Method Article

وظيفية تحليل التكملة (FCA): ممارسة مختبر تصميم وتنفيذ المكمل لتدريس الكيمياء الحيوية مسارات

DOI:

10.3791/53850

⸱

June 24th, 2016

 ,  , 
1Thomas H. Gosnell School of Life Sciences, Rochester Institute of Technology

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

التحقق من صحة الأنشطة الإنزيمية تشارك في المسارات البيوكيميائية ويمكن توضيح ذلك باستخدام التحليل تكامل وظيفي (FCA). وصفها في هذه المخطوطة هي فحص FCA مما يدل على النشاط الأنزيمي من الأنزيمات المشاركة في عملية التمثيل الغذائي للأحماض الأمينية، استجابة صارمة البكتيرية والحيوي ببتيدوغليكان البكتيرية.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وظيفية تكامل فحص (FCA) هو فحص في الجسم الحي الذي يستخدم على نطاق واسع لإلقاء الضوء على وظيفة / دور الجينات / الانزيمات. هذا الأسلوب هو أمر شائع جدا في الكيمياء الحيوية وعلم الوراثة والعديد من التخصصات الأخرى. لمحة شاملة عن تقنية لتكملة تعليم المسارات البيوكيميائية المتعلقة الأحماض الأمينية، ببتيدوغليكان ويقال الاستجابة الصارمة البكتيرية في هذه المخطوطة. ويسلط الضوء على اثنين من cDNAs من المصنع نموذج thaliana كائن نبات الأرابيدوبسيس التي تشارك في عملية التمثيل الغذائي لليسين (L، L-diaminopimelate الألانين (dapL) والألانين التيروزين (tyrB) تشارك في عملية التمثيل الغذائي للالتيروزين والفينيل ألانين. وبالإضافة إلى ذلك، فإن ببتيدوغليكان البكتيرية يتم تمييز مسار المنشطة من خلال تحليل -acetylmuramoyl-L-ألانيل-D-glutamate- المتوسط ​​يغاز -2،6-diaminopimelate (مور) الجين UDP- N من البكتيريا Verrucomicrobium الشائكة التي ينطوي عليها الصليب-linking من ببتيدوغليكان. وذكر أن استجابة صارمة البكتيرية أيضا من خلال تحليل آر إس إتش (ص العلا / ق وعاء ح omolog) الجين bifunctional مسؤولة عن النمط الظاهري شديدة مخاطي في س بكتيريا Novosphingobium. يتم عرض أربعة أمثلة من الهيئة الاتحادية للجمارك. وسوف يركز الفيديو على ثلاثة منها، وهي ليسين، ببتيدوغليكان واستجابة صرامة.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويعرف تكامل وظيفي في سياق توضيح وظيفة (ق) / دور (ق) من الجين كما قدرة مثلي معين أو الجينات orthologous لاستعادة متحولة خاص مع النمط الظاهري ملاحظتها للدولة من النوع البري عندما مثلي أو هو عرض الجينات orthologous في رابطة الدول المستقلة أو العابرة في الخلفية متحولة. وقد استخدم على نطاق واسع هذه التقنية لعزل والتعرف على وظيفة (ق) / دور (ق) من العديد من الجينات. أحد الأمثلة على ذلك هو العزلة وتحديد كربوكسيل orotidine-5-الفوسفات من المبيضات البيض باستخدام متحولة ura3 س الخباز ومتحولة pyrF من E. القولونية. 1 وقد استخدم الباحثون هذه التقنية لتوضيح وظيفة الجينات....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: المؤلفون على استعداد لتوفير السلالات البكتيرية والبلازميدات المؤتلف لتسهيل إدماج تحليل تكامل وظيفي لأغراض التدريس للأفراد المهتمين. يتم سرد البلازميدات التي كانت تستخدم لتسهيل تجارب تكامل وظيفي في الجدول 1.

