يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نمذجة خطوات المبكر عن سرطان المبيض نشر في الثقافة عضوي النمط من البريتوني تجويف الإنسان

26.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53541

⸱

ديسمبر 31, 2015

 ,  ,  , 
1Department of Obstetrics and Gynecology, Section of Gynecologic Oncology, University of Chicago

في هذه المقالة

ملخص

هنا ، نقدم بروتوكولا لبناء نموذج ثلاثي الأبعاد في المختبر لبطانة التجويف البريتوني ، يتكون من خلايا الظهارة المتوسطة البشرية الأولية والخلايا الليفية ذات طبقات من مصفوفة خارج الخلية ، كأداة للتحقيق في التصاق خلايا سرطان المبيض وغزوها وتكاثرها.

الملخص

يختلف نمط ورم خبيث لسرطان المبيض بشكل ملحوظ عن نمط معظم الأورام الظهارية الأخرى ، لأنه نادرا ما ينتشر بشكل دموي. بدلا من ذلك ، يتم نقل خلايا سرطان المبيض المقشرة من الورم الأولي بواسطة السائل البريتوني إلى المواقع النقيلية داخل التجويف البريتوني. هذه المواقع ، وأبرزها الصفاق البطني والثرب ، هي أعضاء مغطاة بسطح مبطن بالسوثريوم. للتحقيق في عمليات انتشار سرطان المبيض ، قمنا بتجميع نظام ثقافة معقد ثلاثي الأبعاد يعيد بناء بطانة التجويف البريتوني في المختبر. تم عزل الخلايا الليفية البشرية الأولية والخلايا المتوسطة من الثرب البشري. ثم تم خلط الخلايا الليفية مع مصفوفة خارج الخلية ومغطاة بطبقة من الخلايا الظهارية المتوسطة البشرية الأولية لتقليد الأسطح البريتونية والعقلية التي تواجهها خلايا سرطان المبيض النقيلية. يستخدم نموذج النمط العضوي الناتج ، كما هو موضح ، لفحص الخطوات المبكرة لانتشار سرطان المبيض ، بما في ذلك التصاق الخلايا السرطانية والغزو والانتشار. تم استخدام هذا النموذج في عدد من الدراسات للتحقيق في دور البيئة المكروية (الخلوية والعصوية) في انتشار سرطان المبيض في وقت مبكر. كما تم تكييفه بنجاح مع الفحص عالي الإنتاجية واستخدامه لتحديد واختبار مثبطات ورم خبيث لسرطان المبيض.

المقدمة

سرطان المبيض هو أكثر الأورام الخبيثة فتكا1. يتم تشخيص غالبية المرضى بعد انتشار السرطان في جميع أنحاء التجويف البريتوني. بمجرد انتشار السرطان في جميع أنحاء التجويف البريتوني ، غالبا ما لا تكون الجراحة المختزلة للخلايا والعلاج الكيميائي علاجا كافيا لمنع تكرار السرطان ومقاومته الكيميائية ، مما يؤدي إلى معدل بقاء أقل من 30٪ لمدة 5 سنوات. يقتصر ورم خبيث سرطان المبيض في الغالب على التجويف البريتوني ، والعديد من أنواع السرطان الأخرى ، بما في ذلك سرطان المعدة والبنكرياس والقولون ، تنتقل إلى نفس المواقع التشريحية في التجويف البريتوني. بشكل عام ، تنفصل خلايا سرطان المبيض عن السرطان الموضعي في قناة فالوب أو ورم المبيض الأولي ، وتنتقل في السائل البريتوني كخلايا مفردة أو كروية ، وتلتصق بالأسطح المبطنة بالسوثريوم في الثرب والأمعاء وجدار البطن2.

تلعب البيئة المكروية للورم دورا مهما في تطور المرض والمقاومة الكيميائية في العديد من أنواع السرطان3-6. التجويف البريتوني هو بيئة مكروية فريدة من نوعها ، مع طبقة أحادية للخلية المتوسطة تغطي غالبية الأسطح (الشكل 1 أ) 7. تعمل البطانة المتوسطة كحاجز يخلق سطحا منخفض الاحتكاك ، والذي يميل إلى أن يكون واقيا من التصاق الخلاياالسرطانية 8. يوجد أسفل هذا السطح المبطن بالظهارة المتوسطة مباشرة طبقة مصنوعة في الغالب من الخلايا الليفية والمصفوفة خارج الخلية (ECM) ، والتي تعزز التصاق الخلايا السرطانيةوغزوها 8. تفرز خلايا سرطان المبيض العوامل التي تحفز تغييرات في بطانة الخلايا الظهارية المتوسطة التي تعزز التصاق خلايا سرطان المبيض والغزو والورم الخبيث9،10. تلتصق خلايا سرطان المبيض بسطح الظهارة المتوسطة عبر آليات الإنتجرين و CD44 بوساطة (الشكل 1 ب) 11-16.

