Method Article

تطوير في المختبر الفحص لتقييم مقلص وظيفة الخلايا الجذعية الوسيطة التي خضعت طلائي-الوسيطة الانتقالية

DOI:

10.3791/53974

⸱

June 10th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف تطوير وتطبيق مقايسة تقلص الهلام لتقييم وظيفة الانقباض في الخلايا الوسيطة التي خضعت للانتقال الظهاري الوسيط.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
غالبا ما يشارك التليف

في التسبب في الأمراض المزمنة التقدمية المختلفة مثل مرض الرئة الخلالي. السمة المميزة المرضية هي تكوين بؤر الخلايا الليفية ، والتي ترتبط بشدة المرض. يقترح أن تكون الخلايا الوسيطة التي تتكون من بؤر الخلايا الليفية مشتقة من عدة مصادر خلوية ، بما في ذلك الخلايا الليفية داخل الرئة المقيمة في الأصل والخلايا الليفية المنتشرة من نخاع العظام. في الآونة الأخيرة ، من المفترض أيضا أن تساهم الخلايا الوسيطة التي خضعت للانتقال الظهاري الوسيط (EMT) في التسبب في التليف. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تحفيز EMT عن طريق تحويل β عامل النمو ، ويمكن تعزيز EMT بواسطة السيتوكينات المؤيدة للالتهابات مثل عامل نخر الورم α. يعد اختبار تقلص الجل نموذجا مثاليا في المختبر لتقييم الانقباض ، وهو أحد الوظائف المميزة للأرومات الليفية ويساهم في إصلاح الجروح والتليف. هنا ، يتم إثبات تطوير مقايسة تقلص الهلام لتقييم القدرة الانقباضية للخلايا الوسيطة التي خضعت ل EMT.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وتشارك التليف في التسبب في أمراض مختلفة التقدمية المزمنة، مثل مرض الرئة الخلالي، تليف القلب، وتليف الكبد والفشل الكلوي المحطة، التصلب الجهازي، وأمراض المناعة الذاتية 1. بين أمراض الرئة الخلالي، والتليف الرئوي مجهول السبب (IPF) هو مرض التدريجي المزمن ويظهر سوء أحوال الطقس. السمة المميزة المرضية للفريق الحكومي الدولي هو تطوير بؤر أرومي ليفي التي تتكون من الخلايا الليفية وmyofibroblasts تنشيط التي ترتبط مع التكهن. واقترح أصول هذه الخلايا الليفية الرئوية التي يمكن جنيها من عدة خلايا اللحمة المتوسطة، بما في ذلك الخلايا الليفية الرئوية المقيمين أصلا وتعميم الخلايا الليفية من نخاع العظام. في الآونة الأخيرة، وقد اقترح الانتقالية الظهارية الوسيطة (EMT) لتترافق مع تشكيل خلايا اللحمة المتوسطة 2، والمساهمة في التسبب في اضطرابات متليفة.

ويعتقد أن EMتي يلعب دورا هاما في عملية نمو الجنين، التئام الجروح، وتطور السرطان، بما في ذلك غزو الورم والانبثاث 3. بعد عملية EMT، الخلايا الظهارية الحصول على قدرة خلايا اللحمة المتوسطة التي كتبها ضياع معالم الظهارية، مثل E-كادهيرين، والتعبير عن علامات الوسيطة، مثل فيمنتين، وα العضلات الملساء الأكتين (SMA) 4،5. وأظهرت دراسات سابقة الدليل على أن عملية EMT ارتبط تطور التليف الأنسجة في الكلى 6 و 7 الرئة. بالإضافة إلى ذلك، والتهاب مزمن يعزز المرض متليف 8؛ علاوة على ذلك، فإن هذه السيتوكينات الالتهابية مثل عامل نخر الورم أعضاء الفصيلة 14 (TNFSF14؛ ضوء)، عامل نخر الورم (TNF) -α، وانترلوكين 1β، وقد ثبت لتعزيز EMT 9-12.

