مقالة منهجية

بمساعدة الليزر تسليخ مجهري (لام) كأداة للالترانسكربتي التنميط من أنواع الخلايا الفردية

8.8K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/53916

⸱

مايو 10, 2016

 ,  , 
1University of Zürich & Zürich-Basel Plant Science Center

في هذه المقالة

ملخص

نقدم هنا بروتوكولا للتشريح الدقيق بمساعدة الليزر لأنواع معينة من الخلايا النباتية للتنميط النسخي. في حين أن البروتوكول مناسب لأنواع وأنواع مختلفة من الخلايا ، إلا أن التركيز ينصب على الخلايا التي يتعذر الوصول إليها بشكل كبير من السلالة الجرثومية الأنثوية المهمة للتكاثر الجنسي والاصطلاحي في جنس الصليبي Boechera.

الملخص

يتطلب فهم العمليات التنموية على المستوى الجزيئي نظرة ثاقبة لتنظيم النسخ ، وبالتالي النسخ ، على مستوى أنواع الخلايا الفردية. في حين أن الطرق الموضحة هنا قابلة للتطبيق بشكل عام على مجموعة واسعة من الأنواع وأنواع الخلايا ، يركز بحثنا على تكاثر النبات. تعتبر زراعة النباتات وإنتاج البذور ذات أهمية حاسمة لتغذية الإنسان. يعد الفهم التفصيلي للشبكات التنظيمية التي تحكم تكوين السلالة التناسلية (السلالة الجرثومة) وفي النهاية البذور شرطا مسبقا للتلاعب المستهدف بتكاثر النبات. على وجه الخصوص ، تعد هندسة apomixis (التكاثر اللاجنسي من خلال البذور) في نباتات المحاصيل بتحسينات كبيرة ، لأنها تؤدي إلى تكوين بذور نسيلة متطابقة وراثيا مع النبات الأم. وبالتالي ، فإن أنواع خلايا السلالة الجرثومية الأنثوية لها أهمية كبيرة لفهم وهندسة apomixis. ومع ذلك ، نظرا لأن الخلايا المقابلة مغروسة بعمق في الأنسجة الزهرية ، فمن الصعب جدا الوصول إليها للتحليلات التجريبية ، بما في ذلك النسخ الخاصة بنوع الخلية. للتغلب على هذا القيد ، يمكن عزل أقسام من الخلايا الفردية عن طريق التشريح الدقيق بمساعدة الليزر (LAM). بينما يسمح LAM بالاشتراك مع التنميط النسخي بتحديد الجينات والمسارات النشطة في أي نوع من الخلايا ذات الخصوصية العالية ، فإن إنشاء بروتوكول مناسب قد يكون أمرا صعبا. على وجه التحديد ، يمكن أن تتأثر جودة الحمض النووي الريبي الذي تم الحصول عليه بعد LAM ، خاصة عندما يتم استهداف خلايا صغيرة مفردة. للتحايل على هذه المشكلة ، أنشأنا سير عمل ل LAM ينتج عنه بشكل متكرر جودة عالية من الحمض النووي الريبي مناسب تماما لعلم النسخ ، كما يتضح هنا من عزل خلايا السلالة الجرثومية الأنثوية في Boechera الخارع. في هذا البروتوكول ، يتم وصف إجراءات تحضير الأنسجة و LAM ، أيضا فيما يتعلق باستخراج الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة.

المقدمة

في دراسات النسخي به على مستوى الأنسجة، وغالبا ما يتم حجب ترنسكربيتوم من أنواع الخلايا المتخصصة جدا ولكن نادرة من الخلايا المحيطة بها أكثر وفرة. مثال لمثل هذه أنواع الخلايا المتخصصة جدا هي خلايا النسب التناسلي للأنثى (الخط الجرثومي) في النباتات. يتم تحديد سلالة الجرثومية الإناث داخل البويضات النامية، والسلائف من البذور داخل وزيم من 1،2 زهرة. الخلية أبواغ الضخمة الأم (MMC) هي الخلية الأولى من سلالة الجرثومية الإناث. فإنه يخضع لالانقسام الاختزالي لتشكيل الرباعيات انخفاض megaspores. عادة، واحد فقط من هذه megaspores على قيد الحياة ويقسم ميتوتيكلي دون الانقسام السيتوبلازمي، أي في مخلى. يتم اتباع هذه mitoses من cellularization لتشكيل الأمشاج ناضجة، الذي يتكون عادة من أربعة أنواع الخلايا: ثلاثة antipodals، خليتين synergid، والبيض، والخلية المركزية. الخلايا البيض والمركزية هي الأمشاج الأنثوية التي تحصل المخصبة من قبل اثنين من الخلايا المنوية خلال ضوالإخصاب بلي لتؤدي إلى الجنين والسويداء من 1،2 البذور النامية. في النظام النموذجي نبات الأرابيدوبسيس thaliana الجنسي، فقط ~ 50 البذور تنمو في زهرة حين أن حوالي 50 - 80 وضع البذور في زهرة في جنس ترتبط ارتباطا وثيقا Boechera. وهكذا، فإن سلالة الجرثومية الإناث يتكون من عدد قليل من أنواع الخلايا المتخصصة للغاية، مما يجعلها نموذجا ممتازا لدراسة العمليات التنموية، مثل مواصفات الخلايا والتمايز.