تاريخيا ، تم تطوير العديد من النماذج ثلاثية الأبعاد للتحقيق في تفاعلات سرطان المبيض مع البيئة المكروية. درست بعض النماذج الأولى واجهة سرطان المبيض وECM17-21 ، أو اتصال سرطان المبيض والخلايا المتوسطة13،14،21-24 ، أو كليهما25 (تمت مراجعته من قبلنا 26). Niedbala et al. اكتشف أن خلايا سرطان المبيض تظهر التصاق أسرع وأكثر ثباتا ب ECM من الخلايا المتوسطة أو البلاستيك وحده25. ومع ذلك ، فإن هذه النماذج لا تشبه من الناحية النسيجية البيئة المكروية البريتونية. لذلك ، أنشأنا نموذجا عضويا ثلاثي الأبعاد لتكرار البيئة المكروية لسرطان المبيض بشكل أكثر شمولا. من أجل فهم دور البيئة المكروية والتفاعل بين السرطان والخلايا البريتونية في الانتشار البريتوني لسرطان المبيض بشكل أفضل ، قمنا بتطوير نموذج ثقافة عضوي ثلاثي الأبعاد في المختبر لبطانة التجويف البريتوني (تخطيطي في الشكل 1C). يتكون النموذج المقترح من الخلايا الليفية البشرية الأولية و ECM ، مغطاة بطبقة من الخلايا الظهارية المتوسطة البشرية الأولية - يتم عزل كل نوع من الخلايا عن الثرب البشري. من الناحية النسيجية ، يشبه هذا النموذج البطانة البريتونية أو العقلية الطبيعية ، ويوفر سطحا يمكننا من خلاله دراسة البيئة المكروية للورم ، والتفاعل بين الخلايا السرطانية والأنسجة الطبيعية ، وعمليات التصاق الخلايا السرطانية وغزوهاوتكاثرها 8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وقد تم استعراض جميع بروتوكولات البحوث التي وصفها جامعة شيكاغو المؤسسي مجلس مراجعة (IRB). تم الحصول على الموافقة المسبقة من كل مريض قبل الجراحة وتمت الموافقة على الدراسة من جامعة شيكاغو IRB. A السلامة البيولوجية نوع مجلس الوزراء (2) وقفازات وينبغي أن تستخدم عند التعامل مع الأنسجة البشرية للحماية والحد من مخاطر تلوث الخلايا.

