نقدم نموذجا ثلاثي الأبعاد لسرطان الرئة (3D) يعتمد على سقالة كولاجين بيولوجية لدراسة الحساسية تجاه العلاجات غير الصغيرة لسرطان الرئة (NSCLC). نعرض تقنيات قراءة مختلفة لتحديد مؤشر الانتشار وموت الخلايا المبرمج وحالة الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT). يتم دمج البيانات التي تم جمعها في نموذج في السيليكو للتنبؤ بحساسية الأدوية.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
والأنسجة المشتركة 3D هندسيا
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذه الدراسة، ونحن معا في المختبر 3D الرئة نموذج الورم مع في نموذج سيليكون لتحسين التنبؤات من الاستجابة للدواء على أساس خلفية طفرة وراثية معينة. يتم إنشاء نموذج على سقالة الخنازير decellularized أن يستنسخ خصائص الأنسجة محددة بشأن تكوين مصفوفة خارج الخلية والهندسة المعمارية بما في ذلك الغشاء القاعدي. نحن موحدة عبارة عن بروتوكول يتيح توليد أنسجة الورم الاصطناعي في غضون 14 يوما بما في ذلك ثلاثة أيام من العلاج من تعاطي المخدرات. تقدم مقالنا عدة وصفا تفصيليا ل3D-تلا تقنيات الفحص مثل تحديد مؤشر انتشار Ki67 تلطيخ، وموت الخلايا المبرمج من supernatants بواسطة M30-ELISA وتقييم الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، والتي هي أدوات مفيدة لتقييم فعالية المركبات العلاجية. نحن يمكن أن تظهر مقارنة ثقافة 2D الحد من الانتشار النووي في نموذجنا الورم 3D الذي هو تعصبإد إلى الحالة السريرية. وعلى الرغم من هذا الانتشار أقل من ذلك، توقع نموذج EGFR الردود المخدرات -targeted بشكل صحيح وفقا لحالة العلامات البيولوجية كما يتضح من المقارنة بين خطوط الخلايا السرطانية في الرئة HCC827 (-mutated EGFR، KRAS من النوع البري) وA549 (EGFR من النوع البري، KRAS - تحور) تعامل مع gefitinib التيروزين كيناز المانع (TKI). للتحقيق استجابات المخدرات من الخلايا السرطانية أكثر تقدما، ونحن يسببها EMT عن طريق العلاج طويل الأمد مع TGF-بيتا-1 وفقا لتقييم فيمنتين / تلطيخ المناعي لعموم cytokeratin. كان يعمل A-مفاعل حيوي تدفق لضبط الثقافة إلى الظروف الفسيولوجية، مما أدى إلى تحسن الجيل الأنسجة. وعلاوة على ذلك، نقدم لك مجموعة من التكامل الردود المخدرات على العلاج gefitinib أو مركب بيتا-1 التحفيز - موت الخلايا المبرمج، مؤشر انتشار وEMT - إلى منطقية في نموذج سيليكون. بالإضافة إلى ذلك، نفسر ردود كيف المخدرات من الخلايا السرطانية مع خلفية طفرة وراثية معينة والعدerstrategies ضد المقاومة يمكن التنبؤ. ونحن على ثقة بأن لدينا 3D في نهج المختبر وخاصة مع التوسع في سيليكون ويوفر قيمة إضافية لاختبار المخدرات قبل السريرية في ظروف أكثر واقعية مما كانت عليه في خلية ثقافة 2D.
المقدمة
تواجه صناعة الأدوية معدلات الاستنزاف عالية تصل إلى 95٪ في مجال علاج السرطان في المرحلة السريرية تسبب التكاليف الباهظة 1-5. وأحد أسباب هذا العجز هو حقيقة أنه في الوقت الراهن يتم تقييم فعالية من المركبات الجديدة المحتملة في العروض على نطاق واسع في مزارع الخلايا 2D من خطوط الخلايا السرطانية أو في النماذج الحيوانية. نماذج حيوانية لديها تعقيد أعلى ولكن هناك اختلافات مهمة بين الفئران والرجال 6،7. في العقد الماضي، تم إنشاء السرطان نماذج 3D باستخدام أساليب مختلفة من أجل سد الفجوة بين الثقافة 2D من خطوط الخلايا السرطانية ومجمع في 6،8،9 الجسم الحي الورم. وقد تبين أن تأثير البيئة 3D على ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. ثنائي الأبعاد (2D) خلية ثقافة
- تجاريا الحصول على خط الخلايا السرطانية HCC827 (DSMZ). ثقافة الرئة خط الخلية غدية HCC827 (EGFR تحور، KRAS من النوع البري) في RPMI-1640 تستكمل مع 20٪ FCS. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع. وتستخدم الخلايا حتى يتم التوصل مرور 20.
