يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الجانبي جذر النظام محرض في

13.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53481

⸱

يناير 14, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Systems Biology, VIB, Ghent, 2Department of Plant Biotechnology and Bioinformatics, Ghent University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

يسمح النظام المحفز للجذر الجانبي (LRIS) بالحث المتزامن للجذور الجانبية ويتم تقديمه ل نبات الأرابيدوبسيس الثاليانا والذرة.

الملخص

يساهم تطور الجذر الجانبي بشكل كبير في نظام الجذر ، وبالتالي فهو ضروري لنمو النبات. ومع ذلك ، فإن دراسة بدء الجذر الجانبي مملة ، لأنها تحدث فقط في عدد قليل من الخلايا داخل الجذر وبطريقة لا يمكن التنبؤ بها. للتحايل على هذه المشكلة ، تم تطوير نظام محفز للجذر الجانبي (LRIS). من خلال معالجة الشتلات على التوالي باستخدام مثبط نقل الأوكسين والأوكسين الاصطناعي ، يحدث بدء الجذر الجانبي الذي يتم التحكم فيه بشكل كبير بشكل متزامن في الجذر الأساسي ، مما يسمح بأخذ عينات وفيرة من مرحلة النمو المرغوبة. تم تطوير LRIS لأول مرة من أجل نبات الأرابيدوبسيس الثاليانا ، ولكن يمكن تطبيقه على النباتات الأخرى أيضا. وفقا لذلك ، تم تكييفه للاستخدام في الذرة (Zea mays). يتم تقديم نظرة عامة مفصلة على الخطوات المختلفة ل LRIS في كلا المصنعين. أتاح الجمع بين هذا النظام والنسخ المقارنة تحديد المتماثلات الوظيفية لجينات بدء الجذر الجانبي نبات الأرابيدوبسيس في الأنواع الأخرى كما هو موضح هنا ل CYCLIN B1. 1 (CYCB1; 1) جين دورة الخلية في الذرة. أخيرا ، تتم مناقشة المبادئ التي يجب أخذها في الاعتبار عند تطوير LRIS لأنواع نباتية أخرى.

المقدمة

نظام الجذر هو أمر حاسم لنمو النبات، لأنه يضمن مرسى وامتصاص الماء والمواد المغذية من التربة. لأن التوسع في نظام الجذر يعتمد بشكل رئيسي على إنتاج الجذور الجانبية، وقد درست على نطاق واسع شروعهما والتشكيل. وبدأت الجذور الجانبية في مجموعة فرعية معينة من الخلايا محيط بالدائرة، تسمى خلايا مؤسس 1. في معظم dicots، مثل نبات الأرابيدوبسيس thaliana، وتقع هذه الخلايا في القطبين protoxylem 2، في حين أنه في ذوات الفلقة مثل الذرة، وجدوا في القطبين اللحاء 3. وتتميز الخلايا مؤسس بزيادة استجابة أوكسين 4، تليها التعبير عن الجينات دورة الخلية محددة (على سبيل المثال، السيكلين B1، 1 / CYCB1؛ 1)، وبعد ذلك الخضوع لجولة أولى من الانقسامات احديدابي غير المتماثلة 5. بعد سلسلة من الانقسامات احديدابي وpericlinal منسقة، وشكلت منشم الجذر الوحشي التي في النهاية سوف تظهر بوصفها أحدالجذر الوحشي utonomous. موقع وتوقيت الجانبي بدء الجذر ولكن لا يمكن التنبؤ به، لأن هذه الأحداث ليست وفيرة ولا متزامنة. هذا يعوق استخدام نهج الجزيئية مثل transcriptomics لدراسة هذه العملية.

لمعالجة هذا، وقد وضعت جانبي جذر النظام محرض (LRIS) 6، 7، وفي هذا النظام، يتم التعامل مع الشتلات الأولى مع N حامض -1-naphthylphthalamic (NPA)، الذي يثبط النقل أوكسين وتراكم، وبالتالي عرقلة الجانبي بدء الجذر 8. عن طريق نقل في وقت لاحق الشتلات والمتوسطة التي تحتوي على أوكسين الاصطناعية حامض الخليك 1-النفتالين (NAA)، تستجيب الطبقة محيط بالدائرة بأكملها إلى مستويات مرتفعة مما أوكسين بكثافة حمل الجانبية الجذر بدء انقسامات الخلية 6. على هذا النحو، فإن هذا النظام يؤدي إلى سريعة ومتزامنة وشاملة جذور التلقين الجانبية، مما يسمح للمجموعة سهلة من عينات الجذر المخصب لمرحلة محددة في وقت متأخرالتنمية الجذرية راؤول. وفي وقت لاحق، هذه العينات يمكن استخدامها لتحديد ملامح التعبير الجينوم على نطاق خلال تشكيل الجذر الوحشي. قد تسفر عن LRIS معرفة كبيرة بالفعل عن بدء الجانبي الجذرية في نبات الأرابيدوبسيس والذرة 13/09، ولكن الحاجة إلى تطبيق هذا النظام على الأنواع النباتية الأخرى يصبح أكثر وضوحا كما هي التسلسل المزيد من الجينوم، وهناك اهتمام متزايد لنقل المعرفة إلى أهمية اقتصادية الأنواع.