1. العزلة والثقافة من خلايا انسجة هو دون تغيير الابتدائية

  1. جمع الأنسجة البشرية والتحضير.
    1. الحصول على عينات من الثرب البشري، 2 سم 3، وإزالتها خلال عملية جراحية في البطن، وتزج الأنسجة فورا في RT الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) (الشكل 2A). قطعة من الثرب 3 سم × 2 سم وعادة ما ينتج 1000000 الخلايا الأولية الإنسان الظهارية (HPMC) و 200،000 الخلايا الليفية الإنسان الأساسية أو الخلايا الليفية الثرب العادية (NOF).
    2. تدور باستمرار PBS كانت مغمورة الأنسجة في عند 0.5 x ج لمدة 3دقيقة في أقرب وقت ممكن بعد جمع (<2 ساعة في PBS) ونقل الأنسجة لالطازج 20 مل PBS في 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. تقطيع الأنسجة في 5MM 3 قطع من قبل تنميق مع المشارط في 15 سم القطر، صحن الثقافة العقيمة (الشكل 2B).
  2. الأولية الخلية الظهارية الإنسان العزلة 8
    1. عزل HPMC، ونقل الأنسجة المفروم إلى 50 مل أنابيب مخروطية وانتظر 1 دقيقة لقطع صلبة لتطفو إلى الأعلى (الشكل 2C & D). سوف HPMC وخلايا الدم الحمراء (RBC) تكون موجودة في السائل على الجزء السفلي. استخدام الماصة لإزالة السائل من أسفل الأنبوب وإلى أنبوب مخروطي الشكل الجديد. تدور السائل أسفل عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق ونضح طاف من بيليه HPMC / RBC.
      1. كرر هذه العملية ثلاث مرات: 20 مل PBS إضافة إلى الأنسجة المفروم، تسمح الأنسجة في الارتفاع، وإزالة السائل من أسفل مع ماصة وداخل الأنبوب HPMC / RBC، تدور باستمرار، وإزالةطاف. بعد الانتهاء من جميع يدور ويستنشق طاف، وبيليه تحتوي على HPMC وRBC.
    2. لوحة كافة الخلايا من بيليه إلى 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل (DMEM مع المصل 10٪ بقري جنيني [FBS]، 1٪ الفيتامينات MEM [93 ملغ / L]، 1٪ الأحماض MEM الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغم / لتر]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]).
    3. إجراء غسل PBS الثانوي لعزل HPMCs إضافي.
      1. ليغسل PBS الثانوي، يهز الأنسجة الصلبة المتبقية في 200 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20 مل من برنامج تلفزيوني، ثم انتظر 1 دقيقة للأنسجة لتطفو إلى الأعلى. إزالة السائل من أسفل الأنبوب إلى أنبوب جديد، الطرد المركزي عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق، ونضح طاف.
      2. لوحة كل HPMC / RBC من PBS الثانوي يغسل في منفصلة 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل.
    4. لعزل أي صemaining HPMC، يهز الأنسجة المفروم في 200 دورة في الدقيقة، 37 ° درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في 20 مل من 1 1 0.25٪ التربسين 25 ملي EDTA: حل PBS من حيث الحجم. السماح للأنسجة في الارتفاع، جمع السائل في الجزء السفلي من أنبوب إلى أنبوب جديد 50 مل، وتدور باستمرار عند 0.5 GX 3 دقائق.
      1. نضح في وطاف لوحة كل HPMC / RBC في منفصلة 75 سم 2 قارورة في 15 مل من وسائط النمو الكامل.
    5. ثقافة الخلايا مطلي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في بيئة مرطب. تغذية الخلايا مطلي بإضافة 15 مل من وسائط النمو الكامل في أيام 3 و 5 دون إزالة وسائل الإعلام المستهلك. HPMC يمكن أن يكون مثقف لمدة 5-7 أيام قبل تقسيم.
      1. استخدام المنخفض مرور HPMC (حتى مرور 2) في جميع التجارب لتقليل فقد التمايز وتعديل النمط الظاهري الأصلي. استخدام المجهر واسعة المجال ويفضل مع الهدف 20X مع الفارق البلاستيك قدرات التدخل التباين أو الهدف 4-20x مع النقيض من المرحلة capabilitieالصورة (الفلاتر المرحلة على النقيض المجهر) لاتخاذ كافة الصور من الخلايا، والهدف 10X () في حقل مشرق لتحليل المناعى 3،3'-Diaminobenzidine (DAB) تلطيخ.
    6. تأكد من أن HPMC هي مكعبة والتعبير عن cytokeratin 8 و vimentin قبل تنفيذ المناعية 8 (الشكل 3A، C، E).
  3. NOF العزلة 8
    1. إعداد 10 مل من مخزون من نوع كولاجيناز III الحل (10X) عن طريق الجمع بين 1: 1 خليط من 100X القلم بكتيريا: 1 1500 وحدة النشاط / مل من نوع كولاجيناز الثالث: النشاط 714 وحدات / مل من هيالورونيداز في برنامج تلفزيوني.
    2. هزة الأنسجة الثرب مفروم التي تبقى بعد HPMC العزلة في 200 دورة في الدقيقة، 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات في 10 مل من 10X كولاجيناز النوع الثالث محلول مخفف في مصل الدم خالية من وسائل الإعلام (DMEM مع 1٪ MEM الفيتامينات [93 ملغ / L]، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغ / L]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]). سوف الأنسجة هضمها تبدو مبهمة ويمكن أن يكون بعض الحطام ليفي (الشكل 2E).
    3. أجهزة الطرد المركزي في محلول يحتوي على خلايا NOF في تعليق عند 0.5 x ج لمدة 3 دقائق على RT، نضح في وطاف لوحة بيليه في 75 سم 2 قارورة في 13 مل من وسائط النمو الكامل.
    4. إزالة وسائل الإعلام القديمة واستبدالها مع 15 مل من جديدة وسائل الاعلام النمو الكامل بعد 24 ساعة. يمكن تربيتها NOF لمدة 1-3 أيام قبل تقسيم. سوف نلاحظ انتشار وNOF تتوقف عندما تصل الخلايا confluency.
    5. تأكد من أن الخلايا الليفية الإنسان الأساسية هي خلايا مستطيلة مسطحة والتعبير عن vimentin ولكن ليس cytokeratin 8 قبل تنفيذ المناعية 8 (الشكل 3B، D، F). استخدام NOF المنخفض مرور للتجارب (مثالي قبل مرور 3) لتقليل فقد التمايز وتعديل النمط الظاهري الأصلي. استخدام المجهر واسعة المجال مع الهدف 20X مع البلاستيك قدرات DIC لاتخاذ جميع الصور المرحلة من الخلايا،والهدف 10X في حقل مشرق لتحليل المناعى DAB تلطيخ.