وعلاوة على ذلك، يمكن رؤية واضحة حول العمليات التنظيمية الجينات التي تنظم تكاثر النبات تكون ذات قيمة تطبيقية. في النباتات، ويمكن أن يحدث كل من التكاثر الجنسي واللاجنسي من خلال البذور (تكاثر لاتعرسي). في حين التكاثر الجنسي يولد التنوع الجيني في عدد السكان، تكاثر لاتعرسي يؤدي إلى تشكيل ذرية نسيلي مطابق وراثيا للنبات الأم. لذلك، تكاثر لاتعرسي لديها امكانات كبيرة للتطبيقات في مجال الإنتاج الزراعي والبذور، وكذلك يمكن المورثات الأمهات حتى المعقدةالإبقاء دون تغيير على مدى أجيال عدة 3،4،5. بسبب تكاثر لاتعرسي لا تحدث طبيعيا في أي نوع من المحاصيل الرئيسية، هندسة تكاثر لاتعرسي في المحاصيل ذات 3،4،5 اهتمام كبير. ومع ذلك، فإن هذا الهدف على المدى الطويل هو من الصعب تحقيق لأنه لم يفهم الأساس الجيني والجزيئي الكامن وراء تكاثر لاتعرسي بتفصيل كاف 6.

للحصول على نظرة ثاقبة أساس النسخي تحكم الاستنساخ apomictic، خلية نوع محدد النسخي التنميط باستخدام تسليخ مجهري بمساعدة الليزر (لام) وتسلسل الجيل القادم (خ ع) يمثل طريقة فعالة جدا 7،8. وأول مرة يتم إنشاء LAM للبحوث الطبية الحيوية الحيوانية و. في السنوات القليلة الماضية، كما تم تطبيق لام لبيولوجيا النبات 6،9،10. وعلى النقيض من أساليب أخرى تسمح التنميط من أنواع الخلايا والأنسجة الفردية، لا لام لا تتطلب جيل من خطوط علامة 6،9،10. لذلك، يمكن أن يكون التطبيقكذب على أي خلية أو نسيج نوع دون معرفة الجزيئية السابقة. ميزة أخرى للام هو أنه يمكن تطبيقها على أي نوع من الخلايا طالما يمكن التعرف على الخلية في أقسام الجافة على أساس الموقف و / أو السمات الهيكلية. لام لديه ميزة إضافية أن تستخدم الأنسجة الثابتة، والذي يمنع التغييرات في الشخصية النسخي أثناء معالجة.

الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال، الأنسجة النباتية، ثابتة في تثبيتي غير يشابك قبل التضمين في شمع البارافين. التضمين في شمع البارافين ويمكن أن يتم يدويا، بعد البروتوكولات المعمول 9،11. ومع ذلك، فإن استخدام معالج النسيج الآلي للجفاف وتسلل مع الشمع النتائج بشكل عام في أعلى استنساخ من حيث الحفاظ على الحمض النووي الريبي الجودة والتشكل الأنسجة. كما تم استخدام استراتيجية بديلة من تضمين الأنسجة في الراتنج بنجاح لتحليل نوع معين من الخلايا LAM 8. ومع ذلك، فإن استخدام وسيلة أبواATED معالج الأنسجة مبنية الشمع هو وقتا طويلا جدا كفاءة، كما العديد من العينات يمكن معالجتها في تتطلب مرة واحدة كحد أدنى من التدريب العملي في الوقت المحدد. في حين تحدث عادة أي خسائر كبيرة في الحمض النووي الريبي الجودة أثناء التثبيت والتضمين، وإعداد الشرائح الرقيقة مع مشراح، وعلى وجه الخصوص، وتصاعد على frameslides تستخدم للام يبقى خطوة حاسمة للحفاظ على نوعية الحمض النووي الريبي. وقد سبق الإشارة إلى ذلك، وصفت استخدام نظام نقل الشريط أن يؤدي إلى تحسين نوعية الحمض النووي الريبي في هذه الخطوة 12. ومع ذلك، وهذا يضيف خطوة إضافية تستغرق وقتا طويلا أثناء إعداد الشرائح ويتطلب أيضا معدات خاصة. بروتوكول الأمثل هو موضح أدناه ينتج بتكاثر الحمض النووي الريبي التي هي ذات نوعية كافية لتحديد ملامح النسخي مع GeneCHIPs والجيل القادم التسلسل (خ ع) النهج 7،11،13،14. وبالإضافة إلى ذلك، مع المجهر تسليخ مجهري الليزر المستخدمة، ونقاء عالية من أنواع الخلايا المعزولة هو هزيمةأنتجت inely 7،11،13،14.

جنس Boechera هو نظام نموذجا ممتازا لدراسة الخطوات الرئيسية لاستنساخ apomictic. في Boechera، وقد تم تحديد مجموعة متنوعة من مختلف انضمام الجنسية وapomictic، ويمكن استخدامها لتحليلات مقارنة 15،16،17. في مقارنة بين ترنسكربيتوم خلية نوع محدد من الخلايا من سلالة الجرثومية الإناث من نبات الأرابيدوبسيس الجنسي وapomictic Boechera، حددنا الجينات والممرات التي يتم التعبير عنها بشكل مختلف، وبالتالي تحديد جوانب جديدة من العمليات التنظيمية التي تحكم تكاثر لاتعرسي 7. وبالإضافة إلى ذلك، التحقق منها هذه الدراسة مدى ملاءمة لام لنوع محدد خلية النسخي تحليل أنواع الخلايا الصغيرة ونادرة. لقد استخدمت بالفعل هذا البروتوكول لتحليل أنواع مختلفة من الخلايا في مجموعة متنوعة من أنواع النباتات، ولكن species- وقد تكون هناك حاجة تعديلات الأنسجة محددة للبروتوكول في بعض الحالات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول إعداد الأنسجة، ليزر بمساعدة تسليخ مجهري، واستخراج الحمض النووي الريبي لتحديد ملامح النسخي. دائما استخدام قفازات في جميع الخطوات من البروتوكول. دراسة والنظر في تعليمات السلامة لكل المواد الكيميائية المستخدمة. على وجه الخصوص، أن نضع في اعتبارنا أن زايلول هو ضار ويمكن ان تخترق قفازات والميثانول السامة. لجميع الأدوات المستخدمة، يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم وفقا لذلك.

