مقالة منهجية

والأنسجة المشتركة 3D هندسيا

9.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53885

⸱

أبريل 6, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Tissue Engineering and Regenerative Medicine (TERM), University Hospital Wuerzburg, 2Department of Cardiothoracic Surgery, University Hospital Wuerzburg, 3Department of Bioinformatics, University Wuerzburg, 4Translational Center Wuerzburg, Fraunhofer Institute Interfacial Engineering and Biotechnology IGB

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

نقدم نموذجا ثلاثي الأبعاد لسرطان الرئة (3D) يعتمد على سقالة كولاجين بيولوجية لدراسة الحساسية تجاه العلاجات غير الصغيرة لسرطان الرئة (NSCLC). نعرض تقنيات قراءة مختلفة لتحديد مؤشر الانتشار وموت الخلايا المبرمج وحالة الانتقال الظهاري إلى اللحمة المتوسطة (EMT). يتم دمج البيانات التي تم جمعها في نموذج في السيليكو للتنبؤ بحساسية الأدوية.

الملخص

في هذه الدراسة، ونحن معا في المختبر 3D الرئة نموذج الورم مع في نموذج سيليكون لتحسين التنبؤات من الاستجابة للدواء على أساس خلفية طفرة وراثية معينة. يتم إنشاء نموذج على سقالة الخنازير decellularized أن يستنسخ خصائص الأنسجة محددة بشأن تكوين مصفوفة خارج الخلية والهندسة المعمارية بما في ذلك الغشاء القاعدي. نحن موحدة عبارة عن بروتوكول يتيح توليد أنسجة الورم الاصطناعي في غضون 14 يوما بما في ذلك ثلاثة أيام من العلاج من تعاطي المخدرات. تقدم مقالنا عدة وصفا تفصيليا ل3D-تلا تقنيات الفحص مثل تحديد مؤشر انتشار Ki67 تلطيخ، وموت الخلايا المبرمج من supernatants بواسطة M30-ELISA وتقييم الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT)، والتي هي أدوات مفيدة لتقييم فعالية المركبات العلاجية. نحن يمكن أن تظهر مقارنة ثقافة 2D الحد من الانتشار النووي في نموذجنا الورم 3D الذي هو تعصبإد إلى الحالة السريرية. وعلى الرغم من هذا الانتشار أقل من ذلك، توقع نموذج EGFR الردود المخدرات -targeted بشكل صحيح وفقا لحالة العلامات البيولوجية كما يتضح من المقارنة بين خطوط الخلايا السرطانية في الرئة HCC827 (-mutated EGFR، KRAS من النوع البري) وA549 (EGFR من النوع البري، KRAS - تحور) تعامل مع gefitinib التيروزين كيناز المانع (TKI). للتحقيق استجابات المخدرات من الخلايا السرطانية أكثر تقدما، ونحن يسببها EMT عن طريق العلاج طويل الأمد مع TGF-بيتا-1 وفقا لتقييم فيمنتين / تلطيخ المناعي لعموم cytokeratin. كان يعمل A-مفاعل حيوي تدفق لضبط الثقافة إلى الظروف الفسيولوجية، مما أدى إلى تحسن الجيل الأنسجة. وعلاوة على ذلك، نقدم لك مجموعة من التكامل الردود المخدرات على العلاج gefitinib أو مركب بيتا-1 التحفيز - موت الخلايا المبرمج، مؤشر انتشار وEMT - إلى منطقية في نموذج سيليكون. بالإضافة إلى ذلك، نفسر ردود كيف المخدرات من الخلايا السرطانية مع خلفية طفرة وراثية معينة والعدerstrategies ضد المقاومة يمكن التنبؤ. ونحن على ثقة بأن لدينا 3D في نهج المختبر وخاصة مع التوسع في سيليكون ويوفر قيمة إضافية لاختبار المخدرات قبل السريرية في ظروف أكثر واقعية مما كانت عليه في خلية ثقافة 2D.

المقدمة

تواجه صناعة الأدوية معدلات الاستنزاف عالية تصل إلى 95٪ في مجال علاج السرطان في المرحلة السريرية تسبب التكاليف الباهظة 1-5. وأحد أسباب هذا العجز هو حقيقة أنه في الوقت الراهن يتم تقييم فعالية من المركبات الجديدة المحتملة في العروض على نطاق واسع في مزارع الخلايا 2D من خطوط الخلايا السرطانية أو في النماذج الحيوانية. نماذج حيوانية لديها تعقيد أعلى ولكن هناك اختلافات مهمة بين الفئران والرجال 6،7. في العقد الماضي، تم إنشاء السرطان نماذج 3D باستخدام أساليب مختلفة من أجل سد الفجوة بين الثقافة 2D من خطوط الخلايا السرطانية ومجمع في 6،8،9 الجسم الحي الورم. وقد تبين أن تأثير البيئة 3D على تمايز الخلايا وأيضا على إشارات في العديد من الدراسات منذ سنوات (على سبيل المثال، عن طريق ميناء بيسيل) 10،11. اليوم، تتوفر العديد من النماذج ثقافة الخلية 3D مثل الثقافات كروي، الهلاميات المائية أو رقائق ميكروفلويديك 12-16. على الرغم من تساالنماذج الإلكترونية تعزز التعقيد مقارنة بأنظمة ثقافة 2D التقليدية، أنها تفتقر في الغالب المكروية الأنسجة التي من المعروف أن يكون لها آثار الداعمة للورم، وكذلك آثار المخدرات فعالية.