2. الطلاء وعضوي الثقافة 8

  1. NOF الإفراج عن 75 سم الثقافة قارورة من قبل الشطف مع 10 مل من PBS تليها 3 مل من 0.25٪ التربسين / 25 ملي EDTA لمدة لا تتجاوز 5 دقائق. تحييد التربسين مع 3 مرات على الأقل حجم وسائط النمو الكامل.
  2. نقل الخلايا trypsinized إلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل وتدور باستمرار عند 0.5 GX 3 دقائق. إزالة طاف وجلب خلايا احتياطية في 5 مل من وسائط النمو الكامل. استخدام عداد الخلية إلى عدد الخلايا المستخرجة من قارورة الثقافة.
  3. تمييع الخلايا في حجم مناسب من وسائط النمو الكاملة لوحة 2،000-4،000 NOF لكل 100 ميكرولتر على لوحة سوداء، واضحة القاع، 96-جيدا. إضافة 0.5 ميكروغرام / 100 ميكرولتر من الفئران الذيل الكولاجين الأول للخليط الخلية قبل الطلاء. السماح الخلايا الجلوس عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 4 على الأقل ساعة، أو حتى الخلاياالتمسك سطح اللوحة.
  4. الإفراج HPMC من القارورة ثقافة باستخدام نفس الأساليب المذكورة في الخطوات 2.1 و 2.2. تمييع الخلايا في كمية مناسبة من وسائط النمو الكامل لوحة و10،000-20،000 HPMC في 50 ميكرولتر على رأس NOF مطلي بالفعل مع الكولاجين أنا في لوحات 96-جيدا. السماح للخلايا الجلوس عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 18 ساعة على الأقل قبل بدء التجارب.
  5. ثقافة البروتين الفلوري الأخضر (GFP) -expressing HeyA8 خلايا سرطان المبيض في وسائل الاعلام النمو الكامل. وصفت HeyA8 خلايا سرطان المبيض التي fluorescently التعبير عن ناقلات lentiviral معربا عن الكوبيبودا cGFP (pCDH-CMV-MCS-EF1). وينبغي أن يكون HeyA8 خلايا سرطان المبيض 80-90٪ متكدسة في يوم من الاستخدام (مرحلة النمو لوغاريتمي). الافراج عن الخلايا من لوحة الثقافة والعد باستخدام نفس الأساليب هو موضح في الخطوات 2،1-2،2 للخلايا الأولية.
  6. السماح خلايا سرطان المبيض للتعافي في وسائل الاعلام النمو الكامل لمدة 15-20 دقيقة عند 37 درجة مئوية فيأنبوب مخروطي الشكل مع غطاء مختومة فضفاضة.

