، لقلب الإنسان.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يمكن أن تؤثر هندسة أنسجة القلب البشرية بشكل أساسي على الاكتشاف العلاجي من خلال تطوير أنظمة فحص جديدة خاصة بالأنواع تكرر الإخلاص الحيوي لعضلة القلب البشرية الأصلية ثلاثية الأبعاد ، مع تمكين مستوى خاضع للرقابة من التعقيد البيولوجي ، والسماح بالمراقبة الطولية غير المدمرة لوظيفة انقباض الأنسجة. في البداية ، تم إنشاء أنسجة القلب المهندسة البشرية (hECT) باستخدام مجموعة الخلايا بأكملها التي تم الحصول عليها من التمايز الموجه للخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات ، والتي تنتج عادة أقل من 50٪ من خلايا عضلة القلب. ومع ذلك ، لإنشاء نماذج تنبؤية موثوقة لعضلة القلب البشرية ، ولتوضيح آليات تفاعل الخلايا غير المتجانسة ، من الضروري التحكم بدقة في التركيب البيولوجي في الأنسجة الهندسية.

لمعالجة هذا القيد ، نستخدم فرز الخلايا الحية لعلامة سطح القلب SIRPα وعلامة الخلايا الليفية CD90 لإنشاء أنسجة تحتوي على نسبة 3: 1 من أنواع الخلايا هذه ، على التوالي ، والتي يتم خلطها بعد ذلك معا وإضافتها إلى محلول مصفوفة قائم على الكولاجين. وبالتالي ، يتم تحديد hECTs الناتجة تماما في كل من تكوين المصفوفة الخلوية وخارج الخلية.

هنا نصف بناء hECTs المحددة كنظام نموذجي لفهم آليات تفاعلات الخلية الخلوية في العلاجات الخلوية ، باستخدام مثال على الخلايا الجذعية الوسيطة المشتقة من نخاع العظام البشرية (hMSC) التي يتم استخدامها حاليا في التجارب السريرية البشرية. يعد تكوين الأنسجة المحدد أمرا ضروريا لفهم كيفية تفاعل الخلايا الجذعية الجذعية الجذعية مع أنواع الخلايا القلبية الذاتية لتعزيز وظيفة الأنسجة. تم وصف نظام المفاعل الحيوي الذي يزرع في نفس الوقت ستة hECTs بالتوازي ، مما يسمح باستخدام أكثر كفاءة للخلايا بعد الفرز.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تقدمت هندسة الأنسجة القلبية إلى حد كبير في العقد الماضي، مع مجموعات متعددة نشر نتائج وظيفية بالكامل، والضرب الأنسجة المصنوعة من كلا العضلية الفئران 1-6، وفي الآونة الأخيرة، myocytes القلب الإنسان المستمدة الخلايا الجذعية 7-12. إن مجال هندسة الأنسجة القلبية من قبل اثنين من الأهداف الرئيسية والمستقلة أساسا: 1) لتطوير ترقيع الخارجية التي يمكن زرعها في قلوب فشلها في تحسين وظيفة 4-6. و2) لتطوير نماذج في المختبر لدراسة علم وظائف الأعضاء والمرض، أو أدوات الفحص للتنمية العلاجية 2،7.

يعتبر ثلاثي الأبعاد (3-D) زراعة الخلايا ضرورية لتطوير أدوات الفحص الجيل القادم، كما تعكس المصفوفة 3-D المكروية القلب أكثر طبيعية من ثقافة الخلية أحادي الطبقة التقليدية 2-D. في الواقع بعض جوانب بيولوجيا الخلية تختلف اختلافا جوهريا في 2-D الثقافات مقابل 3-D 13،14 . بالإضافة إلى ذلك، يتم إنشاء أنسجة القلب هندسيا من عناصر محددة تماما: المصفوفة خارج الخلية، ويبلغ عدد سكانها الخلية. لأنسجة القلب عند الإنسان التقليدية، بينما يتم التحكم في تكوين مصفوفة خارج الخلية (عادة الفيبرين 9 أو الكولاجين 7،8،10) بدقة، يتم تعريف تكوين خلية مدخلات أقل بشكل جيد، مع خليط كامل من الخلايا من تمايز القلب موجهة إما الخلايا الجذعية الجنينية (ESC 7،9) أو التي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (IPSC 10،12) يتم إضافتها إلى الأنسجة. اعتمادا على خط خلية معينة وكفاءة بروتوكول التمايز المستخدمة، ونسبة الناتج العضلية يمكن أن تتراوح بين أقل من 25٪ إلى أكثر من 90٪، والنمط الظاهري cardiomyocyte محددة (على سبيل المثال، ventricular-، atrial-، أو تنظيم ضربات القلب مثل) يمكن أيضا تختلف، حتى جزء غير cardiomyocyte يمكن أن تكون متباينة للغاية 15،16 ويغير نضج م القلب متباينةyocytes 17.

وقد حاولت مؤخرا القلب عمل هندسة الأنسجة للسيطرة على السكان المدخلات من الخلايا، إما مع مراسل القلب الجذعية الجنينية البشرية خط الخلية 8 أو خلية السطح علامات 18 تستخدم لعزل المكون العضلية القلبية من التمايز. بينما في البداية الأنسجة المكونة من myocytes القلب الوحيدة التي يبدو أن المثل الأعلى، وهذا هو في الواقع ليس كذلك. فشل hECTs تتألف فقط من myocytes القلب ضغط إلى أنسجة وظيفية، مع بعض الجماعات كشفت عن نسبة 3: 1 من myocytes القلب: الخلايا الليفية المنتجة أعلى قوة نشل 8. باستخدام مختلف أساليب تحديد الخلية، بما في ذلك علامات سطح لفرز الخلايا الحية، فمن الممكن لخلق hECTs مع السكان الخلية المحددة. بينما علامات خلايا انسجة غير القلب كانت متاحة لبعض الوقت، مثل علامة الليفية المفترضة CD90 19،20، كانت علامات سطح myocytes القلب أكثر صعوبةالتعرف عليها. كان SIRPα من بين أولى علامات سطح القلب التي تم تحديدها لmyocytes القلب الإنسان 18 ولقد ثبت أن تكون انتقائية للغاية لنسب القلب. مؤخرا، وجدنا أن مزدوجة والفرز لSIRPα + وCD90 - الخلايا العضلية ينتج نقية تقريبا، مع CD90 + سكان واظهار مثل الخلايا الليفية النمط الظاهري (Josowitz والملاحظات غير منشورة). وبناء على هذه النتائج التي تم جمعها، هنا وصفنا خلق hECTs باستخدام 3: مجموعة 1 من SIRPα + / CD90 - العضلية وCD90 + الخلايا الليفية.