لمعالجة هذه المسألة، ولدت لنا نموذجا الورم 3D بناء على سقالة بيولوجية تسمى SISmuc (-الأمعاء الدقيقة، تحت المخاطية + الغشاء المخاطي) مشتق من الصائم الخنازير decellularized. وبالتالي، فإن هيكل الأنسجة وعناصر هامة من ECM مثل الكولاجين مختلفة فضلا عن هيكل الغشاء القاعدي يتم الاحتفاظ 17. هذه الميزة الفريدة أمر حاسم لتوليد نموذج ورم من الأورام السرطانية التي تنشأ من ظهائر ويشكلون نحو 80٪ من الأورام الصلبة. وعلاوة على ذلك، يتم خفض معدل انتشار في نموذجنا ورم الأنسجة المهندسة بالمقارنة مع معدلات مرتفعة بشكل مصطنع المحرز في ثقافة 2D. كما الانتشار هو معيار مهم في تقييم فعالية الدواء، يتم تمكين اختبار المخدرات في نموذجنا في أكثر مماثلةالشروط في الجسم الحي الأورام 17.

من أجل تقييم إمكانات نموذجنا للتنبؤ نجاعة الأدوية التي تعتمد على العلامات البيولوجية بشكل صحيح، ونحن البيانات الحالية هنا لمدة لمختلف خطوط الخلايا السرطانية في الرئة التي تختلف في حالة EGFR -biomarker بهم. وقد بدأ هذا الوضع تغيري يتم تحديدها بشكل روتيني للمرضى NSCLC. العلاجات المستهدفة مع TKIs مثل EGFR -inhibitor gefitinib ضد الأورام التي تحمل لتفعيل EGFR طفرة تظهر نتائج متفوقة مقارنة مع تلك البلاتيني العلاج الكيميائي 18-21.

أنشأنا عدة تقنيات تلا التي هي ذات الصلة لتقييم فعالية مركب. وعلاوة على ذلك، بعد TGF-بيتا-1 التحفيز ونحن قادرون على تحقيق أعمال المجمع في الخلايا السرطانية التي بدأت عملية EMT، والتي يعتقد أن تكون خطوة هامة في التحول السرطاني 22،23 والتي يتم توصيلها إلى resistan المخدراتم 24.

نموذج الورم 3D تسمح بمراقبة استجابات معينة من الخلايا للعلاجات مستهدفة، والعلاج الكيميائي، أو مزيج المخدرات مع التناقضات جيدة. لتعزيز وتسريع المخدرات الفرز ولمواجهة المقاومة، وهذا ما تكملها في محاكاة سيليكون. وبناء على عدد قليل من التجارب، واستجابة الورم يمكن التنبؤ في سيليكون بشأن نتائج لمجموعة كاملة من المخدرات ومجموعاتها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. ثنائي الأبعاد (2D) خلية ثقافة

  1. تجاريا الحصول على خط الخلايا السرطانية HCC827 (DSMZ). ثقافة الرئة خط الخلية غدية HCC827 (EGFR تحور، KRAS من النوع البري) في RPMI-1640 تستكمل مع 20٪ FCS. تغيير المتوسطة كل 2-3 أيام. انقسام الخلايا مرتين في الأسبوع. وتستخدم الخلايا حتى يتم التوصل مرور 20.
  2. تجاريا حصول ورم خط الخلية A549 (DSMZ). ثقافة سرطان الرئة خط الخلية A549 (EGFR من النوع البري، KRAS تحور) في RPMI-1640 تستكمل مع 10٪ FCS. نفذ الثقافة كما هو مذكور أعلاه. وتستخدم الخلايا حتى يتم التوصل مرور 20.
  3. اختبار الخلايا بشكل منتظم (كل 4-6 أسابيع) لالتلوث مثل التلوث الميكوبلازما.
  4. زراعة A549 أو HCC827 الخلايا على coverslips الزجاج
    1. ضع 1 ساترة زجاجية معقمة في كل بئر من 24 لوحة جيدا باستخدام الملقط.
    2. البذور 50،000 الخلايا السرطانية من كل من خطوط الخلايا في حجم 500 ميكرولتر في الآبار معوcoverslips الزجاج، على التوالي.
    3. ثقافة الخلايا حتى تصل إلى confluency من 70٪ في ظل ظروف ثقافة القياسية (37 درجة مئوية، 5٪ CO 2). خلال هذا الوقت، ونضح المتوسط ​​القديم باستخدام ماصة باستور وإضافة 500 ميكرولتر متوسطة جديدة كل 2-3 أيام للثقافة.