3. التصاق الفحص 8

  1. بعد الشفاء، بيليه خلايا سرطان المبيض من خلال الدوران لمدة 3 دقائق عند 0.5 x ج ثم إزالة طاف وتمييع الخلايا في حجم مناسب من وسائل الإعلام خالية من المصل لتحقيق تركيز من 50000 خلية / 100 ميكرولتر.
  2. عكس لوحات 96-جيدا مع HPMC الثقافات عضوي النمط / نوف لإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وإضافة 100 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية في وسائل الإعلام خالية من المصل على كل جانب. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 30 دقيقة إلى 4 ساعات.
  3. عكس لوحة 96-جيدا لإزالة وسائل الإعلام والخلايا غير ملتصقة. استخدام الماصة متعددة في الطاقة المنخفضة لبعناية وبلطف الماصة 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل بئر، وعكس لوحة مرة أخرى. كرر PBS يغسل مرة واحدة أكثر من ذلك.
  4. عكس لإزالة برنامج تلفزيوني وإضافة 100 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ إلى كل بئر. السماح لوحة للجلوس لمدة 20 ميلن لإصلاح الخلايا. بعد 20 دقيقة، عكس لوحة وإضافة 100 ميكرولتر PBS.
  5. لاحظ أن مضان إجمالي عدد الآبار يمكن الإبلاغ أو عدد الخلايا يمكن كميا. لالكمي، لوحة أول منحنى القياسية في نسختين باستخدام خلايا HeyA8 بتركيز من 1 مليون خلية / مل.
    1. جعل منحنى القياسية من خلال الدوران بنسبة 1 مليون خلية، وإزالة وسائل الإعلام، والسماح لهم الجلوس في 1 مل 4٪ لامتصاص العرق لمدة 20 دقيقة.
    2. خلايا تدور مرة أخرى وتنشئة في 1 مل PBS (خلايا إعادة فرز الأصوات لتأكيد 1000000 / تركيز مل). لوحة 50000، 40000، 30000، 20000، 10000، 5000، 1000، و 0 الخلايا في كل بئر من نسختين، وإضافة PBS لالحجم الكلي النهائي من 50 ميكرولتر في كل بئر.
  6. أسفل قراءة لوحة الثقافة على القارئ الفلورسنت لوحة (الإثارة = 488 نانومتر، والانبعاثات = 528 نانومتر)، وتوسيع نطاق الآبار عالية (50،000 على منحنى قياسي). استخدام منحنى القياسية لحساب عدد خلايا سرطان المبيض انضمت إلى organotypثقافة جيم في كل بئر (الشكل 4A-C).

4. انتشار الفحص 10

  1. بعد استعادة خلايا سرطان المبيض (انظر الخطوات 2.5 و 2.6 أعلاه)، بيليه الخلايا من خلال الدوران لمدة 3 دقائق عند 0.5 x ج ثم تمييع الخلايا في حجم مناسب من 1٪ FBS وسائل الإعلام (DMEM مع 1٪ FBS، 1٪ MEM الفيتامينات [93 ملغ / L]، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية [81.4 ملغ / L]، 1٪ البنسلين الستربتوميسين [القلم بكتيريا، 100 U / البنسلين مل و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين]) لتحقيق تركيز 4000 الخلايا / 150 ميكرولتر.
  2. عكس لوحة 96-جيدا مع HPMC / ثقافات عضوي النمط عندها لإزالة وسائل الاعلام المستهلك، وإضافة 150 ميكرولتر من تعليق الخلايا السرطانية في 1٪ FBS وسائل الإعلام إلى كل بئر. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 72 ساعة.
  3. أسفل قراءة لوحة الثقافة على قارئ لوحة الفلورسنت مرة واحدة يوميا (الإثارة = 488 نانومتر، والانبعاثات = 528 نانومتر) لتقييم انتشار نسبيمن الخلايا. مواصلة الفحص لمدة 96 ساعة، وتغيير وسائل الإعلام في 48 ساعة (الشكل 5A-C). يجب الحرص على عدم تعكير صفو الثقافة عند تغيير وسائل الاعلام (لوحة للقلب هو الأفضل).