1. إزالة آخر ريبونوكلياز من الأواني الزجاجية ومعدات أخرى

  1. قبل استخدامها، والتفاف أي الأواني الزجاجية في رقائق الألومنيوم قبل الخبز ل~ 8 ساعة على حرارة 180 درجة مئوية لضمان ريبونوكلياز عالية الجودة مجانا.
  2. علاج أي الأسطح المعدنية (على سبيل المثال، زوج من ملاقط)، وكذلك العمل على مقاعد البدلاء ولوحة التدفئة مع محلول تطهير ريبونوكلياز المناسب. بعد ذلك، وغسل الأسطح بالماء خالية من ريبونوكلياز لإزالة الحل إزالة التلوث. وفي وقت لاحق، وتنظيف الأسطح مع مزيد من ETOH 70٪.
  3. استخدام كل بلاسالمواد الاستهلاكية التشنج (على سبيل المثال، وأنابيب) العلامة التجارية الجديدة من دون أي معالجة مسبقة. إذا كان متوفرا، استخدام المواد الاستهلاكية البلاستيكية التي هي معتمدة إلى أن ريبونوكلياز مجانا.

2. الأنسجة التثبيت

  1. إعداد 10 مل من تثبيتي المزارعين (3: 1؛ ت / ت الإيثانول: حامض الخليك) في أنبوب 15 مل الطازجة على الجليد. (دائما إعداد تثبيتي المزارع الطازج قبل الاستخدام). وكبديل لذلك، والإيثانول غير يشابك مثبت: حامض الخليك (5: 1؛ ت / ت) يمكن استخدامها 18.
  2. استخدام زوج جيد من ملاقط لجمع البراعم في هذه المرحلة التنموية التي تهم. غمر فورا البراعم في تثبيتي الجليد الباردة. استخدام 10 مل من تثبيتي للتثبيت من ~ 20 براعم الزهور أو من نبات الأرابيدوبسيس أو Boechera ملاحظة: عند استخدام الأنواع النباتية مع الزهور الكبيرة فمن المستحسن أن تشريح الزهور بشفرة حلاقة لتوليد أجزاء أصغر قبل التثبيت.
    1. من أجل الحصول على نابتة عرسية ناضجة، تؤدي إلى إضعاف و2-3 أكبر براعم زهرة inflorescence 2 أيام قبل الحصاد.
  3. ملء الجزء السفلي من exsiccator مع الثلج. فتح الأنابيب التي تحتوي على عينات، على سبيل المثال، والزهور، ووضعها على الجليد، إما عن طريق وضعها مباشرة في الجليد في هذه الطريقة أنها لا يمكن أن تقع على أو باستخدام حامل المناسب. فراغ التسلل لمدة 15 دقيقة قبل إطلاقها من فراغ.
    1. تكرار تسلل فراغ مرة واحدة لمدة 15 دقيقة.
  4. الافراج عن فراغ وتخزينها بين عشية وضحاها (~ 12 ساعة) على الجليد. تغطية دلو الثلج مع غطاء أو رقائق الألومنيوم وتخزين دلو في غرفة C 4 درجات أو الثلاجة من أجل منع الجليد من الذوبان. ملاحظة: إطالة الوقت التثبيت غير مستحسن.