2. جيل من أنظمة ورم اختبار على البيولوجية الكولاجين سقالة

  1. ثابت شروط الثقافة
    1. توليد decellularized الصغيرة الأمعاء، تحت المخاطية + الغشاء المخاطي (SISmuc) وإصلاحه بين اثنين من حلقات معدنية، ما يسمى التيجان الخلية، كما هو موضح في نشرة السابق 25.
    2. البذور 100،000 خلايا إما HCC827 أو خلايا A549 في إجمالي حجم 500 ميكرولتر على جانب التجويف السابقة للامعاء الثابتة في التيجان الخلية.
    3. تسمح للخلايا السرطانية الالتزام لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية، 5٪ CO 2. إضافة 1 مل المتوسطة داخل التاج خلية و 1 مل خارج.
    4. ثقافة الورمنموذج في ظل ظروف ثابتة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في الحاضنة لمدة 14 يوما. تغيير الثقافة المتوسطة كل 2-3 أيام. لذلك، نضح في والمتوسطة باستخدام ماصة باستور وماصة 1 مل RPMI جديدة مع كمية مناسبة من FCS (A549: 10٪، HCC827: 20٪) داخل التاج الخلية و 1.5 مل من نفس المتوسطة خارج.
  2. شروط الثقافة ديناميكية
    1. إعداد نظام اختبار الورم مع المصفوفة decellularized داخل التيجان الخلايا والبذر الخلايا كما هو موضح تحت القسم الفرعي 2.1.1 إلى 2.1.3.
    2. ثقافة نموذج ورم في ظل ظروف ثابتة 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 في الحاضنة لمدة 3 أيام.
    3. تجميع مفاعل حيوي تعقيمها وإدراج SISmuc المصنف كما نشرت سابقا 25.
    4. ماصة 45 مل RPMI مع كمية مناسبة من FCS (A549: 10٪، HCC827: 20٪) في قارورة وتوصيل جهاز أخذ العينات خالية من الإبرة إلى نظام الأنابيب بين مفاعل حيوي وقارورة متوسطة.
    5. وضع مفاعل حيوي في الحاضنة، لأنه ربط مضخة والثقافة نموذج الورم لمدة 14 يوما إضافية مع تدفق المتوسط ​​ثابت (3 مل / دقيقة) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
    6. تغيير مستنبت كامل بعد 7 أيام. لذلك، نقل مفاعل حيوي من الحاضنة تحت غطاء تدفق الصفحي. نضح في المتوسط ​​في قارورة وسائل الإعلام باستخدام ماصة باستور. رفع مفاعل حيوي بينما الشفط للتخلص من المتوسط ​​في نظام الأنابيب. ماصة 45 مل متوسطة جديدة في قارورة. وضع مفاعل حيوي العودة إلى الحاضنة وتوصيله إلى المضخة.

3. علاج من ورم نموذج ثابت مع Gefitinib

  1. ثقافة نموذج ورم كما هو موضح في القسم 2.1.
  2. في يوم 11 من الثقافة، وإعداد RPMI / FCS مع 1 ميكرومتر gefitinib (2.5 مل لكل تاج الخلية). نضح في المتوسط ​​القديم من الآبار باستخدام ماصة باستور وإضافة 1 مل من استعداد RPMI / FCS / gefitinib داخل رانه خلية تاج و 1.5 مل من نفس المتوسطة خارج.
    ملاحظة: يمكن تخزين محلول المخزون gefitinib إذابة عند 4 درجة مئوية لمدة أسبوع واحد.
  3. تغيير المتوسطة في يوم 13 كما هو موضح تحت القسم الفرعي 3.2.

4. تحفيز للنموذج ورم ثابت مع TGF-بيتا-1 لEMT التعريفي

  1. ثقافة نموذج ورم كما هو موضح في القسم 2.1.
  2. في يوم 3 من الثقافة، وإعداد RPMI / FCS مع 2 نانوغرام / مل TGF-بيتا 1 مع الناقل (2.5 مل لكل تاج الخلية). نضح في المتوسط ​​القديم من الآبار باستخدام ماصة باستور وإضافة 1 مل من استعداد RPMI / FCS / TGF-بيتا-1 داخل التاج الخلية و 1.5 مل من نفس المتوسطة خارج. التغيير تستكمل المتوسطة مع TGF-بيتا-1 كل 2-3 أيام حتى يوم 14، كما هو موضح تحت 4.2.

