الإنتاج على نطاق المختبر للبروتينات حقيقية النواة مع التعديل المناسب بعد الترجمة حاجزا كبيرا. فيما يلي بروتوكول قوي مع الإنشاء السريع والتحول للتعبير عن البروتين باستخدام نظام تعبير الثدييات. يدعم هذا النظام الأحماض الأمينية الانتقائية ، ووضع العلامات الانتقائية للبروتينات ومعدلات الجزيئات الصغيرة لتكوين الجليكان.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
ارتفاع العائد التعبير عن البروتينات المؤتلف الإنسان مع عابر ترنسفكأيشن من خلايا HEK293 في تعليق
في هذه المقالة
إشعار تصحيح
Important: There has been an erratum issued for this article. View Erratum Notice
ملخص
يمثل
الملخص
فن إنتاج البروتينات المؤتلف مع بعض التعديلات بعد متعدية معقدة يمثل تحديا كبيرا للدراسات البنية والوظيفة. إنشاء السريع واسترداد عالية من خطوط الخلايا الثديية عابر.، ويتناول هذا الحاجز ويشكل وسيلة فعالة للتعبير عن البروتينات التي يتم توجيهها بشكل طبيعي من خلال ER ومسار إفرازية بوساطة جولجي. هنا هو بروتوكول واحد للتعبير البروتين باستخدام HEK293F البشرية وخطوط الخلايا HEK293S مع transfected متجه التعبير الثدييات مصممة لعوائد عالية من البروتين. مدى انطباق هذا النظام كما يتجلى ذلك باستخدام ثلاثة بروتينات سكرية التمثيلية التي أعربت عن ذات العوائد بين 95-120 ملغ من البروتين المنقى تعافى للتر الواحد من الثقافة. هذه البروتينات هي FcγRIIIa البشرية وsialyltransferase الفئران α2-6، ST6GalI، سواء أعرب مع GFP الانصهار N-محطة، وكذلك الغلوبولين المناعي البشري معدلة G1 لكرة القدم. هذا النظام يده قويةlizes وسيلة خالية من المصل التي هي قابلة للتكيف للتعبير عن البروتينات والكربوهيدرات للدراسات الهيكلية باستخدام مطياف الكتلة والتحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي المخصب نظائريا. وعلاوة على ذلك، تكوين N-غليكان يمكن ضبطها من خلال إضافة جزيء صغير لمنع بعض التعديلات غليكان بطريقة لا يقلل من العائد.
المقدمة
إنتاج غلة عالية من البروتينات البشرية مطوية بشكل مناسب وبعد translationally معدلة لتحليل مفصل للبنية ووظيفة لا يزال يشكل تحديا كبيرا. تتوفر التي تنتج البروتينات المؤتلف مع مثل مواطن وظيفة والسلوك وهناك عدد كبير من أنظمة التعبير. أنظمة التعبير البكتيرية، في الغالب سلالات الإشريكية القولونية، تمثل الأدوات التي يمكن الوصول إليها والتي يشيع استخدامها في المجال البحثي، نظرا لبساطة هذه الأنظمة التعبير، على الرغم من الخميرة، والنباتات والحشرات والثدييات أنظمة موصوفة 1-4 أيضا. ومع ذلك، فإن معظم هذه النظم غير قادرة على تعديل ما بعد متعدية المناسب من البروتينات المستهدفة. A المصالح الأساسية للمختبرات اذع والوفل تنتج ب....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
هذا البروتوكول هو كاف للتعبير باستخدام HEK293F أو خلايا HEK293S.
1. خلية المؤسسة
- ثقافة التلقيح
ملاحظة: يجب أن تتم جميع الإجراءات التلاعب الثقافة في منشأة BSL-2 وكل بند جلبت الى مجلس الوزراء للسلامة الأحيائية يجب تعقيمها عن طريق الرش مع الايثانول 70٪ في محلول مائي.- تعمل شاكر حاضنة عند 135 دورة في الدقيقة، 80٪ الرطوبة وعند 8.0٪ CO 2 و 37 درجة مئوية. تحويل "على" مصباح الأشعة فوق البنفسجية ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
تعبير البروتين رفيع المستوى والنقاء
هذا النظام التعبير الأمثل ولدت عالية الغلة من البروتينات الغليكوزيلاتي. ويرد النمط المعتاد في التعبير عن IgG1-FC (الشكل 1). في هذه الحالة، يوم 0 هو اليوم ترنسفكأيشن تليها يوم 1 (تمييع) وأيام الثقافة اللاحقة حتى يوم 5. البروتين التعبير تحليلها باستخدام جزء التعبير القابلة للذوبان في المتوسط الخا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
يوضح هذا البروتوكول البروتين التعبير عبر ترنسفكأيشن عابرة من الخلايا HEK293F أو S. شروط ترنسفكأيشن المثلى التي أنشئت في اذع والوفل مختبرات توظف مزيجا ينتقد تركيز كثافة الخلايا وكاشف لتحقيق عالية الكفاءة ترنسفكأيشن. الاعتبارات الهامة عند تنفيذ هذا البروتوكول ما يلي: الحفاظ على ثقافة مستقرة قبل ترنسفكأيشن (مع ثقافة متسقة يتضاعف مرات). ترنسفكأيشن من الخلايا بنشاط متزايد (عن طريق خلايا تمييع التي تحققت حتى 1 × 10 6 خلية / مل 24 ساعة قبل ترنسفكأيشن) مع خلية قابلية أكبر من 95.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن جميع المؤلفين عدم وجود مصالح مالية متنافسة في هذه المخطوطة.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل ماليا من المنح K22AI099165 (AWB)، P41GM103390 (KWM) وP01GM107012 (KWM) من المعاهد الوطنية للصحة، وبأموال من روي J. زارة كارفر الكيمياء الحيوية، الفيزياء الحيوية والبيولوجيا الجزيئية في جامعة ولاية ايوا . مضمون هذا العمل هو فقط من مسؤولية الكتاب ولا تمثل بالضرورة وجهة النظر الرسمية للالمعاهد الوطنية للصحة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| خزانة السلامة الحيوية | شركة NuAire، Inc. | CellGard ES NU-S475-400 | الفئة الثانية ، شاكر حضانة خزانة السلامة البيولوجية من النوع A2 |