جل الكولاجين فحص الانكماش، انكماش الخلايا الفحص المعتمدة على الكولاجين التي هي جزء لا يتجزأ الليفية في النوع الأولالكولاجين جل ثلاثة الأبعاد، هو المثل الأعلى في نموذج المختبر لتقييم انقباض. انقباض هي واحدة من وظائف مميزة من الخلايا الليفية، وتسهم في ترميم الجروح العادية وتليف 13. في هذا الاختبار، ويعتقد أن المرفق من الخلايا الليفية إلى النوع الأول الكولاجين من خلال الآليات التي تعتمد على إنتغرين من المفترض أن تنتج التوتر الميكانيكي تحت بعض الظروف، وبالتالي يؤدي إلى تقلص الأنسجة.

هنا، يتم الإبلاغ عن تطوير فحص هلام انكماش يمكن تكييفها لتقييم الاستحواذ على وظيفة مقلص في الخلايا التي خضع EMT. يوضح هذا التقرير أن هذا الاختبار تعديل هو مناسبة لتقييم انقباض في خلايا اللحمة المتوسطة التي خضعت EMT.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. الاستعدادات والثقافة من خلايا الرئة طلائي

  1. ثقافة A549 الخلايا الظهارية الرئة البشرية (خط خلية ملتصقة) في Dulbecco لتعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني (FBS)، و 100 وحدة دولية / مل البنسلين، و 100 ميكروغرام / مل الستربتومايسين.
  2. إزالة والتخلص من وسائل الإعلام ثقافة خلية من صحن الثقافة، ويغسل مرة واحدة مع 5-10 مل من الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). بعد الغسيل، ونضح على الفور برنامج تلفزيوني.
  3. إضافة 2 مل التربسين حامض / ethylenediaminetetraacetic (EDTA) (0.05٪)، واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 3 دقائق.
  4. جمع خلايا منفصلة في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على خلية ثقافة المتوسط، أنابيب الطرد المركزي في RT لمدة 4 دقائق في 150 × ز.
  5. resuspend الخلايا بيليه في 2 مل من مستنبت الخلية وإزالة عينة لعد الخلايا. حساب عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات مع التريبان وصمة عار الزرقاء للتحقق بقاء الخلية.
  6. خلايا البذور A549 على10 لوحات سم البوليسترين في مناطق ذات كثافة من 0،5-1،0 × 10 6 خلية / طبق مع 10 مل من المتوسط ​​لفحص هلام الانكماش. البذور الخلايا على 6 لوحات البوليسترين بشكل جيد في مناطق ذات كثافة من 0،5-1،0 × 10 5 خلية / جيدا مع 2 مل من المتوسط ​​للتأكيد EMT. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 24 ساعة.

إجراء 2. EMT

  1. إضافة 10 ميكرولتر من TGF-β1 (5 ميكروغرام / مل) و 10 ميكرولتر من TNF-α (10 ميكروغرام / مل) لوحة لفحص هلام انكماش المصنف في الخطوة 1.6. إضافة 2 ميكرولتر من TGF-β1 (5 ميكروغرام / مل) و 2 ميكرولتر من TNF-α (10 ميكروغرام / مل) لوحة للتأكيد EMT المصنف في الخطوة 1.6. احتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 48 ساعة.

3. تأكيد الإجراءات EMT بواسطة PCR والغربية التنشيف

  1. تأكيد التغيير في التشكل (من حجر مثل كوبلي إلى المغزل شكل) من الخلايا المعالجة باستخدام المجهر النقيض من المرحلة.
    ملاحظة: نورمخلايا A549 آل لها كوبلي الحجر تشبه والثلاثي ظهور شكل الذي هو سمة من الخلايا الظهارية، ولكن بعد التحفيز مع TGF-β1 وTNF-α، الخلايا تظهر طويلة والمغزل على شكل مشابه للخلايا اللحمة المتوسطة 14،15.
  2. تقييم تعبير عن علامة الظهارية، مثل E-كادهيرين، وعلامات الوسيطة مثل N-كادهيرين، فيمنتين، وα السلس الأكتين العضلات باستخدام PCR أو النشاف الغربي.
    1. استخراج الحمض النووي الريبي مجموع من الخلايا باستخدام استخراج الحمض النووي الريبي مجموعة 16 وتوليف [كدنا باستخدام الناسخ العكسي 17 وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    2. قياس التعبير عن مستويات مرنا في الوقت الحقيقي باستخدام نظام PCR 18 و أحادى cyanine الصبغة عدة PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. وترد. (E-كادهيرين كادهيرين-1)، وفيم (فيمنتين) في الجدول 1 الاشعال محددة لGAPDH (غليسيرألدهيد 3-فوسفات نازعة)، ACTA2 (ألفا الأكتين-2)، CDH1 .
    3. ليز الخلايا باستخدام العازلة تحلل (الجدول 2) محلول يحتوي على 1٪ مثبط البروتياز كوكتيل. قياس تركيزات البروتين كل عينة باستخدام مجموعة البروتين مقايسة 19،20، وتطبيق نفس كميات من البروتين لهلام بولي أكريلاميد.
      1. أداء SDS هلام الكهربائي ونقل شبه الجافة من البروتينات لPVDF غشاء 21. احتضان الغشاء مع الأجسام المضادة الأولية في عرقلة العازلة 1 - 2 ساعة. بعد الحضانة، ويغسل مرتين الغشاء مع غسل العازلة واحتضان ساعة غشاء 1 مع الأجسام المضادة الثانية.
        ملاحظة: انظر الجدول المواد / المعدات عن الأجسام المضادة والتخفيفات المستخدمة في هذه الدراسات. انظر الجدول 2 لمكونات عازلة تمنع.
      2. يغسل الغشاء مع العازلة غسل مرتين. التقاط صور للغشاء مع الغرب النشاف عدة الكشف عن 22 باستخدام كاميرا CCD 11،23 الباردة.