5. قراءة الرافضة

  1. أخذ العينات للقياسات ELISA
    1. أخذ عينات من supernatants الساكنة (القسم 2.1) وديناميكية (القسم 2.2) الثقافة خلالالعلاج مع gefitinib (القسم 3) في أيام 11-14 من الثقافة كما هو مبين في الشكل (2). بالإضافة إلى ذلك، أخذ عينة قبل العلاج (T0).
    2. في ظل ظروف ثقافة ثابتة، تأخذ 100 عينة ميكرولتر من داخل التاج الخلية. في ظل ظروف ثقافة ديناميكية، المسمار الحقنة على جهاز أخذ العينات واتخاذ 1 مل المتوسطة من نظام مفاعل حيوي. تخزين جميع supernatants التي تم جمعها في -80 درجة مئوية حتى يتم تنفيذ ELISA.
  2. M30-ELISA لموت الخلايا المبرمج الكمي
    1. لتحديد الخلايا في supernatants أداء الفحص موت الخلايا وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. السماح لجميع الكواشف لتصل إلى RT قبل إجراء الفحص.
    2. دوامة جميع الكواشف. حل قرص غسل في 500 مل من الماء منزوع الأيونات الطازجة. تمييع HRP الاقتراني مع 9.2 مل من الاقتراني التخفيف العازلة والمزيج. ماصة 25 ميكرولتر من معيار أو عينة لكل بئر.
    3. إضافة 75 ميكرولتر من برنامج الصحة الإنجابية Conju المخففحل بوابة لكل بئر. تغطية لوحة واحتضان على شاكر لمدة 4 ساعات في RT. غسل لوحة يدويا، 5 مرات مع 250 ميكرولتر من محلول الغسيل أعد.
    4. إضافة 200 ميكرولتر من 3،3 '، 5،5'-Tetramethylbenzidine (TMB) الركيزة على كل جانب. احتضان في الظلام في RT لمدة 20 دقيقة. إضافة 50 ميكرولتر من توقف حل كل بئر. يهز صفيحة لمدة 10 ثانية وترك صفيحة لمدة 5 دقائق قبل قراءة الامتصاصية. تحديد الامتصاصية في 450 نانومتر في قارئ صفيحة. حساب منحنى القياسية والتركيزات في العينات باستخدام برنامج مناسب لمعالجة البيانات نوع ELISA مثل المنشأ.
  3. تلطيخ عينة
    1. تحديد، البارافين التضمين وإعداد القسم من نموذج 3D
      1. إصلاح SISmuc المصنف باستخدام 2.5 مل 4٪ بارافورمالدهيد (PFA) في تاج خلية لمدة 2 ساعة وتضمين ذلك في البارافين
      2. إعداد 3 ميكرومتر أقسام الأنسجة لتلطيخ كما نشرت سابقا25.
    2. تحديد الخلايا نمت في 2D شروط الثقافة
      1. عندما يتم التوصل إلى 70٪ التقاء، وغسل الخلايا المستزرعة coverslips على الزجاج في 24 لوحة جيدا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني واصلاحها مع 500 ميكرولتر 4٪ PFA / جيد لمدة 10 دقيقة.
      2. إزالة PFA وتخزين coverslips الزجاج في لوحة جيدا مغطاة برنامج تلفزيوني في 4 درجات مئوية حتى يتم تنفيذ تلطيخ.
    3. H & E تلطيخ
      1. وصمة عار على أقسام ممهى مع الهيماتوكسيلين / يوزين باعتبارها تلطيخ الشامل وفقا لبروتوكولات موحدة.
    4. تلطيخ مناعي من نموذج 3D
      1. لتلطيخ مناعي، إجراء استرجاع مستضد عن طريق وضع الشرائح deparaffinized وممهى في طنجرة البخار مع العازلة سترات مسخن (الرقم الهيدروجيني 6.0) لمدة 20 دقيقة.
        ملاحظة: انظر جدول المواد والمعدات وإعداد العازلة سيترات.
      2. نقل الشرائحلغسل العازلة (0.5 M عازلة برنامج تلفزيوني + 0.5٪ توين)، أقسام دائرة بالقلم PAP لتقليل حجم المطلوب للحلول تلطيخ ووضع الشرائح في غرفة الرطوبة.
      3. منع أقسام الأنسجة مع 5٪ مصل من الأنواع المضيفة من الأجسام المضادة الثانوية المستخدمة في القسم الفرعي 5.3.4.6 لمدة 20 دقيقة في RT.