3. الأنسجة التضمين، رقيقة باجتزاء، وتصاعد على الشرائح للام

  1. الأنسجة التضمين.
    1. تبادل تثبيتي إلى 70٪ من الإيثانول أعدت مع الإيثانول النقي وريبونوكلياز المياه مجانا. ترك العينات على الجليد حتى مزيد من المعالجة. بدء embedding من العينات في نفس اليوم. في القضية رقم آلة معالجة الأنسجة متاح، انتقل إلى تضمين اليدوي كما هو موضح في أماكن أخرى 9،11 وتابع الخطوة 3.1.11.
    2. نقل بلطف عينات لأشرطة الأنسجة تضمين مع زوج من ملاقط. بحزم إغلاق أشرطة. خطوة حاسمة: تجنب تجفيف حتى الجزئي للعينة خلال هذه الخطوة. تجنب الضغط من عينات مع ملاقط.
      ملاحظة: لتسمية أشرطة يجب استخدام قلم رصاص، من الناحية المثالية عن طريق الكتابة على سطح مائل للكاسيت.
    3. تخزين كاسيت تضمين محملة براعم الزهور أو في الايثانول 70٪ حتى يتم نقل جميع المواد لأشرطة وآلة تضمين يمكن تحميل. لهذا الغرض، واستخدام حوض الزجاج تلطيخ مليئة الايثانول 70٪.
    4. إزالة سلة من المعالج الأنسجة من معوجة الجهاز ونقل أشرطة التضمين إلى سلة مع أسطح مائلة تواجه أعلى وفي نفس الاتجاه. CRIالخطوة TICAL: تنفيذ ذلك بسرعة لمنع أي جفاف الأنسجة. إذا تجهيز العديد من أشرطة التضمين في آن واحد، ضع سلة إلى ريبونوكلياز حاوية حرة المناسبة مليئة الايثانول 70٪ قبل تحميل العينات.
    5. وضع غطاء على السلة ووضع سلة العودة الى معوجة. إغلاق معوجة.
      ملاحظة: المعالج الأنسجة يجفف تلقائيا العينات، تغير المذيب إلى زايلول، ويفعل تسلل مع شمع البارافين ذاب. عادة، يتم ذلك بين عشية وضحاها.
    6. بدء تشغيل البرنامج من المعالج الأنسجة. الإعدادات القياسية الموصى بها هي 1 ساعة 70٪ ETOH، ثلاث مرات 1 ساعة 90٪ ETOH، ثلاث مرات 1 ساعة 100٪ ETOH، مرتين 1 ساعة 100٪ زايلول، مرة واحدة 1 ساعة 15 دقيقة 100٪ زايلول في درجة حرارة الغرفة، تليها تسلل مع شمع البارافين مرتين لمدة 1 ساعة ومرة واحدة لمدة 3 ساعة على 56 درجة مئوية (11).
      ملاحظة: للتأكد من أن محطة حجب جاهزة مع الشمع ذاب، تبديل الجهاز على عدة ساعات قبل بداية أواستخدام وظيفة موقت لتحديد وقت انطلاق تقريبي.
      ملاحظة: في حالة الأنسجة لا يمكن معالجة بعد ذلك على الفور، مرات حضانة أطول في شمع البارافين في 56 درجة مئوية والممكن بدلا من ساعة 3 عند 56 درجة مئوية. الرجوع إلى دليل المستخدم من الصك. عادة، فإن الأشرطة مع الأنسجة تبقى تلقائيا في ذاب الشمع حتى تتم الموافقة على "معوجة فارغة" القيادة. إذا لم يتم ذاب الشمع عند بدء تشغيل معالج الأنسجة، ويتم تعبئة معوجة مع الايثانول 70٪ ويبقى البرنامج على عقد حتى على استعداد للبدء.
    7. إفراغ معوجة ونقل على الفور العينات إلى حمام شمع البارافين عند 56 درجة مئوية في محطة حظر. إزالة الغطاء من السلة وتغطية حمام البارافين من محطة حجب مع غطائه.
    8. يسخن كومة العديد من صواني موازنة جديدة على سطح محطة الحجب إلى 56 درجة مئوية كما أن هناك أشرطة في السلة.
      ملاحظة: إن علامة دائمة مقاومة للالإيثانول يمكن استخدامهاد لتسمية الجزء السفلي من علب موازنة. لا ينصح علامات دائمة مقاومة للالأسيتون.
    9. باستخدام محطة الحجب، وملء علبة موازنة بلاستيكية جديدة قبل تحسنت مع شمع البارافين ذاب عند 56 درجة مئوية. رفع غطاء للحمام البارافين، والتقاط كاسيت واحد فقط في وقت واحد ونقل عينات من أشرطة للشمع البرافين السائل عند 56 درجة مئوية في علبة التوازن باستخدام زوج من ملاقط.
      خطوة حاسمة: تجنب أي تصلب شمع المحيطة العينة أثناء التعامل مع الكاسيت من خلال العمل بسرعة.
      1. ضع كل العينات وفقا لاحتياجات باستخدام إبرة التحضير قبل تصلب الشمع. عادة، يتم ترتيب العديد من الزهور في علبة موازنة متباعدة بشكل فردي حوالي 1 سم في كل اتجاه.
      2. كرر الخطوة 3.1.9 حتى يتم نقل جميع العينات.
    10. وضع سلة العودة إلى المعالج الأنسجة وتنظيف معوجة باستخدام البرنامج المناسب (يرجى الرجوع إلى دليل المستخدم).
    11. إيقاف معالج الأنسجة ومحطة حظر. تابع الخطوة 3.1.13.
    12. في حال لم آلة تسلل الأنسجة وليس محطة التضمين المتاحة، واستخدام فرن تسخين لإذابة شمع البارافين عند 56 درجة مئوية. على مقاعد البدلاء، وملء الشمع ذاب في صواني موازنة البلاستيكية، ونقل العينات إلى الشمع، واستخدام الإبر تمهيدا لوضع العينات.
    13. السماح للشمع البارافين لتتصلب في درجة حرارة الغرفة ل~ 1-3 ساعة قبل تخزين العينات في 4 درجات مئوية. ويمكن بعد ذلك عينات سيتم تجهيزها حديثا أو تخزينها لمدة تصل إلى عدة أشهر.