5. الغزو الفحص 8

  1. قبل الطلاء الثقافة 3D، إضافة 7.5 ميكروغرام الفئران الذيل الكولاجين أنا في 200 ميكرولتر PBS إلى 24 جيدا لوحة الثقافة إدراج (8 ميكرون حجم المسام). السماح للO لوحة احتضان / N، ثم إزالة بعناية PBS مع الماصة على الفور قبل الطلاء ثقافة عضوي النمط HPMC / NOF على إدراج المغلفة الكولاجين (الخطوة 2 أعلاه).
  2. إعداد خلايا سرطان المبيض كما في الخطوة 3.1. لوحة للخلايا سرطان المبيض على الثقافات عضوي النمط على إدراج، استخدم بعناية الماصة لإزالة وسائل الاعلام الزائدة من الجزء العلوي من تدرج. إضافة 100 ميكرولتر من تعليق خلية سرطان المبيض في وسائل الإعلام خالية من المصل على كل جانب.
  3. إضافة 750 ميكرولتر من وسائل الاعلام النمو الكامل في البئر دون إدراج للحث على الخلايا السرطانية فيvasion في الثقافات عضوي النمط. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في CO 2 5٪ في بيئة مرطب لمدة 24 ساعة.
    ملاحظة: خلايا سرطان المبيض التي تغزو والثقافة عضوي النمط عبور إدراج ويبقى على الجانب السفلي من إدراج.
  4. بعد 24 ساعة، فهم إدراج مع ملقط لفترة وجيزة شطفه في كوب من برنامج تلفزيوني، ثم نقل إدراج في بئر فارغة. فرك الجزء العلوي من كل إدراج مع كلا الجانبين من مسحة القطن ليصبح المجموع 1 دقيقة. المكان بسرعة إدراج في لوحة تحتوي على 750 ميكرولتر بارافورمالدهيد 4٪ في كل بئر. تسمح كل إدراج للجلوس في امتصاص العرق لمدة 10 دقيقة قبل نقل إدراج في آبار مليئة 750 ميكرولتر PBS.
  5. عرض الخلايا غزت (الالتزام وثابتة على الجزء السفلي من إدراج) مع المجهر في 2.5x التكبير. عندما البئر كله داخل مجال الرؤية، وضبط التكبير إلى 10x و تأخذ 5 صور، واحدة بالقرب من مركز و 1 في كل رباعي من البئر، وتجنبالتقاط الصور التي هي قريبة جدا من الحواف. تتبع نفس النمط لكل بئر.
  6. استخدام برنامج الشركة المصنعة لحساب عدد الخلايا في كل صورة للحصول على متوسط ​​عدد الخلايا غزت لكل حقل في كل بئر (الشكل 6A-C) وفقا لبروتوكول الخاصة بهم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تم تجميعها ثقافة عضوي النمط عن طريق خلط أولا الليفية الإنسان الأساسية مع نوع الكولاجين I ثم تتراكب هذه الثقافة مع 5 أضعاف عدد الخلايا الظهارية. وقد حضنت ثقافة لا يقل عن 18 ساعة قبل أضيفت خلايا سرطان المبيض لدراسة الالتصاق، والغزو أو الانتشار. وتكرر كل مقايسة مع متعددة (ن = 3-5) تم اختبار الثقافات 3D تم الحصول عليها من مختلف المرضى والعديد من الآبار في كل حالة للالتصاق (ن = 5)، وانتشار المقايسات (ن = 5) وغزو (ن = 3) . خلايا سرطان المبيض انضمت إلى ثقافة عضوي النمط 3D بعد 4 ساعات