      4. إزالة الحجب المصل من خلال استغلال بلطف الشرائح لالمناديل الورقية وتطبيق الأجسام المضادة الأولية للأقسام المحاصرة في تخفيف وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (أرنب مكافحة Ki67 1: 100، أرنب مكافحة فيمنتين 1: 100، والماوس المضادة لعموم cytokeratin 1 : 100). احتضان O / N عند 4 درجات مئوية. لالمزدوج تلطيخ، الأجسام المضادة الأولية من الأنواع المضيفة مختلفة يجب أن تستخدم.
      5. تغسل بعناية من الأجسام المضادة غير منضم مع العازلة غسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
      6. للكشف عن الارتباطات محددة ضد مستضد، وتطبيق الأجسام المضادة الثانوية في التخفيف 1: 400 إلى أقسام واحتضانها في RT لمدة 1 ساعة.
      7. يغسل بنك الاتحاد الوطنيالأجسام المضادة س اوند مع العازلة غسل ثلاث مرات لمدة 5 دقائق.
      8. جبل الشرائح مع الوسط المائي تحتوي على دابي إلى مباين نوى والسماح لهم الجاف O / N.
    5. تلطيخ مناعي من 2D الخلايا المستزرعة
      1. إزالة برنامج تلفزيوني وتغطية المصنفة زلات غطاء زجاجي مع 0.2٪ تريتون-X100 في برنامج تلفزيوني لمدة 5 دقائق لpermeabilization. غسل زلات غطاء زجاجي مع غسل العازلة (0.5 M عازلة برنامج تلفزيوني + 0.5٪ توين) لمدة 5 دقائق.
      2. تنفيذ الخطوات 5.3.4.3 ل5.3.4.7. تنفيذ جميع الخطوات في لوحة جيدا على منصة هزاز وإزالة المواد الكيميائية التي كتبها قلب اللوحة.
      3. لتركيب، بقعة قطرة من الوسط المائي تحتوي على دابي إلى مباين نوى على شريحة زجاجية غير المصقول ونقل زلة تغطية إليها مع الخلايا التي تواجه المتوسطة المتزايدة باستخدام ملقط. اتركها لتجف قبل التصوير.
  4. تقرير مؤشر انتشار
    1. أداء مناعيتلطيخ ضد Ki67 وفقا للبند 5.3.4. أو 5.3 5.
    2. التقاط صور الفلورسنت من المقاطع الأنسجة أو الخلايا المستزرعة 2D مع مجهر مقلوب. استخدام مرشحات مختلفة لالتقاط الصور من stainings دابي وstainings Ki67. لتقدير، استخدم 10 صور من أقسام 3D أو 5 صور 2D الثقافات (التكبير 20X) لكل حالة من أجزاء غير متداخلة من العينة.
    3. تحديد عدد من النوى وعدد من النوى إيجابية لKi67 في 2D
      1. عدد Ki67 النوى إيجابية يدويا باستخدام العداد الخلية المساعد للبرمجيات فيجي 26. لذلك، فتح الصورة وانقر على "الإضافات" → "تحليل" → "خلية مكافحة". اضغط على "تهيئة" وحدد نوع العداد. انقر على كل نواة إيجابية Ki67. يظهر عدد النقرات المقبل لنوع العداد المحدد.
      2. لعد الخلايا التلقائي من العدد الكلي للنواة إنشاء ماكرو باستخدام فيجي 27،28. صفةأوست الماكرو لكل تلطيخ وخلية الخط. التالية، مشاهدة مثال كيفية إنشاء ماكرو.
        1. بدء مسجل الماكرو. فتح دابي الصورة وتحويله إلى تنسيق 8 بت بالنقر على "صورة" → "النوع" → "8 بت". انقر على "تعزيز النقيض"، تعيين "المشبعة" ك "1" و "تطبيع".
        2. ضبط "unsharp قناع" لشحذ الصورة. استخدام "نصف قطر" من "1" و "قناع" من "0.60". انقر على "عتبة السيارات"، اختر الطريقة "RenyiEntropy" مع "كائنات بيضاء على خلفية سوداء" لbinarise الصورة.
        3. انقر على "الإضافات" → "BioVoxxel" → "ملامح غير منتظمة مستجمعات المياه" مع دائرة نصف قطرها تآكل "5" لفصل الخلايا. انقر فوق "تحليل" → "تحليل الجزيئات" وتعيين "حجم" إلى "0.02-إنفينيتي".
          ملاحظة: عدد الجسيمات / الخلاياهو مبين في الجدول الموجز كما التهم الموجهة إليه.
        4. انقر فوق "إنشاء" لحفظ ماكرو لتحليل مزيد من الصور.
    4. تحديد عدد من النوى وعدد من النوى إيجابية للKi67 في 3D يدويا كما هو موضح في القسم الفرعي 5.4.3.1.
    5. حساب مؤشر متوسط ​​انتشار (PI) وفقا للمعادلة التالية:
      figure-protocol-1
      n = عدد الصور (3D: 10، 2D: 5)