  2. إعداد أقسام وشرائح رقيقة للام.
    1. على طاولة ضوء ينير كتلة الشمع من أسفل، وإزالة شمع البارافين مع عينات من الصواني البلاستيكية المحيطة بها. تشريح خارج كتلة الشمع التربيعية التي تحتوي على الأنسجة، وعلى سبيل المثال، برعم أو زهرة، وذلك باستخدام ريبونوكلياز الحلاقة المجانية شفرة. لتحقيق هذا الهدف، ودائما توجيه عينات نحو الجزء العلوي من كتلة الشمع (انظر أيضا الشكل 1).
      1. إعداد كتل الشمع من جميع العينات التي ينبغي استخدامها للام في وقت واحد.
    2. جبل الكتل لمعالجة تضمين أشرطة مليئة شمع البارافين تصلب: تذوب قطعة صغيرة أو قطرة من شمع البارافين على طرف ملعقة المناسبة باستخدام مصباح الإيثانول واستخدام الشمع الساخن لإصلاح كتلة على الدعم (مع الأنسجة جزءا لا يتجزأ من في القمة).
      1. السماح للشمع لتتصلب لمدة 20 دقيقة على الأقل في 4 درجات مئوية.
    3. إزالة الشمع فائض المحيطة عينة بشفرة حلاقة على الطاولة الخفيفة. تأكد للحفاظ على سطح مربع مع ​​حواف متوازية (انظر الشكل 1).
    4. تعيين لوحة التدفئة إلى 42 درجة مئوية.
    5. جبل بأمان العينات إلى مبضع للفحص المجهري وإعداد 6-10 ميكرون أبواب سميكة. الرجوع إلى إرشادات الشركة المصنعة لاستخدام مبضع للفحص المجهري. ملاحظة: في حين أقسام أرق وغالبا ما تعطي قرار الهيكلي أفضل، كمية أكبر من الحمض النووي الريبي من higheويمكن الحصول على جودة ص مع أقسام سمكا. لخلايا Boechera تنضج نابتة عرسية نستخدم 7 ميكرون كما الافتراضي. تتحرك ببطء مع العينات على السكين مشراح غالبا ما يؤدي إلى أفضل الأنسجة.
    6. نقل دائما شرائط البارافين بطول حوالي 10-15 سم في صندوق من البلاستيك مع الكرتون الأسود في الأسفل قبل وضعهم في الشرائح لام.
    7. إذا كان ذلك ممكنا، قبل تحديد أجزاء من شرائط البارافين تحتوي على الخلوي أو أنسجة أنواع من الفائدة، على سبيل المثال، البويضات، تحت النطاق تشريح وتجاهل بقية.
  3. إعداد الشرائح للام.
    1. ضع المبلغ المطلوب من الشرائح مؤطرة المعدنية (عادة 5-10) مع سطح مستو على رأس على لوحة التدفئة.
    2. الماصة ~ 1-2 مل من ريبونوكلياز المياه مجانا على جزء من البلاستيك من الشريحة. باستخدام شفرة حلاقة، وقطع شرائط البارافين في قطع قصيرة من حوالي 4-5 سم طويلة بما يكفي لتغطي النوافذ البلاستيكية. Uحد ذاتها زوج من ملاقط وإبرة تمهيدا لوضع مثالي شرائط البارافين موازية لبعضها البعض على نوافذ من البلاستيك الشرائح. رفع بعناية الشريحة في نهاية واحدة لإزالة المياه ووضع الشرائح الظهر.
      1. بدلا من ذلك، وضع لوحة التدفئة تحت غطاء الكيميائية. تطبيق كمية صغيرة من الميثانول إلى جزء من البلاستيك من الشريحة فقط كافية لتبلل السطح (وهذا يمكن أن يؤدي إلى تجعد طفيف للشرائح). وضع شرائط البارافين على الشرائح.
        ملاحظة: لأسباب التسمم، وتجنب استخدام الميثانول إن أمكن. ومع ذلك، فإن استخدام الميثانول في هذه الخطوة لا تحسين نوعية الحمض النووي الريبي في حالة نوعية من قبل المتزايدة على المياه التي تحققت ليست كافية. ومن الجدير اختبار هذه البدائل في بداية مشروع جديد، حيث أن الحمض النووي الريبي الجودة تحقق يختلف مع نوع من الخلايا والأنواع قيد التحقيق.
    3. تجفيف الشرائح بين عشية وضحاها على لوحة التدفئة في 42 درجة مئوية لمدة 12 ساعة ~. تغطية لوحة التدفئة معغطاء البلاستيك الذي لا يمس الشرائح. تأكد من أن غطاء من البلاستيك لا يمنع تبادل الهواء. لهذا الهدف غطاء يمكن وضعها على علب الماصة أو ما شابه ذلك لرفعه.
      1. بدلا من ذلك، والحد من وقت التجفيف لمدة لا تقل عن ساعتين أو حتى تظهر الأنسجة جافة تماما. الحد من الوقت تشريح لجمع من قد يحسن نوعية الحمض النووي الريبي.
    4. تحت غطاء الكيميائية، وإزالة الشمع الشرائح 2 مرات لمدة 10 دقيقة في زايلول باستخدام حاملي الشرائح المناسبة. تأكد من أن يغرق بالكامل جزء من البلاستيك من كل شريحة فقط ولكن السماح بإزالة الشريحة عن طريق لمس نهاية أوسع من الإطار المعدني التي يتم الاحتفاظ بها جافة.
    5. السماح للشرائح لتجف لمدة 10 دقيقة ~ تحت غطاء الكيميائية قبل لام.
      ملاحظة: الشرائح يتم معالجتها فورا يمكن وضعها مرة أخرى على لوحة التدفئة في 42 درجة مئوية مع الأنسجة التي تواجه تصل لمدة تصل إلى عدة ساعات. هذا سيمنع أي الرطوبة من المساومة على جودة RNA حتى مزيد من المعالجة.