القدرة على هندسة الأنسجة القلبية الإنسان يعرف تماما أمر ضروري ليس فقط لخلق أدوات الفحص قوية، ولكن أيضا لتطوير نظم نموذج للتحقيق الخلوي الناشئة وعلاجات القلب على أساس الجينات. وعلى وجه الخصوص، والعديد من علاجات الخلايا لقصور القلب، وذلك باستخدام أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا الجذعية الوسيطة (MSC) 21 ، الخلايا الجذعية القلب 22 والخلايا وحيدة النواة نخاع العظام 23-25، قد تم اختبارها في التجارب السريرية. في حين أن العديد من النتائج الأولية قد وعد 21،23،25، والاستفادة الأولية غالبا ما يقلل مرور الوقت 26-29. تم الإبلاغ عن وجود اتجاه مماثل في الفئران المهندسة أنسجة القلب، الذي عرض فائدة وظيفية كبيرة بسبب MSC مكملات، ولكن لم تتم المحافظة صالح خلال ثقافة طويل الأجل 1. الكامنة وراء الأداء دون المستوى الأمثل هو معرفتنا محدودة من الآليات التي تحكم علاجات الخلايا. فهم أعمق لكيفية الخلايا العلاجية ممارسة تأثير مفيد، وكذلك العواقب السلبية المحتملة من التفاعلات العضلية nonmyocyte، سيمكن تطوير وتحسين العلاجات تحقق فوائد هامة سريريا ومستدامة، مع آثار جانبية أقل، للمرضى المصابين بقصور في القلب.

هنا، نحن تصف استخدام hECTs محددة لinterrogأكل آليات العلاج المبني على الخلية. تكوين الأنسجة التي تسيطر عليها أمر ضروري لتحديد العوامل المحددة التي تؤثر على أداء cardiomyocyte. المكمل مباشرة hECTs مع نوع من الخلايا العلاجية من الفائدة (على سبيل المثال، اللجان الدائمة)، يمكن أن تكشف عن الآثار المترتبة على أداء العضلية القلبية، ولقد أثبتنا في النظام الأوروبي الفئران 1.

يبدأ بعد بروتوكول متعددة الخطوات مع توجه القلب تمايز الخلايا الجذعية، تليها تصنيع مفاعل حيوي متعدد الأنسجة، وعقد مع وصفا لبناء الأنسجة والتحليل الوظيفي. يتم تنفيذ تجاربنا باستخدام سطر وافق NIH-H7 الإنسان الخلايا الجذعية الجنينية (HESC). ومع ذلك، كما تم اختبار البروتوكولات التالية باستخدام خط HESC إضافية وثلاثة الناجم عن الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSC) خطوط مع نتائج مماثلة. لقد وجدنا أن الكفاءة في تمايز cardiomyocyte والنجاح في كان الحاخام هيشت تلفيق يمكن أن يكون خط الخلية التابعة، لا سيما FOخطوط ص hiPSC المستمدة من مريض على حدة. باتباع هذا البروتوكول، ومطلي طبقين 6 جيدا مع ما مجموعه 1680000 hESCs (140،000 الخلايا لكل بئر)، والتي ينتج ما يقرب من 2.5 مليون myocytes بعد التفريق لمدة 20 أيام والفرز، وهو ما يكفي لجعل ستة الأنسجة محددة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: تنفيذ كافة التلاعب خلية في ظروف معقمة باستخدام الدرجة الثانية خزانة السلامة البيولوجية تصفية HEPA وتعقيم جميع الحلول من خلال تصفية لهم من خلال مرشح 0.2 ميكرون. أداء بناء الأنسجة واختبار وظيفة سواء في نفس ظروف معقمة أو غطاء تدفق الصفحي.

1. البذر من H7 hESCs في التحضير للتمايز القلب

  1. (يوم 1) إعداد بدروم غشاء مصفوفة
    1. ذوبان الجليد 150 ميكرولتر قسامة من HESC المؤهلة مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  2. (يوم 0-4) الطلاء من hESCs على لوحات المغلفة
    1. تمييع مصفوفة إذابة إلى 12 مل من الجليد الباردة DMEM / F12 وتخلط جيدا.
    2. نقل 1 مل من محلول DMEM / F12 مصفوفة في كل بئر من صحن زراعة الأنسجة 6-جيدا المعالجة. كل قسامة من المصفوفة يمكن معطف صفيحتين 6 جيدا.
    3. احتضان لوحات مغلفة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: فيتجربتنا، أطباق المغلفة مختومة مع البارافين ويمكن تخزينها في حل مصفوفة عند 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 10 أيام قبل الاستخدام.
    4. وفي حوالي 75٪ التقاء، تنأى H7 hESCs من الطبق 10 سم باستخدام 6 مل من كاشف تفارق غير الأنزيمية. بعد 5 دقائق، كشط بلطف الخلايا من سطح الثقافة باستخدام مكشطة الخلية يمكن التخلص منها ونقل تعليق خلية إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي معقمة.
    5. إزالة 0.5 مل من محلول التفكك مع الخلايا من أنبوب 15 مل ونقل إلى العقيمة 15 مل أنبوب جديد (ترك 5.5 مل من كاشف تفارق لزيادة يفرق بين hESCs) لنشر خط الخلايا الجذعية.
    6. بيليه 0.5 مل من الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق عند 20 درجة مئوية. إزالة طاف و resuspend بلطف في 8 مل من وسائل الاعلام الخلايا الجذعية المحفزة التي تحتوي على 1٪ البنسلين ستربتومايسين ثم نقل إلى المغلفة، 10 سم طبق جديد، وزراعة الأنسجة والحفاظ على 37 درجة مئوية، وCO 2 5٪ للحفاظ على خط الخلايا الجذعية.
      ملاحظة: حافظ على المحفزة وسائل الاعلام الخلايا الجذعية على الجليد خلال التغيرات وسائل الإعلام.
    7. وفي الوقت نفسه، إضافة 5.5 ميكرولتر من 10 ملي ROCK المانع Y-27632 إلى 5.5 مل من التفكك حل المتبقية والاستمرار في احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق أخرى. المزيج بلطف الخلايا مع 5 مل الماصة المصلية. الاستمرار في احتضان حتى يتم التوصل إلى تعليق خلية واحدة، ثم بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. resuspend الخلايا في 5 مل من وسائل الاعلام الخلايا الجذعية المحفزة وإجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات.
    9. بذور كل بئر من صحن 6 جيدا في مناطق ذات كثافة من 140،000 الخلايا لكل بئر. البذور اثنين 6 لوحات جيدا لإنشاء ما مجموعه ستة الأنسجة محددة. تخلص من أي الخلايا المتبقية بعد الطلاء.
    10. ملء البئر إلى 1 مل مع وسائل الاعلام الخلية الجذعية المحفزة واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. في وقت لاحق أربع وعشرين ساعة، وإزالة وسائل الإعلام وإضافة 2 مل من وسائل الاعلام الخلايا الجذعية المحفزة جديدة إلى كل بئر (الشكل 1A ).
    11. تحقق التقاء لوحات كل يوم، ويبدأ التمايز مرة واحدة الخلايا تصل إلى ما يقرب من 75٪ التقاء (الشكل 1B - D).