6. في السيليكو ورم نموذج الجيل ومحاكاة العلاج اريسا مكافحة في خلايا HCC827

  1. شبكة الجيل باستخدام برنامج تحليل الشبكات
    1. استخدام قواعد البيانات المعروفة مختلفة لتوليد شبكة الورم على أساس تجريبية المعلمات الهامة تلا والخلفية طفرية من خط الخلية HCC827.
    2. فتح برنامج تحليل الشبكة 21 لتصورشبكة.
      1. انقر فوق "ملف" → "جديد" نوع → "نماذج JoVE_tumor '→ انقر على زر" موافق "لتوليد شبكة جديدة. انقر على "ساحة المقربة الشمالية" → "موافق" لتصور مستقبلات في غشاء مزدوج. انقر على "البروتين عام" لتصور العقد (= البروتينات) على شكل مستطيلات → نوع 'EGFR' → انقر على زر "موافق". كرر ذلك لكل عقدة في الشبكة.
      2. تسمية العقد في الشبكة: انقر بزر الماوس الأيمن → "تغيير اللون والشكل ..." → حدد لعقد EGFR و (EGF-EGFR) رمز اللون "255،0،0" (اللون الأحمر)؛ لعقد ج-MET و (ج-MET) رمز اللون "0،255،0" (اللون الأخضر)؛ لرمز اللون gefitinib "255،255،0" (اللون الأصفر)؛ لرمز اللون PI3K-يلعنه "204204204" (لون رمادي فاتح)؛ لرمز اللون مجاهدي خلق، INH "102102102" (لون رمادي غامق). لجميع العقد الأخرى في الشبكة حدد رمز اللون4؛ 255،255،255 "(اللون الأبيض).
      3. انقر على "النمط الظاهري" لتصور معلمات تلا كما السداسي → 'انتشار' نوع → انقر على زر "موافق" → انقر بالزر الأيمن → "تغيير اللون والشكل ..." → حدد رمز اللون "255204204" (سمك السلمون اللون)؛ كرر هذا لموت الخلايا المبرمج المعلمة → حدد رمز اللون "255،51،204" (اللون البنفسجي).
      4. تصور الحواف (= التفاعلات): انقر فوق "الانتقال الدولة" لتنشيط (الأسهم)، اضغط على "المنع" لالموانع (الأسهم اضعافها)؛ كرر ذلك لكل التفاعل في الشبكة.
    3. انقر فوق "ملف" → "حفظ باسم ..." → نوع 'JoVE_tumor models.xml' → انقر على "حفظ" لحفظ شبكة الإشارات ولدت ك XML الشكل.
  2. في السيليكو محاكاة باستخدام SQUAD
    ملاحظة: SQUAD تمثل عشرالبريد طوبولوجيا الشبكة كنظام منفصل منطقي منطقي (AND، OR، NOT) ويقوم بتحليل حالة مستقرة. يعكس تحليل حالة الثبات والتوازن النظام والمسؤولية الملقاة على المحفزات الإنذار (على سبيل المثال، طلب الدواء أو الطفرة).
    1. فتح SQUAD 17 البرامج، انقر على زر "تحميل شبكة الاتصال" → تحميل "JoVE_tumor models.xml 'الملف. انقر على "تحليل تشغيل":
      ملاحظة: التالي، والتشكيلات تنطبق الدالة الأسية أن أقحم اتصال الشبكة المنطقية، والذي يسمح المحاكاة الديناميكية لسلوك الشبكة على مدار الساعة (الملونة منحنيات النشاط السيني).
    2. انقر على "خيارات متقدمة" → "Perturbator" لكتابة بروتوكول المحاكاة. محاكاة المقاومة المضادة EGFR: انقر فوق "بروتوكول تحرير"
      1. انقر على "اضطراب" → استخدام معيار "initialstate = SS-4" (حالة مستقرة 4) → انقر على "أضف" لإضافة "نبض المستمر جديد '→ سيlect المعلمة "دولة" → حدد الهدف "FLIP" → حدد الوقت "0" → قيمة الاختيار "0.4" → انقر على "موافق".
      2. كرر هذه: انقر على "أضف" → حدد المعلمة "دولة" → حدد الهدف "ج-MET" → وقت "0" → قيمة تحديد الاختيار "0.4" → انقر على "موافق". انقر على "أضف" → حدد المعلمة "دولة" → حدد الهدف "gefitinib" → حدد الوقت "0" → قيمة الاختيار "1" → انقر على "موافق".
      3. تعيين قيمة الدولة إلى عقدة النشطة (EGF-EGFR): انقر فوق "activenode" → انقر على "تحرير" → الدولة اختر "0.8" → انقر على "موافق". لجميع العقد الأخرى: انقر على "تحرير" → اختر الدولة "0" → انقر على "موافق". انقر على زر "موافق" لحفظ البروتوكول.
      4. عرض منحنيات معينة: انتقل إلى لوحة "خيارات" → حدد "(EGF-EGFR)"، "* (EGF-EGFR)"، "* مجاهدي خلق"، "caspases"، "(ج-MET)"، "PI3K" "gefitinib"، "موت الخلايا المبرمج"، "الانتشار"، "مجاهدي خلق-يلعنه" و "PI3K-يلعنه" لتمثيل رسومي. انقر على "تهيئة" → "تشغيل" لبدء محاكاة كاملة من استجابة النظام. انقر فوق "إعادة تعيين" لبدء محاكاة جديدة.
    3. محاكاة PI3K جنبا إلى جنب ومنظمة مجاهدي خلق العلاج المانع: انقر فوق "بروتوكول تحرير"
      1. استخدام المعلمة العقدة نفسها كما هو موضح تحت 6.2.2.1 - 6.2.2.3. انقر على "اضطراب" → انقر على "أضف" لإضافة "نبض المستمر جديد '→ حدد المعلمة" دولة "→ حدد الهدف" PI3K-يلعنه "→ حدد الوقت" 0 "→ قيمة الاختيار" 1 "→ انقر على" موافق ". انقر على "أضف"لإضافة "نبض المستمر جديد '→ حدد المعلمة" دولة "→ الهدف اختر" مجاهدي خلق-يلعنه "→ حدد الوقت" 0 "→ قيمة الاختيار" 1 "→ انقر على" موافق ".
      2. انقر على زر "موافق" لحفظ البروتوكول. انتقل إلى لوحة "خيارات": استخدام نفس العقد لتمثيل رسومي كما هو موضح تحت 6.2.2.4. انقر على "تهيئة" → "تشغيل" لبدء محاكاة كاملة من استجابة النظام. انقر على "إعادة تعيين" لإنهاء المحاكاة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