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أنشئ نموذج عضوي النمط من المكروية البريتوني لتقييم وظيفة الفردية والجماعية (ق) من كل من المكونات الخلوية والفطرية المكروية في نشر بسرطان المبيض. وتقدم بروتوكولات محددة لطلاء وتخصيص ثقافة عضوي النمط 3D للتحقيق في المبيض التصاق الخلايا السرطانية، والانتشار، والغزو. تم عزل خلايا الثرب الإنسان الأساسية الظهارية والخلايا الليفية من المرضى واستخدامها في ممر في وقت مبكر للحفاظ على التشكل الطبيعي والاختلاف المريض. في هذا النموذج، تم الطبقات الخلايا الليفية الثرب العادية وECM (نوع الكولاجي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر جميع المقيمين والأطباء المعالجين ، ولا سيما الدكتور أ. هاني (جامعة شيكاغو ، قسم أمراض النساء والتوليد) لجمع الخزعات العقلية. أيضا ، نشكر ستايسي توبين وجيل إيزنبرغ على تحرير هذه المخطوطة بعناية. تم دعم هذا العمل من قبل Bears Care ، المستفيد الخيري من نادي شيكاغو بيرز لكرة القدم ، والمعهد الوطني للاضطرابات العصبية والسكتة الدماغية (NINDS) R21 NS075702 ، ومنحة المعهد الوطني للسرطان R01 CA111882 إلى E.L.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي>1. عزل واستزراع الخلايا الأولية < / قوي >
PBSفيشر ScientificSH3001304
شفرات حلاقة أحاديةفيشر ساينتفيك12-640
أطباق ثقافة 15 سمBD Biosciences353025
قارورةزجاجية؟؟
مصل الأبقار الجنينية (FBS)Life Technologies16000044_3616914956
DMEM مع L-GlutamineCorning10-013-CV
MEM فيتاميناتCorning25-020-Cl
MEM الأحماض الأمينية غير الأساسيةCorning25-025-CI
البنسلين الستربتومايسينCorning30-002-CI
شاكر Thermo-FisherMaxQ 4450
جهاز طرد مركزيEppendorf5702
حاضنةThermo-FisherForma Series II حاضنة CO2 مغلفة بالماء موديل 3100
Trypsin EDTA ، 1x (0.25٪)Corning25-053-CI
HyaluronidaseWorthington BiochemicalLS002592
T-75 قواريرBD Biosciences353136
قوارير T-175BD Biosciences353112
نصائح ماصةRaininP2 و P10 و P20 و P200 و P1000
نصائح ماصةCorningالمفلترة P2 و P10 و P20 و P200 و P1000
اسم الكاشف / المعدات< strong>Company رقم الكتالوجتعليقات / وصف< / strong>
2. تصفيح ثقافة ثلاثية الأبعاد< / قوي >
عداد الخلاياInvitrogenالكونتيسة
الكونتيسة غرفة عد الخلايا شرائحInvitrogenC10313
Trypan Blue Stain (0.4٪)Gibco15250-061
الكولاجين من النوع الأول (ذيل الفئران)BD Biosciences354236
96 لوحة بئر ، قاع شفاف ، أسودBD العلومالبيولوجية 353219
<قوي>اسم الكاشف / المعداتCompany Catalog NumberComments / Description
3. مقايسة الالتصاق< قوية>
متعددة القنوات ماصةEppendorfXplorer 300
محلول بارافورمالدهيد 4٪ في PBSSanta Cruz Biotechnologysc-281692
قارئ الألواحالأجهزة الجزيئيةMinimax
اسم الكاشف / المعدات< قوي><قوي>الشركة< قوي><قوي>رقم الكتالوجتعليقات / وصف
5. مقايسة الغزو < / قوي >
إدراج ثقافة الخلية (8um ، 24 بئر)BD Biosciences353097
مسحات قطنيةQ-tipsمسحات قطنية
مجهرZeissAxiovert 200m
Cell Profilerالمجال
24 لوحة بئرBD Biosciences353047
اسم الكاشف / المعداتCompany Catalog NumberComments / Description
6. الأجسام المضادة< / قوية >
مضاد للإنتجرين &alpha ؛ V& beta; 3 الأجسام المضادة ، استنساخ LM609EMD MilliporeMAB1976
بيتا 1 & nbsp ؛OncosynergyOS2966
Alpha 5 [CD49e]ID Pharmingen555615
Beta 4 [CD104]EMD MilliporeMAB 2058
الحواف العام