1. البناء من البلازميدات لالتكملة الوظيفي

  1. استنساخ Diaminopimelate الألانين (dapL) لالتكملة الوظيفي.
    1. تضخيم dapL إطار القراءة المفتوح (ORF) من V. الشائك....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يتم سرد السلالات البكتيرية التي يعملون في مختلف التحليلات تكامل وظيفي في الجدول 2.

وظيفية تحليل تكامل: L، L-diaminopimelate الألانين (dapL)

وE. القولونية متحولة مزدوج AOH1 (Δ DAPD :: Kan2، dapE6) تؤوي طفر.......

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العديد من الدورات التي هي جزء لا يتجزأ من الحيوية ومنهج العلوم البيولوجية الجزيئية في معهد روتشستر للتكنولوجيا وجود مكون المختبر بالإضافة إلى جزء محاضرة للدورة. المناهج الدراسية للعام الدراسي 2014-2015 ويتضمن ما مجموعه 48 دورة، 29 منها تحتوي على عنصر المختبر والتي تمثل حوالي 60٪. واحدة من هذه الدورة هو أساسيات الكيمياء الحيوية النباتية وعلم الأمراض (FPBP)، محاضرة / دورة المختبر المخلوطة وBioseparations: المبادئ والممارسات (BPP)، دورة المختبري.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

AOH وMAS يعترف كلية العلوم وH. مدرسة توماس Gosnell لعلوم الحياة في معهد روتشستر للتكنولوجيا حصول على الدعم. وأيد هذا العمل في جزء من مؤسسة العلوم الوطنية بالولايات المتحدة (NSF) جائزة لAOH MCB-1120541.

....

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
E. القولوني< / em> المسوخمختبر Hudson / Savka أو CGSC (http://cgsc.biology.yale.edu/)
ElectroporatorBiorad-USA1652100
Electroporation CuvettesBiorad-USA1652082
حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتهاGeneric
MicrocentrifugeGeneric
لوريا أجارثيرموفيشر22700025
لوريا مرقثيرموفيشر12795084
M9 متوسطسيجما-ألدريتش63011
سكر العنب البطاطا متوسطفيشر ساينتفيك  DF0013-15-8
كاناميسينسيجما ألدريتشK1377
ديامينوبيميلاتسيجما ألدريتش92591
ثايمينسيجما ألدريتشT0376
كلورامفينيكولسيجما ألدريتشC0378
التيروزينسيجما ألدريتشT3754
فينيلالانينسيجما ألدريتشP2126
أسبارتاتسيجما ألدريتشA9256
فالينسيجما ألدريتشV0500
ليوسينسيجما ألدريتشL8000
إيزولوسينسيجما ألدريتشI2752
يوراسيلسيجما ألدريتشU0750
جيلسيرولسيجما ألدريتشG5516
أرابينوزسيجما ألدريتشA3256
ترايسيلينسيجما ألدريتش87128
Taq DNA بوليميرازثيرموفيشر العلمي10342-020
البلاتين pfx DNA بوليميرازثيرموفيشر علمي11708-013
T4 DNA ligaseThermofisher Scientific15224-041
الإشريكية القولونية < / م > Dh5-alphaThermofisher Scientific18258012
الإشريكية القولونية < / em> Top10Thermofisher ScientificC4040-03
pET100D / topo vectorThermofisher ScientificK100-01
pCR2.1 ناقلاتالرصيد الحراري العلميK2030-01
علميعلمي

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gillum, A. M., Tsay, E. Y., Kirsch, D. R. Isolation of the Candida albicans gene for orotidine-5'-phosphate decarboxylase by complementation of S. cerevisiae ura3 and E. coli pyrF mutations. Mol Gen Genet. 198, 179-182 (1984).
  2. Hudson, A. O., Singh, B. K., Leustek, T., Gilvarg, C.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Functional ComplementationEnzyme Activity AssayGene Function AnalysisElectroporation TransformationBacterial Mutant SelectionIn Vivo ConditionsAmino Acid MetabolismPeptidoglycan SynthesisStringent Response PathwayArabidopsis Thaliana

Related Articles