- تجاريا حصول ورم خط الخلية A549 (DSMZ). ثقافة سرطان الرئة خط الخلية A549 (EGFR من النوع البري، KRAS تحور) في RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FCS. نفذ الثقافة كما هو مذكور أعلاه. وت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
على أساس من السقالة SISmuc (الشكل 2A لC)، أنشأنا بروتوكول التشغيل الموحدة للتوليد والتحفيز والعلاج من نظام اختبار الورم 3D (الشكل 2D). هذا النموذج يمكن تحديد مؤشر انتشار والكمي لموت الخلايا المبرمج باستخدام M30-ELISA كما هو مبين في الشكل (1) والشكل (3)، على التوالي. ويبين الشكل 3 ممثل H & E تلطيخ A549 وHCC827 النماذج وقياس موت الخلايا المبرمج ممثل واحد مع gefit.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
أنشأنا جنبا إلى جنب في المختبر / في SILICO نظام اختبار الورم للتنبؤات العلاج الموجهة العلامات البيولوجية. نموذج في المختبر بتقييم مختلف الجوانب الهامة من الإجراءات مركب مثل التغيرات من انتشار الخلايا السرطانية والخلايا على خلفية طفرة وراثية محددة يمكن أيضا أن يكون محاكاة في سيليكون 17. هنا، نقدم بروتوكول موحد ل3D توليد نموذج الورم واختبار مركب بما في ذلك تقدير حجم انتشار وموت الخلايا المبرمج وإنشاء التنبؤية في نموذج سيليكون. .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
وقد رعت هذا البحث من قبل مركز التخصصات السريرية البحوث (IZKF، منحة BD247) من مستشفى جامعة فورتسبورغ وبرنامج بايرن صالح (الممنوحة لهايكه اليس).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| المفاعلات الحيوية | لهندسة الأنسجة والطب التجديدي ، W & uuml ؛ rzburg (ألمانيا) | إعداد المفاعل الحيوي | |
| BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji) | Jan Brocher ، Thorsten Wagner ، https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox | ||
| Cell | Crowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine ، W & uuml ؛ rzburg (GER) | للثقافة ثلاثية الأبعاد | |
| الثابتة CellDesigner | http://www.celldesigner.org/ | - | تم استخدام هذا البرنامج لرسم الشبكة. |
| محلول مخزون السترات العازلة (10x) | في الإنتاج | 42 جم / لتر أحادي هيدرات حامض الستريك ، 17.6 جم / لتر كريات هيدروكسيد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 6.0 ، المخزنة في RT. & nbsp ؛ | |
| حل عمل عازلة السترات | في الإنتاج | 10٪ محلول مخزون عازلة سترات في المياه منزوعة المعادن ، المخزنة في RT. | |
| أحادي هيدرات حامض الستريك | VWR ، دارمشتات (ألمانيا) | 1002441000 | المستخدم في زلات غطاء السترات العازلة |
| VWR ، دارمشتات (ألمانيا) | 631-1339 | ||
| DAPI Fluoromount-GTM< / sup> | SouthernBiotech ، برمنغهام (الولايات المتحدة الأمريكية) | SBA-0100-20 | |
| قواعد البيانات مثل KEGG و HPRD و QIAGEN (الجينات & amp; المسارات) | http://www.genome.jp/kegg/pathway.html ؛ http://www.hprd.org/ ؛ https://www.qiagen.com/de/geneglobe/ | - | تم استخدام قواعد بيانات مختلفة للأدب المعروف لإنشاء طوبولوجيا الشبكة. |
| أنثى Luer Lug نمط تي | ميدنت ، M & uuml. nster (GER) | FTLT-1 | إعداد المفاعل الحيوي |
| أنثى نمط الخيط Luer مع 5/16 "عرافة إلى 1 / 4-28 UNF الموضوع | Mednet ، M & uuml ؛ nster (GER) | SFTLL-J1A | إعداد المفاعل الحيوي |
| مصل عجل الجنين | Bio& بيع ، فوشت (ألمانيا) | FCS. ADD.0500 | غير معطل الحرارة |
| Gefitinib | Absource Diagnostics GmbH ، M & uuml ؛ nchen (GER) | S1025-100 مجم | 100 ملي محلول مخزون مع |
| قارورة DMSO Glas (شوت ، ألمانيا) مزودة بوصلة خرطوم زجاج | Weckert ، Kitzingen (GER) المصنوعة | حسب الطلب | |