المراجع

  1. Siegel, R., Ma, J., Zou, Z., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J. Clin. 65 (1), 5-29 (2015).
  2. Lengyel, E. Ovarian cancer development and metastasis. Am. J. Pathol. 177, 1053-1064 (2010).
  3. Quail, D. F., Joyce, J. A. Microenvironmental regulation of tumor progression and metastasis. Nat. Med. 19, 1423-1437 (2013).
  4. Correia, A. L., Bissell, M. J. The tumor microenvironment is a dominant force in multidrug resistance. Drug Resist Updat. 15, 39-49 (2012).
  5. Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: Functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 21, 309-322 (2012).
  6. Nieman, K. M., et al. Adipocytes promote ovarian cancer metastasis and provide energy for rapid tumor growth. Nat. Med. 17, 1498-1503 (2011).
  7. Daya, D., McCaughy, W. T. Pathology of the peritoneum: A review of selected topics. Semin. Diagn. Pathol. 8, 277-289 (1991).
  8. Kenny, H. A., Krausz, T., Yamada, S. D., Lengyel, E. Use of a novel 3D culture model to elucidate the role of mesothelial cells, fibroblasts and extra-cellular matrices on adhesion and invasion of ovarian cancer cells. Int. J. Cancer. 121, 1463-1472 (2007).
  9. Kenny, H. A., Kaur, S., Coussens, L. M., Lengyel, E. The initial steps of ovarian cancer cell metastasis are mediated by MMP-2 cleavage of vitronectin and fibronectin. J. Clin. Invest. 118, 1367-1379 (2008).
  10. Kenny, H. A., et al. Mesothelial cells promote early ovarian cancer metastasis through fibronectin secretion. J. Clin. Invest. 124, 4614-4628 (2014).
  11. Strobel, T., Cannistra, S. A. β1-integrins partly mediate binding of ovarian cancer cells to peritoneal mesothelium in vitro. Gynecol. Oncol. 73, 362-367 (1999).
  12. Strobel, T., Swanson, L., Cannistra, S. A. In vivo inhibition of CD44 limits intra-abdominal spread of a human ovarian cancer xenograft in nude mice: A novel role for CD 44 in the process of peritoneal implantation. Cancer Res. 57, 1228-1232 (1997).
  13. Iwanicki, M., et al. Ovarian cancer spheroids use myosin-generated force to clear the mesothelium. Cancer Discov. 1, 144-157 (2011).
  14. Lessan, K., Aguiar, D., Oegema, T. R., Siebenson, L., Skubitz, A. P. CD44 and β1 integrin mediate ovarian carcinoma cell adhesion to peritoneal mesothelial cells. Am. J. Pathol. 154, 1525-1537 (1999).
  15. Ahmed, N., Riley, C., Rice, G., Quinn, M. Role of integrin receptors for fibronectin, collagen and laminin in the regulation of ovarian carcinoma functions in response to a matrix microenvironment. Clin. Exp. Metastasis. 22, 391-402 (2005).
  16. Kaur, S., et al. β3-integrin expression on tumor cells inhibits tumor progression, reduces metastasis, and is associated with a favorable prognosis in patients with ovarian cancer. Am. J. Pathol. 175, 2184-2196 (2009).
  17. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. In vitro degradation of extracellular matrix by human ovarian carcinoma cells. Clin. Exp. Metastasis. 5, 181-197 (1987).
  18. Kanemoto, T., Martin, G. R., Hamilton, T. C., Fridman, R. Effects of synthetic peptides and protease inhibitors on the interaction of a human ovarian cancer cell line (NIH:OVCAR-3) with a reconstituted basement membrane (matrigel). Invasion Metastasis. 11, 84-92 (1991).
  19. Rieppi, M., et al. Mesothelial cells induce the motility of human ovarian carcinoma cells. Int. J. Cancer. 80, 303-307 (1999).
  20. Barbolina, M. V., Adley, B. P., Ariztia, E. V., Liu, Y., Stack, M. S. Microenvironmental regulation of membrane type 1 matrix metalloproteinase activity in ovarian carcinoma cells via collagen-induced EGR1 expression. J. Biol. Chem. 282, 4924-4931 (2007).
  21. Burleson, K. M., et al. Ovarian carcinoma ascites spheroids adhere to extracellular matrix components and mesothelial cell monolayers. Gynecol. Oncol. 93, 170-181 (2004).
  22. Suzuki, N., et al. HMOCC-1, a human monoclonal antibody that inhibits adhesion of ovarian cancer cells to human mesothelial cells. Gynecol. Oncol. 95, 290-298 (2004).
  23. Kishikawa, T., et al. Two distinct pattern of peritoneal involvement shown by in vitro and in vivo ovarian cancer dissemination models. Invas. Metast. 15, 11-21 (1995).
  24. Casey, R. C., et al. Establishment of an in vitro assay to measure the invasion of ovarian carcinoma cells through mesothelial cell monolayers. Clin. Exp. Metastasis. 20, 343-356 (2003).
  25. Niedbala, M. J., Crickard, K., Bernacki, R. Interactions of human ovarian tumor cells with human mesothelial cells grown on extracellular matrix. Exp. Cell Res. 160, 499-513 (1985).
  26. White, E. A., Kenny, H. A., Lengyel, E. Three-Dimensional modeling of ovarian cancer. Adv. Drug Deliv. Rev. 79-80, 184-192 (2014).
  27. Kenny, H. A., et al. Quantitative high throughput screening using a primary human three-dimensional organotypic culture predicts in vivo efficacy. Nature Comm. , (2015).
  28. Sawada, K., et al. c-Met overexpression is a prognostic factor in ovarian cancer and an effective target for inhibition of peritoneal dissemination and invasion. Cancer Res. 67, 1670-1680 (2007).
  29. Kenny, H. A., Lengyel, E. MMP-2 functions as an early response protein in ovarian cancer metastasis. Cell cycle. 8, 683-688 (2009).
  30. Sawada, K., et al. Loss of E-cadherin promotes ovarian cancer metastasis via alpha 5-integrin, which is a therapeutic target. Cancer Res. 68, 2329-2339 (2008).
  31. Mitra, A. K., et al. Ligand-independent activation of c-Met by fibronectin and α(5)β(1)-integrin regulates ovarian cancer invasion and metastasis. Oncogene. 30, 1566-1576 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

نموذج التجويف الصفاقيالخلايا الظهارية الميزوثيلية البشرية الأوليةالخلايا الليفية الطبيعية للثربالتصاق الخلايا السرطانيةغزو الخلايا السرطانيةتكاثر الخلايا السرطانيةتثبيط ببتيد RGDالأجسام المضادة الحاجبة للإنتغرين
نمذجة خطوات المبكر عن سرطان المبيض نشر في الثقافة عضوي النمط من البريتوني تجويف الإنسان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.