| INFORS HT | Multitron Cell ؛ | ||
| الوسيط أ: فري ستايل التعبير المتوسط | لايف تكنولوجيز | 12338-018 | |
| متوسط ب: ExCell 293 مصل خال من المتوسط | SIGMA | 14571C | |
| 125 قارورة إرلينماير مع غطاء تهوية | Corning Incorporated / Life | Sciences 431143 | |
| 250 قارورة Erlenmeyer مع غطاء تهوية | Corning Incorporated / Life | Sciences 431144 | |
| FreeStyle HEK 293F Cells | Life Technologies | R790-07 | |
| 1 مل ماصة مصلية يمكن التخلص منها | فيشر سسيتيفيك | 13-676-10B | |
| 10 مل ماصة مصلية يمكن التخلص منها | فيشر سسيتيفيك | 13-676-10J | |
| 25 مل ماصة مصلية يمكن التخلص منها | فيشر سسيتيفيك | 13-676-10 كيلو | |
| ماصة (Pipet-Aid XP) | دروموند | 161263 | |
| Trypan Blue Solution | ثرمو علمية | SV30084.01 | |
| عد الشرائح | Bio-Rad | 145-0011 | |
| TC20 عداد الخلايا الآلي | Bio-Rad | 145-0102 | |
| بولي إيثيلينيمين (PEI) | Polysciences Inc. | 23966 | تحضير محلول المرق بتركيز 1 ملغم/مل في مخزن يحتوي على 25 ملي مولار 4-(2-هيدروكسي إيثيل)-1-بيبرازينيثان سلفونيك حمض (HEPES) و 150 ملي مولار كلوريد الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.5). إذابة PEI تماما. تعقيم من خلال 0.22 & مو ؛ تصفية المحقنة M وتخزينها عند -20 درجة مئوية. |
| 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازين إيثان سلفونيك حمض (HEPES) | EMD Chemicals Inc. | 7365-45-9 | |
| مرشح حقنة 25 مم ، 0.22 مو ؛ M | فيشر العلوم | 09-719A | |
| Trisaminomethane (قاعدة تريس) | فيشر العلوم | BP152-1 | |
| XL1-Blue | ستراتاجين | 222249 | |
| تريبتون | فيشر العلوم | BP1421-2 | |
| مستخلص الخميرة | Fluka Analytical ؛ | 92144 | |
| كيماويات | كلوريد الصوديوم | BDH8014 | |
| طقم تنقية البلازميد | QIAGEN | 12145 | |
| Valproic (VPA) | SIGMA | P4543 | تحضير محلول مخزون 220 mM & nbsp ؛ في الماء ، وتعقيمه عن طريق المرور عبر مرشح معقم 0.22 مم وتخزينه عند -20 درجة ؛ C |
| الطرد المركزي | الحرارية العلمية | EW-17707-65 | |
| بروتين A-Sepharose العمود | SIGMA | P9424 | |
| Ni-NTA superflow | QIAGEN | 30430 | |
| 3- (N-morpholino) حمض البروبان سلفونيك (MOPS) | فيشر العلوم | BP308-500 | |
| جلايسين | فيشر العلوم | BP381-500 | |
| 10 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع Amicon & reg ؛ مرشحات الطرد المركزي الفائقة | Millipore | UFC901096 | |
| كبريتات دوديسيل الصوديوم | ALDRICH | L3771 | |
| بيتا ميركابتو إيثانول | ALDRICH | M6250 | |
| Glycerol | SIGMA | G5516 | |
| Precision Plus Protein All Blue Standards | Bio-Rad | 161-0373 | |
| حمض الخليك ، الجليدي & nbsp ؛ | فيشر Scietific | 64-19-7 | |
| coomassie أزرق لامع | Bio-Rad | 161-0406 | |
| MALDI-TOFMS Voyager-DE PRO | الحيوية | ||
| التطبيقية15< / sup>N المسمى L-Tyrosine | ALDRICH | 332151 | |
| 15< / sup>N المسمى L-Lysine | ALDRICH | 592900 | |
| L-Phenylalanine | SIGMA-ALDRICH | P2126 | |
| 13< / sup>C6-Glucose | ALDRICH | 389374 | |
| 2- deoxy-2-fluoro-l-fucose | سانتا كروز التكنولوجيا الحيوية | SC-283123 |
المراجع
- Terpe, K. Overview of bacterial expression systems for heterologous protein production: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems. Appl Microbiol Biotechnol. 72 (2), 211-222 (2006).
- Sorensen, H. P., Mortensen, K. K.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
تصحيح
Formal Correction: Erratum: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension
Posted by JoVE Editors on 9/08/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: High Yield Expression of Recombinant Human Proteins with the Transient Transfection of HEK293 Cells in Suspension. The Authors section was updated. from:
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
to
Ganesh P. Subedi1
Roy W. Johnson2
Heather A. Moniz2
Kelley W. Moremen2
Adam W. Barb1
1The Roy J. Carver Department of Biochemistry, Biophysics and Molecular Biology, Iowa State University
2Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia
الوسوم