4. جل تقلص الفحص لتقييم EMT

  1. نضح في وسائل الإعلام مكيفة من السفينة زراعة الخلايا، ويغسل جيدا مع 5-10 مل من برنامج تلفزيوني لإزالة الخلايا الميتة. بعد الغسيل، ونضح على الفور برنامج تلفزيوني.
  2. إضافة 2 مل من 0.05٪ التربسين / EDTA واحتضان عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة 3 دقائق.
  3. جمع خلايا منفصلة في أنابيب الطرد المركزي التي تحتوي على DMEM تستكمل مع مثبط التربسين (1 ملغ / مل)، أنابيب الطرد المركزي في RT لمدة 4 دقائق في 150 × ز.
  4. مزيج نوع هلام 1 الكولاجين بالماء المقطر، و 4 × تتركز DMEM لضبط الكميات لتحقيق تركيز الكولاجين من 1.75 ملغ / مل، و 1 × تركيز DMEM. تأكد للحفاظ على المديين المتوسط ​​هلام على الجليد خلال هذه الخطوة.
    ملاحظة: لجعل 6 مل من المتوسط ​​هلام، وتخلط جيدا 3.5 مل من نوع 1 الكولاجين هلام (3 ملغ / مل)، و 1.5 مل من 4 × تتركز DMEM، و1ml من الماء المقطر.
  5. Resuspend وبيليه الخلية في 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني وأخذ عينة لعد الخلايا. عدعدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات مع وصمة عار الأزرق التريبان للتحقق من سلامة الخلية.
  6. إضافة المتوسطة هلام لضبط الكميات لتحقيق كثافة خلية من 3.0 × 5 10 خلايا / جيد (6.0 × 10 5 خلية / مل)، وبلطف ولكن سرعان ما مزجها قبل pipetting دون دبق.
  7. الاستغناء عن 0.5 مل من الخليط في كل بئر من 24-جيدا لوحة غير المعالجة بسرعة وبدقة لجعل شكل أسطواني أنيق. يجب الحرص على عدم السماح لأي فقاعات الهواء لتلوث المواد الهلامية (الشكل 1A).
    ملاحظة: متوسطة الجل الذي يحتوي على خلايا لزجا، ويمكن أن جل بسهولة وشكل شكل هلال في البئر.
  8. احتضان لوحة لمدة 15 دقيقة في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة إلى هلام تماما.
  9. فصل المواد الهلامية من لوحة من دون كسر عن طريق تحريك ملعقة تعقيم بطريقة لرسم محيط في اتجاه واحد. باستخدام ملعقة، ونقل بلطف المواد الهلامية على أطباق زراعة الأنسجة 60 ممتحتوي على 5 مل من DMEM / 1٪ FBS مع أو بدون TGF-β1 (5 نانوغرام / مل)، وTNF-α (10 نانوغرام / مل).
  10. هز بلطف أطباق لضمان المواد الهلامية تطفو على المدى المتوسط. احتضان في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 و 95٪ الرطوبة.