هنا، يتم إعطاء البروتوكولات مفصلة للنبات الأرابيدوبسيس والذرة LRISs. بعد ذلك، يتم توفير مثال على استخدام النظام، من خلال توضيح كيف يمكن استخدام البيانات transcriptomics المكتسبة من LRIS الذرة لتحديد homologs الوظيفية التي لها وظيفة الحفظ أثناء بدء الجذر الوحشي عبر الأنواع النباتية المختلفة. وأخيرا، مبادئ توجيهية لتحسين LRIS ليقترح الأنواع النباتية الأخرى.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. نبات الأرابيدوبسيس بروتوكول LRIS

ملاحظة: يشير النص إلى "الصغيرة" أو "كبيرة" التجارب على نطاق و. التجارب الصغيرة، مثل تحليل خط علامة وتلطيخ النسيجي 6، 14، لا يتطلب سوى بضع عينات. تجارب على نطاق واسع، مثل الكمي في الوقت الحقيقي QRT-PCR، المصفوفات الدقيقة 11/09 أو RNA تسلسل، تتطلب قدرا أكبر من العينات. على هذا النحو، مبلغ ~ 1000 شتلة لكل عينة تم استخدامها من قبل Vanneste وآخرون. 11 لأداء تجربة ميكروأري بعد الجزء الجذر تشريح.