4. تسليخ مجهري بمساعدة الليزر (لام)

ملاحظة: الإجراء للام تختلف مع الأداة المستخدمة. يتم تكييفها بعض التفاصيل من هذا البروتوكول إلى أداة محددة والتكنولوجيا لجمع العينات على استخدام صنع غطاء من قوات كهرباء. وبالإضافة إلى ذلك، قد تختلف التفاصيل حتى بين الإصدارات المختلفة من البرنامج. يرجى الرجوع إلى تعليمات الشركة الصانعة وكتيبات المستخدم للحصول على وصف مفصل وتعليمات محددة بشأن الأدوات والبرمجيات.

  1. التبديل على الأجهزة للام (الكمبيوتر، المجهر، مربع عنصر التحكم ليزر).
  2. بدء تشغيل البرنامج توجيه المجهر والليزر.
  3. التبديل على الليزر عن طريق الضغط على زر المقابلة على السيطرة على المربع.
  4. وضع سقف (0.5 مل، دون موزع موجات الصوت بالتساوي) في حامل الغطاء ووضعه في الصك.
  5. دعم الشريحة لام مع شريحة زجاجية للفحص المجهري. تأكد من أن سطح مستو من الشريحة معالأنسجة المرفقة تواجه شريحة زجاجية.
  6. ضع الشريحة في الصك مع شريحة زجاجية تحت.
  7. حدد الهدف 4X. في البرنامج، وتحديد لتحريك الحد الأقصى للموقف "حتى"، والشروع في إجراء الفحص الشريحة.
  8. بحث عن طريق الشريحة وتحديد هياكل الفائدة. تحديد وحفظ مواقعهم على الشريحة لتكون قادرة على نقل مرة أخرى إلى الموضع الدقيق للخطوة القطع.
  9. تحديد الهدف المناسب (على سبيل المثال 40X أو 60X).
  10. إذا لزم الأمر، وضبط سرعة الليزر، والتركيز، وقوة الليزر، وكذلك معايرة حركة مرحلة بالرجوع إلى دليل المستخدم من الصك. مرة واحدة يتم تعيين حساب يصل للأنسجة معينة من الفائدة، ويمكن إعادة استخدامها الإعدادات.
  11. التحقق من موقف ليزر برصاصة واحدة عن طريق الضغط على زر "طلقة ليزر" للبرنامج، من الناحية المثالية في جزء من الغشاء دون الأنسجة.
    1. إذا لزم الأمر، معايرة موقف الليزر باتباع عشرتعليمات الإلكترونية المصنعة للصك.
  12. تحقق من معايرة الهدف عن طريق تحريك هيكل واضحا للجميع الزوايا الأربع من نافذة البرنامج على الشاشة، والحفاظ على زر الفأرة الأيمن الضغط عليه. تأكد من أن الموقف من ناحية فيما يتعلق هيكل واضح هو نفسه في جميع الزوايا الأربع. إلا معايرة الأهداف التالية دليل البرامج.
  13. مع سقف في موقف "أسفل"، استخدام أداة "اليد القلم 'للاحتفال حدود نوع من الخلايا أو الأنسجة من الاهتمام، على سبيل المثال، خلية البويضة. تشريح الخلية في المصالح مع ليزر عن طريق الضغط على 'قطع'. ملاحظة: في كثير من الأحيان، باجتزاء احتياجات أن يتكرر إذا كانت الحدود حول الخلية لم يكن تشريح تماما في آن واحد. في هذه الحالة، فمن المستحسن لوضع برنامج للقيام اثنين من يكرر القسم كمعيار تلقائيا.
  14. رفع الغطاء والانتقال إلى موقف حفظها المقبل مع هيكل من الفائدة. كرر الخطوة 4.13من إجراء تشريح الأقسام الخلية التالية حتى يتم جمع كل خلايا الفائدة من شريحة واحدة. تأكد من وضع الغطاء في هذه الطريقة أن القسم الجديد العصي لموقف فارغة على الغطاء.
    ملاحظة: من المستحسن لعزل أكبر قطعة من الأنسجة (على سبيل المثال، أجزاء من الزهور كلها أو أجزاء منها) من كل شريحة بعد عزل أقسام خلية واحدة على سقف جديد. هذه يمكن استخدامها لمراقبة الجودة الحمض النووي الريبي.
  15. إزالة الشريحة وتواصل مع الشريحة التالية بتكرار الخطوات 4،4-4،9 و4،13-4،14.
  16. وقد تم عزل كرر الخطوة 4.15 والخطوات ذات الصلة الى أن أنواع الخلايا من الاهتمام من كافة الشرائح. ملاحظة: لا ينصح لموسم الحصاد لمدة أطول من ~ 4-5 ساعة على نفس الغطاء.
  17. تفقد البصر سطح الغطاء بعد LAM استبعاد التلوث غير محددة من العينة. في حين أن الأنسجة غير تشريح محمية مع احباط، ويمكن أن الغبار عصا على السطح بسبب التصاق كهرباء.
    1. تس بصريا تفقد كأب، وإزالة الشريحة من الصك. وضع حامل غطاء في موقف 'أسفل' وافحص السطح مع الهدف 4X.
    2. في حالة قطع صغيرة من الغبار مرئية، إزالتها مع صغيرة (2 ميكرولتر) ماصة. بدلا من ذلك، جبل الشريحة مرة أخرى على الصك، ضع الغطاء على جزء خالية من الشريحة (لا الأنسجة)، وتدمر تماما من التلوث باستخدام الليزر.
  18. قبعات وثيقة وتجميد الأجزاء الجافة في -80 درجة مئوية حتى استخدامها مرة أخرى. إذا لزم الأمر، والعينات ويمكن تخزينها لمدة تصل إلى عدة أسابيع. ومع ذلك، وانطلاقا بسرعة في هذه الخطوة ينصح.

5. عزل الحمض النووي الريبي ومراقبة الجودة

ملاحظة: RNA يمكن عزلها بأي طريقة مناسبة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي. في هذا البروتوكول وصفت استخدام طقم RNA العزلة المحددة لكميات صغيرة من الحمض النووي الريبي. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.

  1. استخدام أنابيب مع العينة المرفقة لغطاء إما مباشرة أو بعد إزالة من -80 درجة مئوية.
    1. فتح الأنابيب والماصة بعناية 11 ميكرولتر من استخراج العازلة على جدار كل أنبوب باستخدام نصائح فلتر. تغيير نصائح بين العينات.
    2. إغلاق الغطاء ويهز استخراج العازلة وصولا الى الحد الأقصى من الأنبوب.
    3. وضع أنابيب مع غطاء أسفل في فرن مسخن التدفئة إلى 42 درجة مئوية. احتضان لمدة 30 دقيقة بعد تعليمات الشركة الصانعة.
  2. اتبع إرشادات الشركة المصنعة لإعداد عمود وجمع استخراج في الجزء السفلي من الأنابيب.
    1. إذا كانت المادة من الغطاء أكثر من واحد يجب أن تكون مجتمعة في عينة واحدة، والمضي قدما بخطوات 5.1.1 - 5.1.2 بشكل فردي لكل أنبوب / سقف.
    2. بعد ذلك، تجميع مقتطفات لعينة واحدة في أنبوب واحد وقياس كمية استخراج المجمعة مع ماصة قبل إضافة مبلغ مساو من ETOH (انظر تعليمات الشركة الصانعة).
    3. تأكد من أن كمية إتوأضاف OH قبل تحميل العمود يساوي حجم استخراج المجمعة.
    4. بعد هطول الأمطار RNA مع ETOH، والمضي قدما بسرعة في التحميل من الأعمدة التالية تعليمات الشركة الصانعة. مواصلة بروتوكول مع خطوة الطرد المركزي 100 x ج.
    5. بعد أن تم تمرير محتويات كل أنبوب جمع من خلال العمود، نفذ خطوة الطرد المركزي 16000 x ج لمدة 30 ثانية لإزالة إرشادات الشركة المصنعة التدفق من خلال التالي ل.
    6. تواصل مع استخراج الحمض النووي الريبي وتنقية باتباع تعليمات الشركة الصانعة.
    7. بعد تحميل وشطف العازلة إلى العمود السماح العمود لاحتضان لمدة 1 دقيقة. الاستمرار في تحميل هذه الانابيب بداخل الطرد المركزي اتباع التعليمات في تعليمات الشركة الصانعة. ملاحظة: خطوة الطرد المركزي إضافية لمدة 1 دقيقة في 100 x ج قبل شطف كما هو مشار إليه في البروتوكول يمكن أن تزيد من كفاءة شطف.
  3. استخراج الحمض النووي الريبي من تابعسيادة القانون والأمن (أقسام الأنسجة أكبر) لمراقبة الجودة RNA الخطوات التالية 5.1 إلى 5.2.7 من هذا البروتوكول.
  4. لRNA تحميل مراقبة الجودة 1 ميكرولتر الحمض النووي الريبي مجموع مخفف من كل عينة السيطرة على Bioanalyzer باستخدام الحمض النووي الريبي بيكو رقاقة باتباع إرشادات الشركة المصنعة.
    ملاحظة: استخراج الحمض النووي الريبي يمكن أن تستخدم لتضخيم الخطي والتحليل Transcriptome على استخدام المجهرية أو RNA تسلسل 7،11،13،14. من الناحية المثالية، ينبغي أن يذكر في مراقبة الجودة والنزاهة عدد RNA (رين) من 7. ما لا يقل عن عدد من الموردين توفر مجموعات مناسبة لالتضخيم، وهناك أمثلة مناسبة في 9.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