2. (يوم 24/4) تمايز الخلايا الجذعية الجنينية البشرية لالعضلية 30،31

  1. (يوم 4-7، التمايز يوم 0-3) الأديم المتوسط ​​الحث
    1. إعداد RPMI وسائل الإعلام التمايز الأول (الجدول 1) عن طريق الجمع بين 500 مل RPMI 1640 مع 10 ملحق مل B27 (بدون الأنسولين) و 5 مل من محلول المخزون البنسلين ستربتومايسين (10000 وحدة دولية / مل البنسلين، 10000 ميكروغرام / مل الستربتومايسين). قسامة، على الجليد، إلى 50 مل الأنابيب وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. (يوم 4، التمايز يوم 0) إعداد وسائل الاعلام الاستقراء الأديم المتوسط ​​بإضافة 2.4 ميكرولتر من CHIR99021 صغيرة جزيء GSK3 المانع (10 ملي الأسهم، 6 ميكرومتر تركيز النهائي) إلى 12 مل من وسائل الاعلام التمايز RPMI أولا إزالة المحفزة وسائل الاعلام الخلايا الجذعية من كل جانب االثانية استبدالها مع 2 مل من وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض لكل بئر. العودة إلى لوحة الحاضنة.
      ملاحظة: كبير موت الخلية يحدث عادة مع إضافة CHIR99021 (الشكل 1E). سوف أحادي الطبقة على التعافي، ولكن من المهم لشطف الخلايا الميتة بعيدا مع شطف DMEM / F12.
    3. (يوم 5، التمايز يوم 1) إعداد وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض جديدة كما هو موضح أعلاه. إزالة وسائل الإعلام القديمة من كل بئر وشطف مرة واحدة مع 1 مل من DMEM / F12 لكل بئر. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض جديدة إلى كل بئر.
      ملاحظة: الشطف كل يوم من يوم 0-10 يزيد كثيرا المحصول ونقاء myocytes القلب.
    4. (يوم 6 التمايز يوم 2) إزالة وسائل الإعلام تحريض القلب وشطف مرة واحدة مع 1 مل DMEM / F12 لكل بئر. استبدال شطف مع 2 مل سائل الإعلام التمايز RPMI الأول (أي جزيئات صغيرة أضفت لكن لا يزال مع B27 (بدون الأنسولين) ملحق) والعودة إلى الحاضنة.
  2. (يوم 13/7، التمايز داص 3-10) قلب الأديم المتوسط ​​الحث
    1. (يوم 7 التمايز يوم 3) إعداد وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض القلب عن طريق إضافة 6 ميكرولتر من جزيء صغير WNT المانع IWR-1 (10 ملي الأسهم، 5 ميكرومتر النهائي) إلى 12 مل من RPMI وسائل الاعلام التفريق أولا
    2. إزالة وسائل الإعلام من كل بئر، وشطف مرة واحدة مع 1 مل DMEM / F12 لكل بئر واستبدالها مع 2 مل من وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​تحريض القلب لكل بئر.
    3. (يوم 8 التمايز يوم 4) إعداد مدة 12 مل إضافية من وسائل الإعلام تحريض الأديم المتوسط ​​القلب كما هو موضح أعلاه. إزالة وسائل الإعلام وأضاف في اليوم السابق، وشطف مرة واحدة مع 1 مل DMEM / F12 لكل بئر واستبدالها مع 2 مل من وسائل الاعلام الأديم المتوسط ​​التمايز القلب النقي لكل بئر والعودة إلى الحاضنة.
    4. (يوم 10/9، التمايز يوم 5-6) على كلا أيام، وإزالة وسائل الإعلام الأديم المتوسط ​​تحريض القلب وشطف كل جيدا مع 1 مل من DMEM / F12.
    5. إضافة 2 مل من وسائل الاعلام التمايز RPMI الطازجة الأول (أي جزيئات صغيرة وأضافت ولكن لا يزال مع B27 (بدون الأنسولين) ملحق)إلى كل بئر والعودة إلى لوحة الحاضنة.
  3. (يوم 11-24، التمايز يوم 7-20) المستمدة [هس-منظمة العضلية للقلب / النضج
    1. إعداد RPMI وسائل الإعلام التمايز الثاني (الجدول 1) عن طريق الجمع بين 500 مل RPMI 1640 مع 10 ملحق مل B27 (مع الأنسولين) و 5 مل من البنسلين ستربتومايسين حل الأسهم. قسامة، على الجليد، إلى 50 مل الأنابيب وتخزينها في 4 درجات مئوية.
    2. (يوم 11 التفاضل يوم 7) إزالة RPMI وسائل الإعلام التمايز (بدون الأنسولين) من كل بئر وشطف مع 1 مل DMEM / F12. استبدال 2 مل من RPMI وسائل الإعلام التمايز الجديد الثاني (مع الأنسولين) إلى كل بئر والعودة إلى الحاضنة.
      ملاحظة: يجب أولا أن لاحظ الضرب العفوي بين أيام 7 و 10. إذا لم يكن لوحظ الضرب خلال هذا الوقت، فإنه يشير إلى عادة ضعف كفاءة التمايز. لا يمكن أن تستمر على البروتوكول حتى يوم 15 في محاولة لمراقبة الضرب، ولكن إذا لوحظ أي ضرب من قبل يوم 15 فمن الأفضل أن الواحدالفن تمايز جديد.
    3. (يوم 12-24، التمايز يوم 8-20) كل يوم، وإزالة وسائل الإعلام التمايز القديمة واستبدالها مع 2 مل من جديد RPMI وسائل الإعلام التمايز الثاني في البئر للسماح نضوج الخلايا وتنظيم أحادي الطبقة الضرب (الشكل 1F، فيديو الشكل 1 ).
      ملاحظة: اعتمادا على موت الخلايا المتبقية، قد يكون من الضروري لشطف مع 1 مل من DMEM / F12 خلال يوم التمايز 10.