اليوم 1

  1. تعقيم بذور نبات الأرابيدوبسيس
    ملاحظة: يتم اختيار أحد الإجراءات التالية لتعقيم البذور. أي منهم هو مناسبة للخطوات القادمة من البروتوكول. التعقيم الغاز (1.1.2) ويعرض اثنين من المزايا الرئيسية على التعقيم السائل (1.1.1): يستغرق وقتا أقل عند التعامل مع خدر كبيرإيه من البذور، لأنه لا pipetting لأن تحدث لعينات فردية؛ والبذور المعقمة يمكن تخزينها لفترة أطول. ومع ذلك، فإنه يتطلب المجفف ومعالجة متأنية.
    1. التعقيم السائل
      1. صب العدد المطلوب من البذور في أنابيب صغيرة أجهزة الطرد المركزي. استخدام ما يصل إلى 20 ملغ (~ 800 البذور) في أنبوب 1.5 مل أو 40 ملغ (~ 1600 البذور) في 2 مل أنابيب متناهية الصغر الطرد المركزي.
      2. إضافة 1 مل من الايثانول 70٪. عكس أو تهزه برفق لمدة 2 دقيقة.
      3. استبدال الإيثانول 70٪ مع 1 مل من محلول التعقيم لمدة 15 دقيقة. (يعد حل التعقيم العذبة: 3.85 مل هيبوكلوريت الصوديوم (NaOCl) الأسهم (12٪) (تنبيه: استخدام غطاء الدخان)، 5 ميكرولتر توين 20، وتصل إلى 10 مل بالماء عكس أنابيب عدة مرات للتأكد من أن جميع البذور تأتي. في اتصال مع الحل.
      4. في الطباقي مجلس الوزراء تدفق الهواء، واستبدال الحل التعقيم مع 1 مل من الماء المقطر المعقم وشطف البذور 5 مرات لمدة 5 دقائق بواسطة المتكررةلاي استبدال مع 1 مل من الماء المقطر المعقم النقي.
    2. التعقيم الغاز
      1. صب العدد المطلوب من البذور في 2 مل أنبوب الصغرى الطرد المركزي. استخدام أنابيب الفردية عند العمل مع العديد من خطوط المستقلة، وترتيبها افتتح في مربع أنابيب الطرد المركزي الصغيرة من البلاستيك أو حامل. وإذا كان عدد البذور في أنبوب واحد يتجاوز 500 (12.5 ملغ)، تقسيم البذور في العدد المناسب من الأنابيب لضمان التعقيم ناجحة. تأكد من أن أغطية أنابيب المجاورة لا تغطي بعضها البعض. تناسب معا غطاء مربع في الجزء السفلي، كما يجب أن يكون في المجفف فضلا عن التعقيم.
      2. وضع مربع في وعاء من مجفف، جنبا إلى جنب مع كوب من الزجاج (تنبيه: استخدام غطاء الدخان).
      3. ملء كوب مع 100 مل من 12٪ NaOCl (تنبيه: استخدام غطاء الدخان). وضع غطاء على مجفف، ولكن ترك فتحة صغيرة حيث يتم وضع الكأس.
      4. إضافة 3 مل من حمض الهيدروكلوريك 37٪ (دخن) (CAUTION: استخدام غطاء الدخان) إلى كوب من خلال فتحة صغيرة وبسرعة إغلاق المجفف. إرادة فقاعة حل لبعض الوقت بسبب الكلور 2 -gas تشكيل. ترك النظام أغلقت O / N (أو على الأقل 8 ساعة).
      5. إزالة غطاء المجفف. واخراج مربع وتغطية ذلك مع غطاء لتجنب التلوث أثناء النقل.
      6. وضع مربع في الطباقي مجلس الوزراء تدفق الهواء، وإزالة الغطاء وترك البذور لمدة 1 ساعة على RT للسماح إطلاق الغاز.
        ملاحظة: بذور يمكن تخزينها بأمان الجافة في أنابيب صغيرة أجهزة الطرد المركزي مغلقة لمدة تصل إلى 2 أسابيع في 4 درجات مئوية.
  2. الحث الجذر الوحشي في نبات الأرابيدوبسيس
    1. الوحشي الجذر تثبيط (NPA العلاج)
      1. إعداد متوسط ​​النمو للنمو في المختبر. المتوسط ​​يحتوي على نصف قوة Murashige وسكوغ مزيج من الملح 15، 0.1 غرام / L-ميو اينوزيتول، 10 ز / L السكروز، ويتم تخزينها مؤقتا مع 0.5ز / L 2- (N-morpholino) حمض ethanesulfonic (MES).
      2. ضبط درجة الحموضة إلى 5.7 مع 1 M KOH. إضافة 8 غرام / لتر من الأنسجة النباتية وأجار الأوتوكلاف متوسطة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة 121 مئوية.
      3. إعداد 25 ملي حل الأوراق المالية من NPA في dimethylsulfoxide (DMSO) (تنبيه: استخدام القفازات). في الطباقي مجلس الوزراء تدفق الهواء، تبريد متوسطة تعقيمها وصولا الى حوالي 65 درجة مئوية (وهي درجة الحرارة التي الزجاجة يمكن عقد باليد)، وإضافة 25 ملي NPA حل الأسهم للحصول على التركيز النهائي من 10 ميكرومتر NPA.
      4. التجانس على إضافة عن طريق هز بلطف الزجاجة لمدة 10 ثانية. صب 50 مل من المتوسط ​​في طبق بتري مربع (12 سم × 12 سم).