تتم تحضير عينة ولام في خطوات متتالية

وثمة حاجة إلى عدد من الخطوات المتتالية للتحضير الحمض النووي الريبي لتحليل النسخي من أنواع الخلايا التي اختارها لام (الشكل 1). ويبدأ هذا الحصاد من الزهور والتثبيت على الفور للتأكد من أن سكان RNA لم يتغير بعد الحصاد. تم تضمين الأنسجة، ومقطوع، والتي شنت على الشرائح. وهذا يسمح للعزل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

بروتوكول غير مناسبة للخلية مختلفة وأنواع الأنسجة

لام جنبا إلى جنب مع Transcriptome على التحليلات التي المجهرية أو RNA تسلسل هو أداة قيمة لاكتساب نظرة ثاقبة لأنماط معينة من النشاط الجيني تنظيم العمليات التنموية أو الفسيولوجية 7-11،13،14. ومع ذلك، فإن ملاءمة هذه الطريقة لأي نوع خلية معينة تعتمد بشكل كبير على القضايا الهيكلية. تحتاج الخلية لتكون مرئية بشكل واضح ويسهل تبين بشكل لا لبس فيه ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر Timothy F. Sharbel (IPK Gatersleben) على توفير بذور Boechera divaricarpa وشارون كيسلر (جامعة أوكلاهوما) للقراءة النقدية والتدقيق اللغوي. يتم دعم العمل على تحليلات النسخ الخاصة بنوع الخلية لدراسة تطور الطور المشيجي والعميمكس في مختبر UG من قبل جامعة زيورخ ، من خلال زمالة "Deutsche Forschungsgemeinschaft" ومشروع ماري كوري IDEAGENA إلى AS ، من خلال منح من "Staatssekretariat für Bildung und Forschung" في إطار عمل التكلفة FA0903 (إلى UG و AS) والمؤسسة الوطنية السويسرية (إلى UG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الإيثانولVWR1،009،861،000المطلق EMPROVE Ph EUR ، BP ، USP
15 مل أنابيب الطرد المركزي الصقرVWR62406-200
2100 محلل حيويAgilentG2939AA
حمض الخليكApplichemA3686،2500100٪ درجة البيولوجيا الجزيئية
تقنيات الحياة المائية الخالية من النوكليزAM9932
ASP200 SLeica14048043624معالج المناديل  
الورق المقوىفي متاجر الورق الخاصة
الإطار الخالية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي ،Micro Dissect GmbH1 ، 4 & micro ؛ م غشاء PET. يمكن أيضا شراؤها من Leica
Dumond FallpsActimed0208-5SPSF-PS
الإيثانول
ExsiccatorSigma-AldrichZ354074-1EANalgene Vaccuum Dessicator أو نصائح
تصفية المعدات المماثلة 10   ؛ ومايكرو. لAL60010 Axon Lab AGبنصائح مرشح مماثلة
1,000 & nbsp ؛ ومايكرو. لAxon Lab AGAL60010بنصائح مرشح مماثلة
20 & nbsp ؛ ومايكرو. لAL60020 Axon Lab AGبنصائح مرشح مماثلة
200 & nbsp ؛ ومايكرو. لAL60200 Axon Lab AGبأطراف مماثلة
ملقط الدقةVWE232-1221
حامل الشريحة الزجاجيHuber & Co.AG10.0540.01F & auml ؛ RBEKÄ sten nach Hellendahl
الزجاج تلطيخ الحوضالصغير Huber & Co.AG10.0570.01F & auml; rbekasten
وحدة تضمين البارافين الساخنة LeicaLeicaLeica EG 1150 Hمحطة حجب ، أجهزة مماثلة مناسبة
طاولة التدفئة والتجفيفMedax15501النماذج الأخرى و / أو الموردين مناسبة
دلو الثلجVWR دلو الثلج مع غطاء & nbsp ؛10146-184دلاء مماثلة مناسبة على قدم المساواة
طاولة ضوءUVP شركة جينا التحليليةTW-26  محول الضوء الأبيض
شريحة المجهرThermo Scientific10143562CEمقطوعة
شفرة ميكروتومThermo ScientificFEAHS35S35 microtome blade يمكن التخلص
منها MMI Cell Cut Plus InstrumentMMI (الآلات والصناعات الجزيئية)
Microfuge غير لاصقة وخالية من RNAse ، تقنيات حياة 2 ملAM12475 Paraplast
X-TRARothX882.2لتقنيات
حياة طقم عزل الحمض النووي الريبي PicoPureKIT0204مجموعة عزل الحمض النووي الريبي Arcturus PicoPure
صواني موازنة بلاستيكيةSemadeni AG2513
صندوق بلاستيكيSemadeni AG2971غطاء بلاستيكي Plastikdose
PS للوحةتحضير محلية
الصنع VWR631-7159
RNA 6000 Pico KitAgilent5067-1513
RNAse Free MicrofugeTubes تقنيات الحياةAM12400
RNAse ZAP Depollution Solutionsتقنيات الحياةAM9780
Microtome الدوارة شبه الآلية LeicaRM2245المماثلة مناسبة بنفس القدر
كاسيت شاشة Tissue LocHisto Thermo ScientificC-1000_AQأشرطة مماثلة من الموردين الآخرين مناسبة
أنابيب بغطاء لاصق ، بدون ناشر 500 & مايكرو ؛ l MMI (الآلات والصناعات الجزيئية)50204
Xylol (Isomere) ROTIPURANVWR4436.2دقيقة 99٪ ، PA ، ACS ، ISO SP
تضمين الكاسيتLeica14039440000Leica Jet Cassette I بدون غطاء
فرن عالميMemmertUF55نماذج أخرى و / أو موردين مناسبون
يمكن شراء الأسود ، وشرائح مصباح يمكن استبدال يمكن استبدال يمكن استبدال يمكن استبدال حواف أنابيب التسخين إبرة أجهزة عملية