| Histofix 4٪ (Paraformaldehyd) Carl | Roth ، Karlsruhe (GER) | P087.1 | |
| اقتران خرطوم | Mednet ، M & uuml ؛ nster (GER) | CC-9 | حاضنة إعداد المفاعل الحيوي |
| للمفاعلات الحيوية | كرسي هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، W & uuml ؛ rzburg (ألمانيا) | إعداد المفاعل الحيوي | |
| M30 CytoDeathTM< / sup> إليسا | بيفيفا ، بروما (السويد) | 10900 | |
| ذكر لور حلقة قفل متكاملة | Mednet ، M & uuml ؛ nster (ألمانيا) | MTLL230-J1A | إعداد المفاعل الحيوي |
| غرفة الرطوبة | مصنوعة | ||
| الفأر المضادة للسيتوكيراتين | سيجما ألدريتش ، ميونيخ (ألمانيا) ؛ | C2562-2ML | استنساخ C-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3 + M20 + A53-B / A2 ، تستخدم 1/100 للصمام |
| القابل للمسح المناعي التألق المناعي الخالي من الإبرة أنثى Luer | Mednet ، M & uuml ؛ nster (GER) | إعداد المفاعل الحيوي NVFMLLPC | ، لأخذ العينات ، حلقة O المعقمة بجاما |
| MVQ 10 أحمر 37 × 3 مم | Arcus Dichtelemente ، Seevetal (GER) | 21444 | حلقة O كبيرة ، إعداد المفاعل الحيوي |
| O-Ring MVQ 70 أحمر 27 × 2.5 مم | Arcus Dichtelemente ، Seevetal (GER) | 19170 | حلقة O صغيرة ، إعداد Bioreactor |
| قلم PAP | Dako ، هامبورغ (ألمانيا) | S002 | |
| البارافين | Carl Roth, Karlsruhe (GER) | 6642.6 | |
| المضخة التمعجية | Ismatec, Wertheim-Mondfeld (GER) | إعداد المفاعل | |
| الحيوي Phosphate Buffered Saline | Sigma-Aldrich, Munich (GER) | D8537-6x500ml | |
| مضخة أنبوب كاسيت | Ismatec ، Wertheim (ألمانيا) | IS 3710 | إعداد المفاعل الحيوي |
| الأرنب المضاد Ki67 | Abcam ، كامبريدج (المملكة المتحدة) | ab16667 | استنساخ SP6 ، يستخدم ل 1/100 ل IF |
| Rabbit anti Vimentin | Abcam ، كامبريدج (المملكة المتحدة) | ab92547 | مستخدم 1/100 لتقنيات IF |
| RPMI-1640 متوسطة | العمر ، دارمشتات (ألمانيا) | 61870-044 | دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام |
| أنبوب سيليكون | Carl Roth GmbH ، Karlsruhe (GER) | HC66.1 | إعداد المفاعل |
| الحيوي هيدروكسيد الصوديوم | Sigma-Aldrich ، M & uuml ؛ nchen (GER) | 30620-1KG-R | المستخدمة في المخزن المؤقت للسترات |
| SQUAD | http://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-تم | استخدام هذا البرنامج لإجراء عمليات المحاكاة شبه الكمية. | |
| فلتر هواء معقم ، حجم المسام 0.2 ومايكرو ؛ م | Sartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (ألمانيا) | 16596-HYK | إعداد المفاعل الحيوي |
| حقنة Luer Lok 5 مل | BD Biosciences ، هايدلبرغ (ألمانيا) | 309649 | لأخذ عينات المفاعل |
| الحيوي لوحات اختبار زراعة الأنسجة: 6- ، ؛ 12- ، 24- ، 96- جيدا | TPP تكنو منتجات البلاستيك AG ، Trasadingen (ألمانيا) | 92006 ، 92012 ، 92024 ، 92048 ؛ | |
| تحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-& beta; 1) مع | إشارات الخلية الحاملة ، محلول مخزون فرانكفورت (ألمانيا) | 8915LC | في عازلة السترات المعقمة درجة الحموضة 3.0 |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich ، M & uuml ؛ nchen (GER) | X100-1L | |
| Tween-20 | Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER) | P7949-500ml | لغسل المخزن المؤقت للتلطيخ المناعي الفلوري |
المراجع
- Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
- Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
- Arrowsmith, J.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