        ملاحظة: في حالة التجربة على نطاق واسع، وتطبيق شبكة من النايلون (20 ميكرون) لضمان سهولة نقل. إعداد شبكة (9 سم × 9 سم) لالتعقيم (الشكل 1A). عندما تعقيمها، وتطبيق شبكة لمتوسط ​​النمو باستخدام ملاقط معقمة (الشكل 1B). دفع بلطف شبكة لمتوسط ​​النمو باستخدام الظريفrilized drigalsky للتأكد من أنها على اتصال جيد مع النمو المتوسطة (الشكل 1B) (تنبيه: العمل في ظروف معقمة).
      5. زرع بذور على NPA-لوحات.
        ملاحظة: في حال تم التخطيط تجربة على نطاق واسع، وزرع 2 صفوف كثيفة ومتماشية بشكل جيد من 50 البذور لتسهيل أخذ العينات (انظر 1.2.2.3).
        1. في حالة التعقيم السائل، وزرع بذور على NPA لوحات باستخدام الماصة 200 ميكرولتر. قطع 3-4 ملم من نهاية نصائح pipetting لفي ظروف معقمة (أو قبل التعقيم من النصائح) من أجل أن تكون قادرة على الماصة البذور. الماصة صعودا وهبوطا عدة مرات لاعادة تعليق البذور، ثم الماصة للمياه حوالي 150 ميكرولتر العقيمة مع 10-20 البذور والانتظار حتى الرواسب البذور في الجزء السفلي من غيض. (تنبيه: العمل في ظروف معقمة)
          ملاحظة: عندما لمس أجار أو شبكة بلطف مع طرف، سيتم الافراج عن قطرة ماء مع بذرة منه (الشكل 1C).
        2. في حالة التعقيم الغاز، وزرع بذور باستخدام تعقيمها toothpicks.Pinch مسواك في آغار قبل اتخاذ بذور لضمان السطح لزجة. التقط واحدة البذور من جانب واحد باستخدام مسواك وتوزيع البذور على لوحات (1D الشكل). بدلا من ذلك، إضافة الماء المعقم للبذور، وزرع كما هو موضح في 1.2.1.5.1 (تنبيه: العمل في ظروف معقمة).
      6. ختم لوحات مع شريط لاصق للتنفس وتخزينها لوحات في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 2 أيام على الأقل وأقصى مدة أسبوع واحد. وهناك حاجة لهذا التقسيم ويضمن تزامن وإنبات أكثر كفاءة.
        ملاحظة: بدلا من ذلك، والبذور يمكن طبقية قبل البذر، مغمورة في الماء المقطر في أنابيب صغيرة أجهزة الطرد المركزي، الأمر الذي يتطلب أقل مساحة الثلاجة. في هذه الحالة، تخزين الأنابيب لمدة أسبوع واحد على الأقل في 4 درجات مئوية، ونقل لوحات لمجلس الوزراء نمو فورا بعد البذر (انظر 1.2.1.7).
        DAY 3
      7. نقل لوحات لمجلس الوزراء النمو (ضوء مستمر (110 μE م -2 ث -1)، 21 ° C) لمدة 5 أيام (2 أيام من الإنبات و3 أيام من النمو) في وضع عمودي تقريبا (80-90 درجة) لضمان نمو الجذور على، وليس في المتوسط.
        DAY 8
    2. الوحشي الجذر التعريفي (NAA العلاج)
      1. إعداد نفس متوسط ​​النمو كما هو موضح في 1.2.1.1 و1.2.1.2. إعداد 50 ملي حل الأوراق المالية من NAA في DMSO (تنبيه: استخدام القفازات). تبريد متوسطة تعقيمها وصولا الى 65 درجة مئوية وإضافة حل NAA إلى وسيلة للحصول على تركيز النهائي من 10 ميكرومتر NAA (تنبيه: العمل في ظروف معقمة).
        1. التجانس على إضافة عن طريق هز بلطف الزجاجة لمدة 10 ثانية. صب 50 مل من المتوسط ​​في طبق بتري مربع (12 سم × 12 سم).
      2. نقل الشتلات من لوحات تحتوي على المتوسط ​​النمو تستكمل مع 10 ميكرومتر NPA لتلك سوبplemented مع 10 ميكرومتر NAA.
        1. ربط أحضان ملاقط منحنية تحت النبتات من الشتلات وإزالة برفق من اللوحة. نقل الشتلات فقط منها جذور نمت تماما في اتصال مع وسيلة NPA-النمو ويفضل أن يكون أسفل.
        2. المقشود الجذرية على النمو المتوسطة سطح المحتوية على NAA على مسافة صغيرة. تأكد من أن جذور النباتات على اتصال جيد مع النمو المتوسطة. إذا لزم الأمر، اضغط على الجذر برفق على سطح النمو المتوسطة مع ملاقط.
          ملاحظة: في حالة وجود تجربة على نطاق واسع، وإزالة جميع الشتلات التي ليست على اتصال مع شبكة ونقل برفع شبكة على اثنين من الزوايا العليا مع ملاقط. تأكد من أن شبكة على اتصال جيد مع المتوسطة التي تحتوي على NAA القشط شبكة على سطح أجار على بعد مسافة صغيرة (الشكل 1E).
      3. ختم لوحات جديدة مع الشريط تنفس ووضعها في خزانة النمو (يخدعضوء tinuous (110 μE م -2 ث -1)، 21 ° C) في وضع عمودي للمرة المطلوب بعد تحريض حتى أخذ العينات.
        ملاحظة: في حالة وجود تجربة على نطاق واسع، واستخدام مشرط لقطع شرائح الجذر في كل مرة مباشرة على شبكة وأخذ عينات منها عن طريق كشط بلطف على سطح شبكة.