المراجع

  1. Maheshwari, P. An Introduction to the Embryology of Angiosperms. , McGraw-Hill. New York. (1950).
  2. Willemse, M. T. M., Van Went, J. L. The female gametophyte. Embryology of Angiosperms. Johri, B. M. , Springer-Verlag. Berlin. 159-196 (1984).
  3. Koltunow, A. M., Bicknell, R. A., Chaudhury, A. M. Apomixis: Molecular strategies for the generation of genetically identical seeds without fertilization. Plant Physiol. 108, 1345-1352 (1995).
  4. Vielle-Calzada, J. P., Crane, C., Stelly, D. M. Apomixis - the asexual revolution. Science. 274, 1322-1323 (1996).
  5. Grossniklaus, U., Koltunow, A., van Lookeren Campagne, M. A bright future for apomixis. Trends Plant Sci. 3, 415-416 (1998).
  6. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: molecular insights define common concepts and illustrate developmental flexibility in apomictic and sexual reproduction. Development. 142, 229-241 (2015).
  7. Schmidt, A., et al. Apomictic and sexual germline development differ with respect to cell cycle, transcriptional, hormonal and epigenetic regulation. PLOS GENET. 10, e1004476(2014).
  8. Okada, T., et al. Enlarging cells initiating apomixis in Hieractium praealtum transition to an embryo sac program prior to entering mitosis. Plant Physiol. 163, 216-231 (2013).
  9. Wuest, S. E., Grossniklaus, U. Laser-assisted microdissection applied to floral tissues. Methods Mol Biol. 1110, 329-344 (2014).
  10. Wuest, S. E., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Cell-specific expression profiling of rare cell types as exemplified by its impact on our understanding of female gametophyte development. Curr Opin Plant Biol. 16 (1), 41-49 (2013).
  11. Wuest, S. E., et al. Arabidopsis female gametophyte gene expression map reveals similarities between plant and animal gametes. Curr Biol. 20, 1-7 (2010).
  12. Cai, S., Lashbrook, C. C. Laser capture microdissection of plant cells from tape-transferred paraffin sections promotes recovery of structurally intact RNA for global gene profiling. Plant J. 48 (4), 628-637 (2006).
  13. Schmidt, A., Wuest, S. E., Vijverberg, K., Baroux, C., Kleen, D., Grossniklaus, U. Transcriptome analysis of the Arabidopsis megaspore mother cell uncovers the importance of RNA helicases for plant germ line development. PLOS BIOL. 9, e1001155(2011).
  14. Schmid, M. W., Schmidt, A., Klostermeier, U. C., Barann, M., Rosenstiel, P., Grossniklaus, U. A powerful method for transcriptional profiling of specific cell types in eukaryotes: laser-assisted microdissection and RNA sequencing. PLOS ONE. 7, e29685(2012).
  15. Mau, M., et al. Hybrid apomicts trapped in the ecological niches of their sexual ancestors. Proc Natl Acad Sci.U S A. 112 (18), 2357-2365 (2015).
  16. Aliyu, O. M., Seifert, M., Corral, J. M., Fuchs, J., Sharbel, T. F. Copy number variation in transcriptionally active regions of sexual and apomictic Boechera. demonstrates independently derived apomictic lineages. Plant Cell. 25 (10), 3808-3823 (2013).
  17. Corral, J. M., et al. A conserved apomixis-specific polymorphism is correlated with exclusive exonuclease expression in premeiotic ovules of apomictic boechera species. Plant Physiol. 163 (4), 1660-1672 (2013).
  18. Deeken, R., Ache, P., Kajahn, I., Klinkenberg, J., Bringmann, G., Hedrich, R. Identification of Arabidopsis thaliana. phloem RNAs provides a search criterion for phloem-based transcripts hidden in complex datasets of microarray experiments. Plant J. 55, 746-775 (2008).
  19. Schmid, M. W. Genome Scale Quantitative Biology in Arabidopsis thaliana. , University of Zürich. PhD Thesis 40-104 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA Boechera Apomixis

مقالات ذات صلة