3. (يوم 24 التفاضل يوم 20) عزل من القلب Myocytes والخلايا الليفية مثل

  1. فصل الخلايا من أحادي الطبقة
    1. إزالة وسائل الاعلام التمايز وشطف مرة واحدة مع 1 مل برنامج تلفزيوني.
    2. يفرق بين الطبقات الوحيدة مع 1 مل من محلول التفكك الأنزيمي (0.04٪ التربسين / 0.03٪ EDTA) إلى كل بئر.
    3. نقل لوحة في الحاضنة لمدة 10 دقيقة. وفي الوقت نفسه، إضافة 12 ميكرولتر من مثبط ROCK إلى 6 مل من محلول التربسين التعادل.
    4. Gentlذ إضافة 1 مل من محلول التربسين تحييد تحتوي على مثبط ROCK إلى كل بئر من لوحة لتحييد حل التربسين.
    5. باستخدام الماصة نقل معقمة، مزيج بلطف كل بئر لتحطيم مجموعات الخلايا.
    6. نقل كل 12 مل من لوحة 6 جيدا لأنبوب الطرد المركزي 15 مل.
      ملاحظة: نظرا لاستخدام لوحين 6 جيدا في هذا البروتوكول، وسوف تكون هناك حاجة إلى أنبوبين 15 مل.
    7. نقل 3 مل من برنامج تلفزيوني إلى جانب واحد من لوحة، ومن ثم نقل بالتسلسل نفس 3 مل إلى كل بئر لاحقة لجمع أي الخلايا المتبقية على طبق. نقل ما تبقى من 3 مل من المباراة النهائية بشكل جيد في نفس أنبوب الطرد المركزي 15 مل تحتوي على خلايا.
    8. بيليه في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد الخلايا لفرز خلايا الحية من قبل نظام مراقبة الأصول الميدانية
    1. إعداد عازلة تلطيخ بإضافة 5 مل من مصل بقري جنيني إلى 45 مل من برنامج تلفزيوني على الجليد مع 50 ميكرولتر من مثبط ROCK.
    2. إزالة طاف من ااا خليةأبلاغ (في 3.1.8) و resuspend في 1.2 مل من العازلة تلطيخ.
    3. نقل 200 ميكرولتر من تعليق خلية ل، قبل المبردة، 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة على الجليد. وستكون هذه السيطرة تلطيخ السلبية.
    4. نقل ما تبقى من 1 مل من خلية إلى تعليق لذلك، قبل المبردة، 50 مل أنبوب الطرد المركزي الجديدة على الجليد وإضافة 2 ميكرولتر SIRPα-PE / Cy7 (1: 500 تمييع) و 4 ميكرولتر من CD90-FITC (1: 250 تمييع) . المزيج بلطف تعليق الخلية مع الماصة نقل والعودة إلى الجليد.
    5. احتضان كل من سيطرة السلبية وعينة، على شاكر الروك، على الجليد، في 4 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. إعداد أنابيب جمع العينات عن طريق إضافة 3 مل من وسائل الاعلام RPMI (مع الأنسولين) لمدة 15 مل أنابيب الطرد المركزي. إضافة 3 ميكرولتر من مثبط ROCK إلى كل أنبوب وتخزينها على الجليد.
    7. بيليه الخلايا الملون في 300 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية وشطف مرتين مع 10 مل على الأقل من الجليد الباردة برنامج تلفزيوني في الشطف.
    8. إضافة 1 ميكرولتر من دابي (1 ميكروغرام / مل) إلى 5 مل من العازلة تلطيخ. بلطفresuspend الكرية عينة مع 1-3 مل من عازلة تلطيخ التي تحتوي على دابي باستخدام الماصة نقل.
    9. إضافة 500 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (مع إضافة أي دابي) إلى سيطرة سلبية.
    10. تصفية بلطف كل من سيطرة السلبية وعينة من خلال مصفاة 40 ميكرومتر خلية لإزالة كتل من الخلايا ونقل إلى البوليسترين أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية على الجليد. تحقيق على الفور العينات إلى فارز الخلية.
    11. تشبه الخلية الحية إنشاء طرق فرز 18، استخدم سيطرة سلبية لضبط البوابات، حدد الخلايا الحية (دابي السلبية) وجمع كل من FITC + (أي CD90 + الخلايا الليفية) وPE / Cy7 + (أي SIRPα + العضلية ) ظل السكان بشكل مستقل في 20 رطل (الشكل 2).
      ملاحظة: بعد وضع البوابات، ويمكن أن تكون ثابتة سيطرة سلبية في 4٪ PFA لتحديد كفاءة التمايز من تلطيخ للالقلب تروبونين-T.
      ملاحظة: بعض الباحثين يفضلون استخدامisotype السيطرة بدلا من سيطرة غير ملوثين لضبط البوابات من أجل التعويض عن الأجسام المضادة غير محددة ملزمة. عنصر تحكم ما يسمى مضان ناقص واحد (FMO) هي احتمال آخر. بسبب التوزيع ذات النسقين واضح للFITC، دابي وإشارات PE-Cy7، نحن بوابات من السكان الإيجابي بهدف متحفظ بعيدا في بوابة الإيجابية، التي ربما تستبعد بعض الإيجابيات الحقيقية ولكن يساعد على تقليل أي ايجابيات كاذبة.
  3. إعادة تجميع خلية في التحضير للهندسة الأنسجة
    1. بعد الفرز الخلية، بيليه كلا أنابيب جمع وresuspend في 1 مل من DMEM تحتوي على 10٪ حديثي الولادة المصل البقري، 1٪ البنسلين ستربتومايسين و 0.2٪ الامفوتريسين ( "وسائل الاعلام مصلحة الدولة للاحصاء").
    2. إعادة تجميع SIRPα + وCD90 + الخلايا في نسبة 3: 1 و لوحة الخلايا مجتمعة في الثقافة غير الأنسجة تعامل طبق بتري في مناطق ذات كثافة من 2 مليون خلية لكل 60 سم 2 (صحن 10 سم). إضافة 10 مل من وسائل الاعلام مصلحة الدولة للاحصاء و 101؛ لتر من ROCK المانع Y-27632.
    3. ضع تعليق خلية في نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 48 ساعة للسماح إعادة تجميع الخلية إلى مجموعات صغيرة.