2. LRIS بروتوكول الذرة

  1. الطبقات من الذرة الألباب
    1. احتضان حبات الذرة في 4 درجات مئوية في الظلام لمدة 1 أسبوع على الأقل.
      ملاحظة: لقد تم تطوير هذا البروتوكول باستخدام السلالة النقية الذرة B73.
  2. تعقيم الذرة الألباب
    اليوم 1
    ملاحظة: على الرغم من شتلات الذرة لا يجب أن تزرع في ظروف معقمة، فمن المستحسن لتعقيم حبات الذرة والعمل مع مواد معقمة لمنع نمو الفطريات في لفة ورقنظام.
    1. وضع العدد اللازم من حبات الذرة في كوب زجاجي معقم.
    2. إضافة 100 مل من محلول التعقيم (6٪ NaOCl في الماء) (تنبيه: استخدام غطاء الدخان).
    3. إضافة شريط مغناطيسي ووضع الكأس على محرك مغناطيسي في انخفاض سرعة التحريك (ما يقرب من 250 دورة في الدقيقة) في RT لمدة 5 دقائق.
    4. شطف خمس مرات لمدة 5 دقائق عن طريق استبدال الحل مع 100 مل من الماء المعقم النقي.
  3. زرع الذرة الألباب
    1. وضعت على قفازات للحد من مخاطر التلوث، واتخاذ لفة من المناشف الورقية.
    2. تمزيق اثنين تمتد من ناحية منشفة ورقية يبلغ طولها الإجمالي من ورقتين (حوالي 92 سم × 24 سم) ووضعها فوق بعضها البعض على سطح نظيف (الشكل 2A).
    3. طي صحائف مضاعفة على طول (حوالي 92 سم x 12 سم) (الشكل 2A).
    4. استخدام ملاقط لتوزيع 10 حبات في حوالي 2 سم من أعلى أنحاء ركان طول الورقة، مع إبقاء فرجة بين شيئين من 8 سم بين كل نواة و8 سم مجانا عند كلا الطرفين (الشكل 2B). تأكد يواجه الجذير من النواة إلى أسفل ونحو الورقة (الشكل 2B).
    5. لفة بلطف ورقة على طول، مع الحفاظ على البذور في مكان (الشكل 2B). لتسهيل المتداول، وهو اختياري للرش أول ورقة مع الماء المعقم.
    6. وضع لفافات ورق في أنابيب زجاجية معقمة من حوالي 6 سم وقطرها 14 سم ارتفاع (على سبيل المثال، 250 مل أنابيب الطرد المركزي) ووضعها في الرف (الشكل 2C).
  4. الحث الجذر الوحشي في الذرة
    1. إعداد 50 ملي NPA حل سهم (الذائبة في DMSO) (تنبيه: استخدام القفازات).
    2. لكل أنبوب، وجعل 50 ميكرومتر NPA حل عن طريق إضافة 125 ميكرولتر من ملي NPA حل سهم 50-125 مل من الماء المعقم في دورق زجاجي معقم.
    3. تخلط جيدا وصب 125 مل من NPA حل 50 ميكرومتر على ورقة لفة في أنبوب. سوف لفة ورق امتصاص الحل وأصبحت غارقة تماما.
      ملاحظة: عند استخدام لفافات ورق وأنابيب مع الأبعاد الأخرى، وضبط حجم وفقا لذلك. السائل ينبغي أن تصل إلى منتصف الطريق في أنبوب لضمان امتصاص كافية.
    4. وضع نظام لفة ورقة في خزانة النمو لمدة ثلاثة أيام (27 ° C، وعلى ضوء مستمر، والرطوبة النسبية 70٪). تأكد من أن لفافات ورق لا تزال غارقة بإضافة إضافي 50 ميكرومتر NPA الحل، لأن الحل يتبخر مع مرور الوقت (الشكل 2D).