على أساس من السقالة SISmuc (الشكل 2A لC)، أنشأنا بروتوكول التشغيل الموحدة للتوليد والتحفيز والعلاج من نظام اختبار الورم 3D (الشكل 2D). هذا النموذج يمكن تحديد مؤشر انتشار والكمي لموت الخلايا المبرمج باستخدام M30-ELISA كما هو مبين في الشكل (1) والشكل (3)، على التوالي. ويبين الشكل 3 ممثل H & E تلطيخ A549 وHCC827 النماذج وقياس موت الخلايا المبرمج ممثل واحد مع gefit...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

أنشأنا جنبا إلى جنب في المختبر / في SILICO نظام اختبار الورم للتنبؤات العلاج الموجهة العلامات البيولوجية. نموذج في المختبر بتقييم مختلف الجوانب الهامة من الإجراءات مركب مثل التغيرات من انتشار الخلايا السرطانية والخلايا على خلفية طفرة وراثية محددة يمكن أيضا أن يكون محاكاة في سيليكون 17. هنا، نقدم بروتوكول موحد ل3D توليد نموذج الورم واختبار مركب بما في ذلك تقدير حجم انتشار وموت الخلايا المبرمج وإنشاء التنبؤية في نموذج سيليكون. ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

وقد رعت هذا البحث من قبل مركز التخصصات السريرية البحوث (IZKF، منحة BD247) من مستشفى جامعة فورتسبورغ وبرنامج بايرن صالح (الممنوحة لهايكه اليس).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
المفاعلات الحيويةلهندسة الأنسجة والطب التجديدي ، W & uuml ؛ rzburg (ألمانيا)إعداد المفاعل الحيوي
BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji)Jan Brocher ، Thorsten Wagner ، https://github.com/biovoxxel/BioVoxxel_Toolbox
CellCrowns Chair of Tissue Engineering and Regenerative Medicine ، W & uuml ؛ rzburg (GER)للثقافة ثلاثية الأبعاد
الثابتة CellDesignerhttp://www.celldesigner.org/-تم استخدام هذا البرنامج لرسم الشبكة.
محلول مخزون السترات العازلة (10x)في الإنتاج42 جم / لتر أحادي هيدرات حامض الستريك ، 17.6 جم / لتر كريات هيدروكسيد الصوديوم في الماء منزوع الأيونات ، درجة الحموضة 6.0 ، المخزنة في RT. & nbsp ؛
حل عمل عازلة الستراتفي الإنتاج10٪ محلول مخزون عازلة سترات في المياه منزوعة المعادن ، المخزنة في RT.
أحادي هيدرات حامض الستريكVWR ، دارمشتات (ألمانيا)1002441000المستخدم في زلات غطاء السترات العازلة
VWR ، دارمشتات (ألمانيا)631-1339
DAPI Fluoromount-GTM< / sup>SouthernBiotech ، برمنغهام (الولايات المتحدة الأمريكية)SBA-0100-20
قواعد البيانات مثل KEGG و HPRD و QIAGEN (الجينات & amp; المسارات)http://www.genome.jp/kegg/pathway.html ؛ http://www.hprd.org/ ؛ https://www.qiagen.com/de/geneglobe/-تم استخدام قواعد بيانات مختلفة للأدب المعروف لإنشاء طوبولوجيا الشبكة.
أنثى Luer Lug نمط تيميدنت ، M & uuml. nster (GER)FTLT-1إعداد المفاعل الحيوي
أنثى نمط الخيط Luer مع 5/16 "عرافة إلى 1 / 4-28 UNF الموضوعMednet ، M & uuml ؛ nster (GER)SFTLL-J1A إعداد المفاعل الحيوي
مصل عجل الجنينBio& بيع ، فوشت (ألمانيا)FCS. ADD.0500غير معطل الحرارة
GefitinibAbsource Diagnostics GmbH ، M & uuml ؛ nchen (GER)S1025-100 مجم100 ملي محلول مخزون مع
قارورة DMSO Glas (شوت ، ألمانيا) مزودة بوصلة خرطوم زجاجWeckert ، Kitzingen (GER) المصنوعةحسب الطلب
Histofix 4٪ (Paraformaldehyd) CarlRoth ، Karlsruhe (GER)P087.1
اقتران خرطومMednet ، M & uuml ؛ nster (GER)CC-9حاضنة إعداد المفاعل الحيوي
للمفاعلات الحيويةكرسي هندسة الأنسجة والطب التجديدي ، W & uuml ؛ rzburg (ألمانيا)إعداد المفاعل الحيوي
M30 CytoDeathTM< / sup> إليسابيفيفا ، بروما (السويد)10900
ذكر لور حلقة قفل متكاملةMednet ، M & uuml ؛ nster (ألمانيا)MTLL230-J1Aإعداد المفاعل الحيوي
غرفة الرطوبةمصنوعة
الفأر المضادة للسيتوكيراتينسيجما ألدريتش ، ميونيخ (ألمانيا)   ؛  C2562-2MLاستنساخ C-11 + PCK-26 + CY-90 + KS-1A3 + M20 + A53-B / A2 ، تستخدم 1/100 للصمام
القابل للمسح المناعي التألق المناعي الخالي من الإبرة أنثى LuerMednet ، M & uuml ؛ nster (GER)إعداد المفاعل الحيوي NVFMLLPC، لأخذ العينات ، حلقة O المعقمة بجاما
MVQ 10 أحمر 37 × 3 ممArcus Dichtelemente ، Seevetal (GER)21444حلقة O كبيرة ، إعداد المفاعل الحيوي
O-Ring MVQ 70 أحمر 27 × 2.5 ممArcus Dichtelemente ، Seevetal (GER)19170حلقة O صغيرة ، إعداد Bioreactor
قلم PAPDako ، هامبورغ (ألمانيا)S002
البارافينCarl Roth, Karlsruhe (GER)6642.6
المضخة التمعجيةIsmatec, Wertheim-Mondfeld (GER)إعداد المفاعل
الحيوي Phosphate Buffered SalineSigma-Aldrich, Munich (GER)   D8537-6x500ml
مضخة أنبوب كاسيتIsmatec ، Wertheim (ألمانيا)IS 3710إعداد المفاعل الحيوي
الأرنب المضاد Ki67Abcam ، كامبريدج (المملكة المتحدة)ab16667استنساخ SP6 ، يستخدم ل 1/100 ل IF
Rabbit anti VimentinAbcam ، كامبريدج (المملكة المتحدة)ab92547مستخدم 1/100 لتقنيات IF
RPMI-1640 متوسطةالعمر ، دارمشتات (ألمانيا)61870-044دافئ في 37 درجة ؛ C حمام مائي قبل الاستخدام
أنبوب سيليكونCarl Roth GmbH ، Karlsruhe (GER)HC66.1إعداد المفاعل
الحيوي هيدروكسيد الصوديومSigma-Aldrich ، M & uuml ؛ nchen (GER)30620-1KG-Rالمستخدمة في المخزن المؤقت للسترات
SQUADhttp://sbos.eu/docu/docu/SQUAD/doku.php.htm-تماستخدام هذا البرنامج لإجراء عمليات المحاكاة شبه الكمية.
فلتر هواء معقم ، حجم المسام 0.2 ومايكرو ؛ مSartorius Stedium Biotech, Gö ttlingen (ألمانيا)16596-HYKإعداد المفاعل الحيوي
حقنة Luer Lok 5 ملBD Biosciences ، هايدلبرغ (ألمانيا)309649لأخذ عينات المفاعل
الحيوي لوحات اختبار زراعة الأنسجة: 6- ،   ؛         12- ، 24- ، 96- جيداTPP تكنو منتجات البلاستيك AG ، Trasadingen (ألمانيا)92006 ، 92012 ، 92024 ، 92048   ؛
تحويل عامل النمو بيتا 1 (TGF-& beta; 1) معإشارات الخلية الحاملة ، محلول مخزون فرانكفورت (ألمانيا)8915LCفي عازلة السترات المعقمة درجة الحموضة 3.0
Triton X-100Sigma-Aldrich ، M & uuml ؛ nchen (GER)X100-1L
Tween-20Sigma-Aldrich, Mü nchen (GER)P7949-500mlلغسل المخزن المؤقت للتلطيخ المناعي الفلوري
كرسي المنزلي المنزلي حسب الطلب