4. قلب الإنسان هندسة الأنسجة

  1. افتعال مفاعل حيوي متعدد الأنسجة
    ملاحظة: لاستكمال الرسوم التوضيحية في الشكل 3A، متوفرة عند الطلب من المؤلفين ملفات CAD مع الخطط تصميم مفاعل حيوي مفصل.
    1. آلة القالب الرئيسي PDMS من خلال حفر ستة ثقوب متباعدة بشكل متساو من قطر 0.5 ملم في متوازي المستطيلات 9 × 33 س 3.25 ملم من تترافلوروإيثيلين.
    2. باستخدام endmill، آلة إطار من متعدد السلفون قياس 25 × 35 × 11 مم 3. والغرض من هذا الإطار هو أن تتولى المناصب PDMS (شيدت من الزهر الواردة أعلاه) في المواءمة مع الآبار في اللوح الأساس.
    3. باستخدام endmill 1 ملم، آلة 6 آبار (6 × 1 × 1 مم 3)، 4 مم وبصرف النظر إلى قطعة 20 × 40 × 5 مم 3 من بولي الأسودtetrafluoroethylene لتشكيل اللوح الأساس.
    4. مزيج القاعدة المرنة وكيل علاج ل(PDMS) ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان في 10: 1 ث / ث نسبة وإضافة إلى تترافلوروإيثيلين مخصصة العفن (الخطوة 4.1.1) لإنشاء صفين من ست وظائف قوة الاستشعار، واحتضان بين عشية وضحاها، وتحت فراغ في 80 درجة مئوية. بعد المعالجة، وإزالة بلطف PDMS من القالب الرئيسي ووضع علامة بعناية قمم كل وظيفة مع علامة دائمة سوداء لتعزيز التباين والآلية في الوقت الحقيقي تتبع آخر انحراف.
      ملاحظة: بوليتيترافلوريثيليني لينة نوعا ما ويمكن أن تتلف بسهولة. استخدام الحذر عند تنظيف القالب الرئيسي قبل PDMS الصب لضمان طول العمر للنظام ومتسقة آخر PDMS الهندسة. سلك 0.5 مم يمكن استخدامها لتنظيف فتحات للوظائف بعد كل استخدام، ولكن الحرص على عدم كشط داخل الثقوب.
      ملاحظة: بديل هو ديغا في PDMS تحت فراغ لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة، ثم السماح للشفاء الخليط في الضغط المحيط.وهذا قد يؤدي إلى عدد أقل من فقاعات الغاز المتبقية تشكيل في PDMS أثناء عملية المعالجة.
    5. تعقيم جميع مكونات في الأوتوكلاف بخار.
      ملاحظة: قالب PDMS سيد (الخطوة 4.1.1) والإطار متعدد السلفون (الخطوة 4.1.2) على حد سواء ويمكن إعادة استخدامها. الوظائف PDMS التي تم إنشاؤها من المدلى بها (الخطوة 4.1.4) هي أيضا قابلة لإعادة الاستخدام ولكن فقط لنحو 10 الاستخدامات. ومع ذلك، المزيد من المشاركات PDMS يمكن أن تنشأ حسب الحاجة باستخدام القالب الرئيسي.
  2. جمع الخلايا قمنا بإعادة تجميع القلب
    1. إزالة الخلايا قمنا بإعادة تجميع من الحاضنة ونقل كل 10 مل من وسائل الاعلام إعادة تجميع لأنبوب الطرد المركزي 50 مل.
    2. شطف لوحة مع 3 مل من برنامج تلفزيوني ونقل شطف إلى نفس 50 مل أنبوب الطرد المركزي التي تحتوي على وسائل الإعلام إعادة تجميع.
    3. إضافة 3 مل من 0.04٪ التربسين / 0.03٪ EDTA إلى صحن 10 سم والعودة إلى الحاضنة لمدة 5 دقائق.
    4. بعد 5 دقائق، ودراسة اللوحة مع مجهر مركب مقلوب في التكبير 10x لضمان dissocia خلية كاملةنشوئها من الطبق. إذا لا تزال تعلق بعض الكتل المتبقية، تستنهض الهمم بلطف لوحة لفصل كتل. إذا ظلت مجموعات المرفقة، والعودة إلى الحاضنة لمدة 2-3 دقائق أخرى. لا احتضان أطول من عشر دقائق أو موت الخلية كبيرا قد تحدث.
    5. مرة واحدة يتم فصل كل الخلايا، إضافة 3 مل من محلول التربسين التعادل. المزيج بلطف الحل تحييد مع الحل التربسين خلية ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي 50 مل تحتوي على وسائل الإعلام إعادة تجميع وشطف مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني.
    6. شطف طبق كامل مع 5 مل من برنامج تلفزيوني ونقل إلى نفس أنبوب 50 مل تحتوي على خلايا.
    7. بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    8. إزالة طاف و resuspend بيليه في 1 مل من وسائل الاعلام مصلحة الدولة للاحصاء، ثم نقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    9. بيليه في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف. خلايا القلب (CD90 + انسجة الخلايا وSIRPα + myocytes) جاهزة الآن لبناء الأنسجة.
  3. (اختياري) جمع خلايا خلفية الاهتمام
    ملاحظة: بالإضافة إلى الأنسجة محددة تحتوي فقط SIRPα + العضلية وCD90 + خلايا تشبه الخلايا الليفية، فمن الممكن إضافة خلايا إضافية من الاهتمام لاستجواب تأثيرها على وظيفة الأنسجة. على سبيل المثال وقد ثبت اللجان الدائمة الفئران لتعزيز وظيفة من الفئران المهندسة أنسجة القلب 1. الخطوة الاختيارية التالية يصف مجموعة من الخلايا تكميلية لنظام محدد.