      DAY 4
    5. إعداد 50 ملي NAA حل سهم (الذائبة في DMSO) (تنبيه: استخدام القفازات).
    6. لكل أنبوب، يعد حل NAA 50 ميكرومتر وذلك بإضافة 125 ميكرولتر من المخزون 50 ملي NAA إلى 125 مل من الماء المعقم في دورق زجاجي معقم.
    7. الضغط بلطف من أكثر من الحل NPA المتبقية من لفافات ورق ووضعم في الماء المعقم لمدة 5 دقائق لغسل بها (تنبيه: استخدام القفازات). الضغط بلطف على معظم المياه من لفافات ورق. كرر هذه الخطوة غسل ثلاث مرات.
    8. تخلط جيدا وتصب في حل NAA 50 ميكرومتر على لفافات ورق في الأنابيب. تأكد من أنها غارقة تماما.
    9. وضع نظام لفة الورق في مجلس الوزراء نمو (27 ° C، وعلى ضوء مستمر، والرطوبة النسبية 70٪) لمدة المطلوب بعد تحريض.
  5. الحث الجذر الوحشي في جذور عرضية ولي الذرة
    ملاحظة: LRIS كما هو موضح أعلاه يدفع الجذور الجانبية في الجذر الرئيسي. ومع ذلك، في الذرة وmonocotyledons أخرى، والجذر الرئيسي والجذور الأصيلة الجنينية، جنبا إلى جنب مع جذورهم الجانبية، هي مهمة بشكل أساسي خلال الشتلات التنمية. في مرحلة لاحقة في نمو النبات، تنشأ جذور عرضية بعد الجنينية على الجذع وأيضا تطوير الجذور الجانبية لتشكيل نظام الجذر الجديد 16. وLRIS يمكن أيضا أن يكون استخدامد للحث على الجذور الجانبية على هذه الجذور تاج عرضية بعد الجنينية من خلال اتباع بعض التعديلات الطفيفة على LRIS على الجذر الرئيسي الجنينية.
    1. لجعل لفات الورق، وإنشاء شطيرة من الأوراق على التوالي مع طبقتين من ناحية منشفة ورقية على الجانب الخارجي، وطبقتين من الورق إنبات الداخل. ضع حبات تعقيمها (انظر الخطوات 2،1-2،2) بين اثنين من ورقة من الورق الإنبات. ورقة إنبات، بالمقارنة مع منشفة ورقية جهة، ويكونون أقل عرضة للأن يخترق جذور الشعر والجذور الجانبية، الأمر الذي سيجعل من فتح ورقة لفات أسهل في وقت لاحق. من ناحية أخرى، سوف طبقتين الخارجية من ناحية منشفة ورقية تسهيل امتصاص السائل.
    2. إدراج القوائم في 700 مل أنابيب زجاجية ويصب الماء المعقم دون NPA عليها. تأكد من أنها غارقة تماما.
    3. تنبت بذور معقمة في مجلس الوزراء النمو (راجع الخطوة 2.4.9).
    4. زراعة الشتلات حتى جذور عرضية التاجتبدأ في الظهور (6 أيام لB73). تأكد من إبقاء فات الورق الرطب في جميع الأوقات وذلك بإضافة الماء المعقم عند الضرورة.
    5. نقل إلى حل 25 ميكرومتر NPA لمدة 4 أيام (انظر الخطوات 2.4.1 إلى 2.4.4)، تليها تحريض مماثل من جانبي بدء الجذر بالاستعاضة عن حل NPA مع حل NAA 50 ميكرومتر بعد خطوة الغسيل (راجع الخطوة 2.4 0.5 إلى 2.4.9).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تطبيق LRIS إلى تنفيذ Transcriptomics المقارن من الجانبي عملية الجذر بدء