المراجع

  1. Bhattacharjee, Y. Biomedicine Pharma firms push for sharing of cancer trial data. Science. 338, 29(2012).
  2. Kola, I., Landis, J. Can the pharmaceutical industry reduce attrition rates? Nat Rev Drug Discov. 3, 711-715 (2004).
  3. Arrowsmith, J. Trial watch: Phase II failures: 2008-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 328-329 (2011).
  4. Arrowsmith, J. Trial watch: phase III and submission failures: 2007-2010. Nat Rev Drug Discov. 10, 87(2011).
  5. Arrowsmith, J., Miller, P. Trial watch: phase II and phase III attrition rates 2011-2012. Nat Rev Drug Discov. 12, 569(2013).
  6. Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue. Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 839-845 (2007).
  7. Hartung, T. Toxicology for the twenty-first century. Nature. 460, 208-212 (2009).
  8. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 485-489 (2013).
  9. Stratmann, A. T., Dandekar, G., Nietzer, S. L. Three-dimensional in vitro tumor Models as an Alternative for Animal Models in Preclinical Studies. Pharm Ind. 75, 675-680 (2013).
  10. Gudjonsson, T., Ronnov-Jessen, L., Villadsen, R., Bissell, M. J., Petersen, O. W. To create the correct microenvironment: three-dimensional heterotypic collagen assays for human breast epithelial morphogenesis and neoplasia. Methods. 30, 247-255 (2003).
  11. Weaver, V. M., Fischer, A. H., Peterson, O. W., Bissell, M. J. The importance of the microenvironment in breast cancer progression: recapitulation of mammary tumorigenesis using a unique human mammary epithelial cell model and a three-dimensional culture assay. Biochem Cell Biol. 74, 833-851 (1996).
  12. Antoni, D., Burckel, H., Josset, E., Noel, G. Three-dimensional cell culture: a breakthrough in vivo. Int J Mol Sci. 16, 5517-5527 (2015).
  13. Kim, J., Tanner, K. Recapitulating the Tumor Ecosystem Along the Metastatic Cascade Using 3D Culture Models. Front Oncol. 5, 170(2015).
  14. Worthington, P., Pochan, D. J., Langhans, S. A. Peptide Hydrogels - Versatile Matrices for 3D Cell Culture in Cancer Medicine. Front Oncol. 5, 92(2015).
  15. Tanner, K., Gottesman, M. M. Beyond 3D culture models of cancer. Sci Transl Med. 7, 283ps9(2015).
  16. Stadler, M., et al. Increased complexity in carcinomas: Analyzing and modeling the interaction of human cancer cells with their microenvironment. Semin Cancer Biol. , (2015).
  17. Stratmann, A. T., et al. Establishment of a human 3D lung cancer model based on a biological tissue matrix combined with a Boolean in silico model. Mol Oncol. 8, 351-365 (2014).
  18. Mok, T. S., et al. Gefitinib or carboplatin-paclitaxel in pulmonary adenocarcinoma. N Engl J Med. 361, 947-957 (2009).
  19. Maemondo, M., et al. Gefitinib or chemotherapy for non-small-cell lung cancer with mutated EGFR. N Engl J Med. 362, 2380-2388 (2010).
  20. Rosell, R., et al. Erlotinib versus standard chemotherapy as first-line treatment for European patients with advanced EGFR mutation-positive non-small-cell lung cancer (EURTAC): a multicentre, open-label, randomised phase 3 trial. Lancet Oncol. 13, 239-246 (2012).
  21. Sequist, L. V., et al. Phase III study of afatinib or cisplatin plus pemetrexed in patients with metastatic lung adenocarcinoma with EGFR mutations. J Clin Oncol. 31, 3327-3334 (2013).
  22. Lee, J. M., Dedhar, S., Kalluri, R., Thompson, E. W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease. J Cell Biol. 172, 973-981 (2006).
  23. Wells, A., Yates, C., Shepard, C. R. E-cadherin as an indicator of mesenchymal to epithelial reverting transitions during the metastatic seeding of disseminated carcinomas. Clin Exp Metastasis. 25, 621-628 (2008).
  24. Janne, P. A., et al. AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer. N Engl J Med. 372, 1689-1699 (2015).
  25. Moll, C., et al. Tissue engineering of a human 3D in vitro tumor test system. J Vis Exp. , (2013).
  26. Funahashi, A., et al. CellDesigner 3.5: A Versatile Modeling Tool for Biochemical Networks. Proceedings of the IEEE. 96, 1254-1265 (2008).
  27. Auto Threshold(ImageJ)v.v1.15. , Source: http://fiji.sc/Auto_Threshold (2013).
  28. BioVoxxel Toolbox (ImageJ / Fiji). , Source: http://fiji.sc/BioVoxxel_Toolbox (2015).
  29. Buettner, R., Wolf, J., Thomas, R. K. Lessons learned from lung cancer genomics: the emerging concept of individualized diagnostics and treatment. J Clin Oncol. 31, 1858-1865 (2013).
  30. Engelman, J. A., et al. MET amplification leads to gefitinib resistance in lung cancer by activating ERBB3 signaling. Science. 316, 1039-1043 (2007).
  31. Mukohara, T., et al. Differential effects of gefitinib and cetuximab on non-small-cell lung cancers bearing epidermal growth factor receptor mutations. J Natl Cancer Inst. 97, 1185-1194 (2005).
  32. Noro, R., et al. Gefitinib (IRESSA) sensitive lung cancer cell lines show phosphorylation of Akt without ligand stimulation. BMC Cancer. 6, 277(2006).
  33. Gill, B. J., et al. A synthetic matrix with independently tunable biochemistry and mechanical properties to study epithelial morphogenesis and EMT in a lung adenocarcinoma model. Cancer Res. 72, 6013-6023 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

EGFR Gefitinib Ki67 M30 ELISA Boolean In Silico Model

مقالات ذات صلة