    1. جمع نوع من الخلايا التكميلي لمصلحة (على سبيل المثال، الخلايا الجذعية الوسيطة) باستخدام 0.25٪ التربسين / EDTA 0.1٪.
    2. بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم resuspend في 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية المناسب لنوع من الخلايا في المصالح. على سبيل المثال، عن اللجان الدائمة، استخدم DMEM تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني، 1٪ البنسلين ستربتومايسين و 0.2٪ أمفوتيريسين-B لثقافة جملتعلمي اللغة اإلنكليزية.
    3. إجراء تعداد خلايا باستخدام عدادة الكريات، ثم بيليه الخلايا مرة أخرى في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة طاف، resuspend في 1 مل من وسائل الإعلام ثقافة الخلية ونقل إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
    5. بيليه الخلايا في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. إزالة طاف. الخلايا تكميلية هي الآن جاهزة لبناء الأنسجة.
      ملاحظة: إذا تم إضافة خلايا إضافية عند تركيز 10٪ من إجمالي عدد الخلايا في الأنسجة، ثم لأنسجة محددة، وهذا يتطلب 50،000 خلايا إضافية في الأنسجة كما في كل الأنسجة تحتوي على 500،000 خلايا القلب (كل من خلايا انسجة CD90 + وmyocytes SIRPα +).
  4. إنشاء المهندسة القلب الأنسجة البشرية
    ملاحظة: قم بتخزين كافة الحلول على الجليد والخلايا في درجة حرارة الغرفة. كافة وحدات التخزين المدرجة أدناه هي في الأنسجة. عادة، ما يقرب من ستة الأنسجة يمكن بناؤها من اثنين 6 جيدا ررآتش من التفرقة في القلب.
    1. تمييع 60.0 ميكرولتر من 5 ملغ / مل الأسهم الكولاجين إلى 3.125 ملغ / مل مع 1.5 ميكرولتر من 1 M هيدروكسيد الصوديوم، 9.6 ميكرولتر من 10X برنامج تلفزيوني و 24.9 ميكرولتر من عالى النقاء الماء المعقم منزوع الأيونات.
      خطوة حاسمة: تجنب إدخال فقاعات الهواء إلى كل حل خلال التحضير لها فقاعات الهواء سوف يعطل تشكيل النسيج السليم.
    2. إضافة 12.0 ميكرولتر من كل من 10X MEM و 0.2 N HEPES الرقم الهيدروجيني 9 إلى خليط مخفف الكولاجين لخلق مزيج الكولاجين. إضافة كل الحلول أسفل الجانب من أنبوب الطرد المركزي 15 مل من أجل تجنب إدخال فقاعات الهواء في مزيج الكولاجين.
    3. إضافة مصفوفة الغشاء القاعدي إلى تركيز النهائي من 0.9 ملغ / مل إلى مزيج الكولاجين وتخزينها على الجليد لخلق مزيج النسيج النهائي. يجب أن يكون تركيز النهائي من الكولاجين 2 ملغ / مل.
    4. إضافة 500،000 الخلايا قمنا بإعادة تجميع لمزيج النسيج (العضلية + تركيز الخلايا الليفية هي 20 مليون / مل)، وملء إلى الحجم النهائي من 25 ميكرولتر فيالأنسجة مع أي خالية من الخلايا وسائل الإعلام مصلحة الدولة للاحصاء أو 50،000 خلايا نوع من الخلايا التكميلي لمصلحة (على سبيل المثال، hMSCs) وتخلط جيدا لتشكيل حتى تعليق خلية.
      ملاحظة: إن عدد الخلايا تستكمل تختلف من لمختلف التطبيقات. هنا يستخدم 10٪ التكميلية.
    5. مع الرعاية، والماصة 25 ميكرولتر من تعليق خلية في كل من الآبار الستة في اللوح الأساس مفاعل حيوي، دون إدخال فقاعات الهواء إلى البئر.
    6. دفع صفين من أجهزة الاستشعار قوة PDMS على جانبي الإطار متعدد السلفون، وتشكيل 6 أزواج من المشاركات معارضة، ثم قلب الإطار على أعلى اللوح الأساس بحيث زوج واحد من المشاركات يدخل تحتوي كل منها على جانب تعليق الخلية.
      ملاحظة: يتضمن الإطار متعدد السلفون علامات التبويب للمساعدة في محاذاة PDMS.
    7. وضع بعناية مفاعل حيوي، اللوح الأساس إلى أسفل، في طبق 60 ملم، ثم ضع الطبق بدون غطاء في الداخل من صحن 10 سم، ووضع غطاء 10 سم على القمة، ونقل التجمع مفاعل حيوي كامل فيإلى الحاضنة زراعة الأنسجة، والانتظار ساعتين لالأنسجة إلى هلام.
    8. بعد 2 ساعة، وإزالة مفاعل حيوي من الحاضنة وإضافة 14 مل من وسائل الاعلام مصلحة الدولة للاحصاء الى الجمعية العامة بأكمله، بما يكفي لتغطية اللوح الأساس. العودة إلى الحاضنة، وتغيير نصف وسائل الإعلام كل يوم.
    9. وبعد ثمانية وأربعين ساعة، وإزالة بعناية اللوح الأساس عن طريق تحريك بلطف كل جانب من اللوح الأساس خارج إطار بضعة ملليمترات في وقت واحد، تغيير وسائل الإعلام، ثم العودة مفاعل حيوي والأنسجة لأسفل، إلى وسائل الإعلام.
    10. مواصلة تغيير نصف وسائل الإعلام ثقافة مصلحة الدولة للاحصاء كل يوم.
      ملاحظة: تقلصات عفوية من الأنسجة يمكن ملاحظتها في أقرب وقت بعد 3 أيام بناء الأنسجة، توليد القوى نشل قابلة للقياس في وقت مبكر من يوم 5-7.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