تطبيق واحد من LRIS هو المقارنة والربط بين ملامح التعبير الجيني خلال تشكيل الجذر الوحشي في الأنواع المختلفة. نهج transcriptomics المقارنة خلق إمكانية لتحديد orthologous الجينات المشاركة في عملية التنمية الجذرية الجانبية في الأنواع المختلفة. بدء الجذر الوحشي، الذ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في بروتوكول نبات الأرابيدوبسيس LRIS، فمن المهم فقط لنقل الشتلات التي نمت بشكل كامل في اتصال مع متوسط ​​النمو NPA التي تحتوي على. هذا يضمن أن يتم حظر الجانبي بدء الجذر على طول الجذر بأكمله. من أجل منع إصابة شتلات أثناء النقل، أحضان ملقط المنحنية يمكن أن يكون مدمن مخدرات تحت النبتات من الشتلات. عند نقله، تأكد من أن جذور الشتلات على اتصال كاف مع المتوسط ​​أجار التي تحتوي على NAA. ويمكن تحقيق ذلك عن طريق القشط الجذرية على سطح أجار على بعد مسافة صغيرة. وهذا يضمن لمحة تعريفية م...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

يشكر المؤلفون ديفي أوبديناكر على المساعدة الفنية والتصوير الفوتوغرافي. نشكر كثيرا الدكتور بليس على اقتراحاته المفيدة لتحسين المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من قبل برنامج أعمدة الجذب بين الجامعات IUAP P7 / 29 'MARS' من المكتب الفيدرالي البلجيكي لسياسة العلوم ، من قبل FWO grant G027313N ووكالة الابتكار عن طريق العلوم والتكنولوجيا ، IWT (IR).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>ARABIDOPSIS LRIS< / strong>
Seeds< / بذور نبات
النمط البيئي Col-0
الأنابيب الدقيقة 3810X ، أنابيب الطرد المركزي الدقيقة النظيفة PCR
2 ملSIGMA-ALDRICH0030 120.094الطرد المركزي الدقيقة Eppendorf Safe-Lock
حمض الهيدروكلوريكMerck KGaA1،003،171،00037٪ (الدخين) لتحليل EMSURE ACS ، ISO ، REAG. مجفف الزجاج Ph Eu
SIGMA-ALDRICHPyrex
دورق
بلاستيكي أنبوب الطرد المركزي الصغير صندوق أو حامل
<قوي> تعقيم التبييض للبذور < / قوي >
الإيثانولChem-Lab nvCL00.0505.1000الإيثانول ، ABS. 100٪ a.r. مخفف إلى 70٪
هيبوكلوريت الصوديوم (NaOCl) كارلروث9062.312٪
توين 20SIGMA-ALDRICHP1379
ماء
<قوي > متوسط النمو < / قوي >
Murashige وخليط ملح SkoogDUCHEFA Biochemie BV.M0221-0050
ميو إينوزيتولSIGMA-ALDRICHI5125-100G
2- (N-مورفولينو) حمض الإيثان سلفونيك (MES)DUCHEFA Biochemie BVM1503.0100
السكروزVWR ، Internation LLC27483.294D (+) - السكروز Ph. اليورو.
KOHMerck KGaA1050211000للتحليل (بحد أقصى 0.002٪ Na) EMSURE ACS ، ISO ، REAG. Ph Eur
لثقافة الأنسجة النباتية AgarLabM LimitedMC029
<قوي > كيميائي تحريض الجذر الجانبي < / قوي >
N-1-حمض النفثيل الفثلاميك (NPA)DUCHEFA Biochemie BVرقم N0926.025010 & micro; M (أرابيدوبسيس)
1-حمض الخليك النفثالين (NAA)دوشيفا بيوكيميمي بي في.رقم N0903.005010 & micro; M (نبات الأرابيدوبسيس)
ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SIGMA-ALDRICH494429-1L
<قوي>صنع شبكة للنقل< / قوية>
شبكة نايلونProsep bybaشبكة نايلون اصطناعية 20 & مايكرو ؛ م
< قوي > بذر ومناولة الشتلات < / ألواح طبق بتري قوية >
مربعةGOSSELINBP124-0512 × 12 سم
50 مل أنابيب DURANSIGMA-ALDRICHCLS430304Corning & nbsp ؛ 50 مل أنابيب الطرد المركزي
drigalskiCarl RothK732.1
ماصة
قطع أطراف ماصةDaslab162001XUniversal 200 ، قطع 5 مم من الطرف قبل التعقيم
بشريط تنفس   ؛3M Deutschland GmbHcat. رقم 1530-1
ملاقطFiers nv / saK342.1 ؛ K344.1ملاقط دومون من النوع أ رقم 5 ؛ ملاقط دومون نوع e nr 7
ظروف النمو< / قوي >
غرفةالنمو 21 درجة ؛ ج ، الضوء
المستمر < قوي > المواد < / قوي >< قوي > الشركة < / قوي ><قوي>كتالوج < / قوي >< قوي > تعليقات < قوي >
< قوي > الذرة LRIS < / قوي >
< قوي >البذور < / قوي >
حباتB-73
<قوي> التبييض التعقيم من الحبوب < / قوي >
دورق
زجاجي النمام المغناطيسي   ؛Fiers nv / saC267.1
هيبوكلوريت الصوديوم (NaOCl)كارل روث9062.312٪
ماء
معقم <قوي > كيميائي تحريض جذر جانبي < / قوي >
N-1-حمض النفثيل فثلاميك (NPA)DUCHEFA Biochemie BVرقم N0926.025050 & micro; م (جذر الذرة الأولي) ، 25 & الصغر ؛ M (جذر عرضي للذرة)
1-حمض الخليك النفثالين (NAA)DUCHEFA Biochemie B.V.رقم N0903.005050 & M (الذرة) ثنائي
ميثيل سلفوكسيد (DMSO)SIGMA-ALDRICH494429-1L
<قوي > بذر ومناولة الشتلات < / مناشف يد ورقية
مناشف يد كيمبرلي كلارك بروفيشنال *6681SCOTT مناشف يدوية - لفة / أبيض ؛ حجم الورقة (24 × 46 سم)
ورق إنبات البذورشركة مرساة الورق10 × 15 38 # ورق إنبات البذور
ملاقطFiers nv / saK342.1 ؛ K344.1ملاقط دومون من النوع أ رقم 5 ؛ ملاقط دومون من النوع e nr 7
250 مل (أجهزة الطرد المركزي) أنابيبSCHOTT DURAN2160136قطرها حوالي 5.6 سم وارتفاع 14.7 سم ؛
أنابيب 700 ملDURAN GROUP213994609اسطوانات ، أنبوب قدم دائري ، D 60 & nbsp ؛ × 250
رفلأنابيب الذرة ،
مياه
محلية الصنع <قوي > ظروف النمو < / خزانة قوية >
النمو27 درجة ؛ C ، ضوء مستمر ، رطوبة نسبية 70٪
الأرابيدوبسيس القوية> <قوي> تعقيم الغاز للبذور< أنابيب الطرد المركزي القوية >الدقيقة 1.5 مل SIGMA-ALDRICH 0030 125.215 Eppendorf أنابيب زجاجي معقمكريات الذرة قوية > معقمة