للحصول على myocytes القلب، يتم استخدام نسخة معدلة قليلا من الطرق التمايز Boheler وليان 30،31. ومن الضروري أن التمايز يبدأ خلال المرحلة سجل نمو الخلايا، ولكن أيضا أن سكان البداية هي متكدسة بما فيه الكفاية للحصول على رقم صالحة للاستعمال من الخلايا بعد الفرز (ما يقرب من 75٪ هو الأمثل). عادة، لH7 hESCs، والطلاء في مناطق ذات كثافة من 140،000 hESCs لكل بئر من صحن 6 جيدا في الأساسية 8 وسائل الإعلام و 5٪ CO 2 حاضنة الحفاظ على 37 درجة مئوية ينتج الثقافات متكدسة بما في...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

بناء الأنسجة تعريف الإنسان المهندسة القلب (كان الحاخام هيشت) يمكن أن تقدم نموذجا أكثر اتساقا وموثوق بها وظيفة العضلية القلبية الإنسان. الأهم من ذلك، جميع المكونات الخلوية وخارج الخلية في نظام معروفة ويمكن التلاعب بها كما هو مطلوب، وبالتالي إزالة تأثير الخلط من أنواع الخلايا غير معروفة أخرى ناجمة عن عملية التمايز. لتحقيق التوازن بين النمو السريع للخلايا وعالية الغلة، فمن الأفضل أن التمايز يبدأ في 75٪ التقاء hESCs، من الناحية المثالية بعد أربعة أيام من الطلاء. بالإضافة إلى ذلك، فإن ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (1F30HL118923-01A1) إلى TJC، المعاهد الوطنية للصحة / NHLBI PEN عقد HHSN268201000045C إلى KDC، المجلس منحة بحثية من هونغ كونغ TRS T13-706 / 11 (KDC)، المعاهد الوطنية للصحة (R01 HL113499) إلى BDG، أمريكا جمعية القلب (12PRE12060254) إلى الملكية الأردنية، ومجلس منحة بحثية من هونج كونج (TBRS، T13-706 / 11) وقدم إلى RL تمويل إضافي لTJC من المعاهد الوطنية للصحة DRB 5T32GM008553-18 ونتيجة لتدريب على التدريب NIDCR متعدد التخصصات في أنظمة والتنموية علم الأحياء والعيوب الخلقية T32HD075735. يرغب المؤلفون أيضا عن تقديره وامتنانه آرثر Autz في مركز زان من كلية مدينة نيويورك للحصول على المساعدة مع بالقطع مفاعل حيوي وممدوح الدالى للحصول على المساعدة الفنية. كما نشكر الدكتور كينيث Boheler لتقديم المشورة بشأن التمايز القلب، والدكتور جوشوا هير لتوفير بسخاء الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
<قوي>ثقافة الخلايا<قوي>الشركة<قوي>رقم الكتالوجComments
amphotericin BSigma-AldrichA2411قم بإعداد مخزون 2.5 ملغم/مل في DMSO وتعقيم
B27 باستخدام InsulinLife Technologies17505055
B27 بدون الأنسولينA1895601Life Technologies
CHIR99021Stemgent04-0004Create 6 & mu ؛ مخزون M ، ثم aliquot وتخزينه في -20   ؛ درجة مئوية.
أساسيات 8 تقنيات وسائطالحياةA1517001
H7 الخلايا الجذعية الجنينية البشريةWiCellWA07
hESC المصفوفة المؤهلة ، Corning MatrigelCorning354277ذوبان الجليد على الجليد عند 4 درجات ؛ C بين عشية وضحاها ثم aliquot 150 & mu; ل في أنابيب منفصلة وتخزينها في -20 & nbsp ؛ درجة مئوية.
IWR-1Sigma-AldrichI0161قم بإنشاء مخزون 10 ملي وكمية كبيرة. يخزن في -20 درجة ؛ C
تقنيات مصل العجل حديثي الولادة16010159
كاشف التفكك غير الأنزيمي: تقنيات الخلايا الجذعية كاشف تفكك الخلايا اللطيفة7174
البنسلين الستربتومايسينCorning30-002-CI
RPMI 1640Life Technologies11875-093احتفظ بالتبريد
Y-27632 (مثبط ROCK)Stemgent04-0012إعادة التعليق إلى تركيز مخزون 10 ملي مولار ، وتخزينها عند -20 & nbsp ؛ °C. تجنب دورات الذوبان التجميدية.
<قوي>فرز الخلايا<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride (DAPI)LifeTechnologiesD1306
CD90-FITCBioLegend328107
كاشف التفكك الأنزيمي: مجموعة فصل الخلية I (0.04٪ التربسين / 0.03٪ EDTA ، محلول تحييد التربسين ومحلول الملح المخزن في Hanks)   ؛PromoCellC-41200
مصل الأبقار الجنينيAtlanta BiologicsS11250
SIRP & alpha / Cy7BioLegend323807
Tissue Construction < / strong > Company < / strong > Catalog Number < / strong > Comments < / strong>
0.25٪ Trypsin / 0.1٪ EDTAفيشر ساينتفيك25-053-CIاختياري: لجمع الخلايا التكميلية ذات الأهمية
10x MEMSigma-AldrichM0275-100ML
10x PBS PacketsSigma-AldrichP3813
الكولاجين ، Bovine Type ILife TechnologiesA10644-01Keep on ice
DMEM / F12Life Technologies11330057
دولبيكو s النسور المعدلة المتوسطة (DMEM) ، عالية الجلوكوزسيجما ألدريتشD5648
بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) داوكورنينجسيلجارد 184
الصوديوم HEPESسيجما ألدريتشH3784
هيدروكسيد الصوديومسيجما ألدريتش221465
<قوي > المواد < / قوي >< قوي > الشركة < / قوي >< قوي>رقم الكتالوج< / قوي><قوي>تعليقات< / قوي>
1.5 مل أنابيب الطرد المركزيالدقيقة فيشر ساينتفيكNC0536757
15 مل أنبوب طرد مركزي بولي برويلينكورنينج352096
5 مل من البوليسترين أنبوب دائريالقاع Corning352235مع 35 & mu متكامل ؛ مصفاة خلية M
50 مل أنبوب طرد مركزي بولي برويلينCorning352070
معالجة بثقافة الأنسجة ذات 6 آبارخلية 353046
Corning ، Biologix70-2180
PolysulfoneMcMaster-Carr
Polytetrafluoroethylene (تفلون)ماكماستر كار
<قوي>المعدات<قوي>الشركة رقم الكتالوجتعليقات
تشريح المجهرأوليمبوسSZ-61أو ما شابه ذلك، يجب أن يكون لديك حامل للكاميرا عالية السرعة لإرفاق
نظام السرعة الكهربائيةAstro-Med، IncGrass S88X Stimulator
High Speed الكاميراPixelinkPL-B741Uأو ما شابه ذلك ، ولكن يجب أن تكون قادرة على 100 إطار في الثانية للحصول على البيانات بدقة
التحكم في درجة حرارةاللوحة تستخدم للحفاظ على درجة حرارة الوسائط أثناء تجميع البيانات.
<مواد قوية > مخصصة < / قوية >< قوية > شركة < / قوية >< قوية > رقم الكتالوج < / strong > Comments < / strong>
LabView برنامج التتبعاللاحق متاح عند الطلب من المؤلفين
لوحة مكشطة