المراجع

  1. Van Norman, J. M., Xuan, W., Beeckman, T., Benfey, P. N. To branch or not to branch: the role of pre-patterning in lateral root formation. Development. 140, 4301-4310 (2013).
  2. Dolan, L., et al. Cellular organisation of the Arabidopsis thaliana root. Development. 119, 71-84 (1993).
  3. Bell, J. K., McCully, M. E. A histological study of lateral root initiation and development in Zea mays. Protoplasma. 70, 179-205 (1970).
  4. Benkova, E., et al. Local, efflux-dependent auxin gradients as a common module for plant organ formation. Cell. 115, 591-602 (2003).
  5. Beeckman, T., Burssens, S., Inzé, D. The peri-cell-cycle in Arabidopsis. J. Exp. Bot. 52, 403-411 (2001).
  6. Himanen, K., Boucheron, E., Vanneste, S., de Almeida Engler, J., Inzé, D., Beeckman, T. Auxin-mediated cell cycle activation during early lateral root initiation. Plant Cell. 14, 2339-2351 (2002).
  7. Jansen, L., Parizot, B., Beeckman, T. Inducible system for lateral roots in Arabidopsis thaliana and maize. Methods Mol Biol. 959, 149-158 (2013).
  8. Casimiro, I., et al. Auxin transport promotes Arabidopsis lateral root initiation. Plant Cell. 13, 843-852 (2001).
  9. Himanen, K., et al. Transcript profiling of early lateral root initiation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 101, 5146-5151 (2004).
  10. De Smet, I., et al. Receptor-like kinase ACR4 restricts formative cell divisions in the Arabidopsis root. Science. 322, 594-597 (2008).
  11. Vanneste, S., et al. Cell cycle progression in the pericycle is not sufficient for SOLITARY ROOT/IAA14-mediated lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Plant Cell. 17, 3035-3050 (2005).
  12. De Rybel, B., et al. A role for the root cap in root branching revealed by the non-auxin probe naxillin. Nat. Chem. Biol. 8, 798-805 (2012).
  13. Jansen, L., et al. Comparative transcriptomics as a tool for the identification of root branching genes in maize. Plant Biotechnol. J. 11, 1092-1102 (2013).
  14. Parizot, B., et al. Diarch symmetry of the vascular bundle in Arabidopsis root encompasses the pericycle and is reflected in distich lateral root initiation. Plant Physiol. 146, 140-148 (2008).
  15. Murashige, T., Skoog, F. A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15, 473-497 (1962).
  16. Bellini, C., Pacurar, D. I., Perrone, I. Adventitious roots and lateral roots: similarities and differences. Annu Rev Plant Biol. 65, 639-666 (2014).
  17. Grunewald, W., Parizot, B., Inzé, D., Gheysen, G., Beeckman, T. Developmental biology of roots: One common pathway for all angiosperms? Int. J. Plant Dev. Biol. 1, 212-225 (2007).
  18. Parizot, B., Beeckman, T. Genomics of root development. Root Genomics and Soil Interactions. Crespi, M. , 3-28 (2012).
  19. Bargmann, B. O., Birnbaum, K. D. Fluorescence activated cell sorting of plant protoplasts. Journal of visualized experiments : JoVE. , (2010).
  20. Nakazono, M., Qiu, F., Borsuk, L. A., Schnable, P. S. Laser-capture microdissection, a tool for the global analysis of gene expression in specific plant cell types: identification of genes expressed differentially in epidermal cells or vascular tissues of maize. Plant Cell. 15, 583-596 (2003).
  21. Ludwig, Y., Hochholdinger, F. Laser microdissection of plant cells. Methods Mol Biol. 1080, 249-258 (2014).
  22. Beeckman, T., Engler, G. An easy technique for the clearing of histochemically stained plant tissue. Plant Mol. Biol. Rep. 12, 37-42 (1994).
  23. Ditengou, F. A., et al. Mechanical induction of lateral root initiation in Arabidopsis thaliana. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 105, 18818-18823 (2008).
  24. Lucas, M., Godin, C., Jay-Allemand, C., Laplaze, L. Auxin fluxes in the root apex co-regulate gravitropism and lateral root initiation. J. Exp. Bot. 59, 55-66 (2008).
  25. Wang, S., Taketa, S., Ichii, M., Xu, L., Xia, K., Zhou, X. Lateral root formation in rice (Oryza Sativa. L.): differential effects of indole-3-acetic acid and indole-3-butyric acid. Plant Growth Regul. 41, 41-47 (2003).
  26. Martinez-de la Cruz, E., Garcia-Ramirez, E., Vazquez-Ramos, J. M., Reyes de la Cruz, H., Lopez-Bucio, J. Auxins differentially regulate root system architecture and cell cycle protein levels in maize seedlings. J Plant Physiol. 176, 147-156 (2015).
  27. Beyer, E. M., Morgan, P. W. Effect of ethylene on uptake, distribution, and metabolism of indoleacetic acid-1-14C and -2-14C and naphthaleneacetic acid-1-14C. Plant Physiol. 46, 157-162 (1970).
  28. Delbarre, A., Muller, P., Imhoff, V., Guern, J. Comparison of mechanisms controlling uptake and accumulation of 2,4-dichlorophenoxy acetic acid, naphthalene-1-acetic acid, and indole-3-acetic acid in suspension-cultured tobacco cells. Planta. 198, 532-541 (1996).
  29. Bailey-Serres, J. Microgenomics: genome-scale, cell-specific monitoring of multiple gene regulation tiers. Annu Rev Plant Biol. 64, 293-325 (2013).
  30. Perez-Torres, C. A., et al. Phosphate availability alters lateral root development in Arabidopsis by modulating auxin sensitivity via a mechanism involving the TIR1 auxin receptor. Plant Cell. 20, 3258-3272 (2008).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Arabidopsis thaliana Zea mays NPA NAA CYCB1 1
الجانبي جذر النظام محرض في
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.