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Serrao, G. W., et al. Myocyte-depleted engineered cardiac tissues support therapeutic potential of mesenchymal stem cells. Tissue Eng. Part A. 18 (13-14), 1322-1333 (2012).
  2. Hansen, A., et al. Development of a drug screening platform based on engineered heart tissue. Circ. Res. 107 (1), 35-44 (2010).
  3. Fink, C., Ergün, S., Kralisch, D., Remmers, U., Weil, J., Eschenhagen, T. Chronic stretch of engineered heart tissue induces hypertrophy and functional improvement. FASEB J. 14 (5), 669-679 (2000).
  4. Yildirim, Y., et al. Development of a biological ventricular assist device: preliminary data from a small animal model. Circulation. 116, Suppl 11. 16-23 (2007).
  5. Sekine, H., et al. Cardiac Cell Sheet Transplantation Improves Damaged Heart Function via Superior Cell Survival in Comparison with Dissociated Cell Injection. Tissue Eng. Part A. 17 (23-24), 2973-2980 (2011).
  6. Lesman, A., et al. Transplantation of a tissue-engineered human vascularized cardiac muscle. Tissue Eng. Part A. 16 (1), 115-125 (2010).
  7. Turnbull, I. C., et al. Advancing functional engineered cardiac tissues toward a preclinical model of human myocardium. FASEB J. 28 (2), 644-654 (2014).
  8. Thavandiran, N., Dubois, N., et al. Design and formulation of functional pluripotent stem cell-derived cardiac microtissues. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 110 (49), 4698-4707 (2013).
  9. Schaaf, S., et al. Human engineered heart tissue as a versatile tool in basic research and preclinical toxicology. PloS One. 6 (10), e26397(2011).
  10. Tulloch, N. L., et al. Growth of engineered human myocardium with mechanical loading and vascular coculture. Circ. Res. 109 (1), 47-59 (2011).
  11. Nunes, S. S., et al. Biowire: a platform for maturation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Nature Methods. 10 (8), 781-787 (2013).
  12. Ma, Z., et al. Three-dimensional filamentous human diseased cardiac tissue model. Biomaterials. 35 (5), 1367-1377 (2014).
  13. Baker, B. M., Chen, C. S. Deconstructing the third dimension: how 3D culture microenvironments alter cellular cues. J. Cell Sci. 125 (13), 3015-3024 (2012).
  14. Pontes Soares, C., Midlej, V., de Oliveira, M. E. W., Benchimol, M., Costa, M. L., Mermelstein, C. 2D and 3D-organized cardiac cells shows differences in cellular morphology, adhesion junctions, presence of myofibrils and protein expression. PloS One. 7 (5), e38147(2012).
  15. Burridge, P. W., Keller, G., Gold, J. D., Wu, J. C. Production of De Novo Cardiomyocytes: Human Pluripotent Stem Cell Differentiation and Direct Reprogramming. Cell Stem Cell. 10 (1), 16-28 (2012).
  16. Mummery, C. L., Zhang, J., Ng, E. S., Elliott, D. A., Elefanty, A. G., Kamp, T. J. Differentiation of human embryonic stem cells and induced pluripotent stem cells to cardiomyocytes: a methods overview. Circ. Res. 111 (3), 344-358 (2012).
  17. Kim, C., et al. Non-cardiomyocytes influence the electrophysiological maturation of human embryonic stem cell-derived cardiomyocytes during differentiation. Stem Cells Dev. 19 (6), 783-795 (2010).
  18. Dubois, N. C., et al. SIRPA is a specific cell-surface marker for isolating cardiomyocytes derived from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnol. 29 (11), 1011-1018 (2011).
  19. Hudon-David, F., Bouzeghrane, F., Couture, P., Thibault, G. Thy-1 expression by cardiac fibroblasts: lack of association with myofibroblast contractile markers. J. Mol. Cell. Cardiol. 42 (5), 991-1000 (2007).
  20. Gago-Lopez, N., et al. THY-1 receptor expression differentiates cardiosphere-derived cells with divergent cardiogenic differentiation potential. Stem Cell Reports. 2 (5), 576-591 (2014).
  21. Hare, J. M., Traverse, J. H., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled, dose-escalation study of intravenous adult human mesenchymal stem cells (prochymal) after acute myocardial infarction. J. Am. Coll. Cardiol. 54 (24), 2277-2286 (2009).
  22. Bolli, R., et al. Cardiac stem cells in patients with ischaemic cardiomyopathy (SCIPIO): initial results of a randomised phase 1 trial. Lancet. 378 (9806), 1847-1857 (2011).
  23. Wollert, K. C., et al. Intracoronary autologous bone-marrow cell transfer after myocardial infarction: the BOOST randomised controlled clinical trial. Lancet. 364 (9429), 141-148 (2004).
  24. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of autologous mononuclear bone marrow cells or peripheral mononuclear blood cells after primary percutaneous coronary intervention: rationale and design of the HEBE trial--a prospective, multicenter, randomized trial. Am. Heart. J. 152 (3), 434-441 (2006).
  25. Jeevanantham, V., Butler, M., Saad, A., Abdel-Latif, A., Zuba-Surma, E. K., Dawn, B. Adult bone marrow cell therapy improves survival and induces long-term improvement in cardiac parameters: a systematic review and meta-analysis. Circulation. 126 (5), 551-568 (2012).
  26. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: 5-year follow-up from the randomized-controlled BOOST trial. Eur. Heart J. 30 (24), 2978-2984 (2009).
  27. Meyer, G. P., et al. Intracoronary bone marrow cell transfer after myocardial infarction: eighteen months' follow-up data from the randomized, controlled BOOST (BOne marrOw transfer to enhance ST-elevation infarct regeneration) trial. Circulation. 113 (10), 1287-1294 (2006).
  28. Hirsch, A., et al. Intracoronary infusion of mononuclear cells from bone marrow or peripheral blood compared with standard therapy in patients after acute myocardial infarction treated by primary percutaneous coronary intervention: results of the randomized controlled HEBE trial. Eur. Heart J. 32 (14), 1736-1747 (2011).
  29. Simari, R. D., et al. Bone marrow mononuclear cell therapy for acute myocardial infarction: a perspective from the cardiovascular cell therapy research network. Circ. Res. 114 (10), 1564-1568 (2014).
  30. Bhattacharya, S., et al. High efficiency differentiation of human pluripotent stem cells to cardiomyocytes and characterization by flow cytometry. J. Vis. Exp. (91), e52010(2014).
  31. Lian, X., et al. Robust cardiomyocyte differentiation from human pluripotent stem cells via temporal modulation of canonical Wnt signaling. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (27), 1848-1857 (2012).
  32. Burridge, P. W., et al. A universal system for highly efficient cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells that eliminates interline variability. PloS One. 6 (4), e18293(2011).
  33. Kean, T. J., Lin, P., Caplan, A. I., Dennis, J. E. MSCs: Delivery Routes and Engraftment, Cell-Targeting Strategies, and Immune Modulation. Stem Cells Int. , 732742(2013).
  34. Trachtenberg, B., et al. Rationale and design of the Transendocardial Injection of Autologous Human Cells (bone marrow or mesenchymal) in Chronic Ischemic Left Ventricular Dysfunction and Heart Failure Secondary to Myocardial Infarction (TAC-HFT) trial: A randomized, double-blind, placebo-controlled study of safety and efficacy. Am. Heart J. 161 (3), 487-493 (2011).
  35. Williams, A. R., et al. Intramyocardial stem cell injection in patients with ischemic cardiomyopathy: functional recovery and reverse remodeling. Circ. Res. 108 (7), 792-796 (2011).
  36. Razeghi, P., Young, M. E., Alcorn, J. L., Moravec, C. S., Frazier, O. H., Taegtmeyer, H. Metabolic gene expression in fetal and failing human heart. Circulation. 104 (24), 2923-2931 (2001).
  37. Rajabi, M., Kassiotis, C., Razeghi, P., Taegtmeyer, H. Return to the fetal gene program protects the stressed heart: a strong hypothesis. Heart Fail. Rev. 12 (3-4), 331-343 (2007).
  38. Taegtmeyer, H., Sen, S., Vela, D. Return to the fetal gene program: a suggested metabolic link to gene expression in the heart. Ann. N. Y. Acad. Sci. 1188, 191-198 (2010).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Human Engineered Cardiac TissueLive Cell SortingSIRP Alpha MarkerCD90 Fibroblast MarkerCollagen Based MatrixBioreactor SystemMesenchymal Stem CellsContractile Force MeasurementTissue CompactionFACS Collection

Related Articles