5. قياس جل الحجم

  1. قياس حجم هلام الكولاجين بعد 0، 24، 48، و 72 ساعة باستخدام نظام تحليل الصور.
    1. تشغيل نظام التوثيق هلام (الشكل 2A)، ووضع أطباق في مجلس الوزراء ضوء التدريع. ثم خلع غطاء من الأطباق في مجلس الوزراء.
    2. فتح البرنامج هلام تحليل ذات الصلة. انقر على زر "الحصول على الصور" في القائمة شريط لإظهار صورة من المواد الهلامية في مجلس الوزراء. ثم انقر على "اكتساب" في شريط القوائم لالتقاط الصور من المواد الهلامية (الشكل 2B).
    3. انقر على زر "كشف" في شريط القوائم (الشكل 2C) وضبط المنطقة القياس (الأصفر ط دائرةن الشكل 2C) عن طريق سحب الماوس. ثم انقر على زر "لصناعة السيارات في كشف" في شريط القوائم (انظر زر في الشكل 2D). البرنامج تلقائيا بالكشف عن المواد الهلامية تظهر خريطة التمثيل اللوني (الشكل 2D).
    4. انقر على زر "موافق" لاستخراج مخطط من المواد الهلامية التي كتبها معالجة الصور ولحساب مناطق محاطة مخطط (الشكل 2E). بعد احتساب المنطقة، يتم عرض منطقة محسوب في نافذة منبثقة منفصل.
      ملاحظة: إذا كانت المواد الهلامية متداخلة مع بعضها البعض أثناء التصوير، ونقل المواد الهلامية بلطف باستخدام طرف ماصة معقمة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

خلال EMT، الخلايا الظهارية تفقد علامات الظهارية، مثل E-كادهيرين، واكتساب التعبير عن علامات الوسيطة، مثل فيمنتين وα العضلات الملساء الأكتين 4،5. حضانة الخلايا الظهارية A549 الإنسان الرئة مع TGF-β1 وTNF-α تحرض EMT. ظهور خلايا A549 العادية بمثابة حجر كوبلي مثل شكل وشكل المثلث الذي هو سمة من الخلايا الظهارية (الشكل 3A)، ولكن بعد حفز مع TGF-β1 وTNF-α، تغير مظهرها شكل مغزل الطويلة التي تشبه الوسيطة الخلايا (الشكل 3B).<...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويضم البروتوكول وضعت في هذه الدراسة خطوتين. يتم تنفيذ الخطوة الأولى للحث على EMT، في حين أن الخطوة الثانية هي فحص هلام الانكماش. وبما أنه من المهم للتأكد من أن الخلايا خضعت EMT الخطوة 2 توفر عنصرا مكملا ممتازا للتغيرات التعبير المورفولوجية والجينات. وأظهرت دراسات سابقة أن EMT خلايا A549 والناجمة عن TGF-β1 فقط (24)؛ ومع ذلك، ونحن قد ذكرت في وقت سابق 10، المعاملة تنف ألفا يعزز EMT والحصول على علامات الخلية الوسيطة. ويعتقد أن آليات EMT بوساطة TGF-β-هو 25

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم تضارب المصالح في الكشف عنها.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتور تاداشي كوياما على المساعدة الفنية. تم دعم هذا العمل جزئيا من قبل JSPS KAKENHI Grant Numbers 23249045 ، 15K09211 ، 15K19172 ؛ منحة لفريق أبحاث فشل الجهاز التنفسي من وزارة الصحة والعمل والرعاية الاجتماعية في اليابان. منحة للبحث في أمراض الحساسية والمناعة ، اليابان.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMسيجما ألدريتش11965-092ل A549 متوسط
FBSGIBCO10437
تحويل عامل النمو-& بيتا; 1 ، الإنسان ، المؤتلفواكو المختبر المواد الكيميائية209-16544
مؤتلف إنسان نخر الورم الورم - & ألفا ؛R & أنظمة D210-TA / CF
E-Cadherin (24E10) تقنيةإشارات خليةmAb # 31951: 3،000 تخفيف
Vimentin (D21H3) تقنيةإشارات خليةmAb # 57411: 3،000 التخفيف
المضاد للأجسام المضادة للتوبولينسيجما ألدريتشT90261: 10،000 تخفيف
أحادي النسيلة مضاد للأكتين ، &alpha ؛ - الأجسام المضادة للعضلات الملساء & نب سب.سيجما ألدريتشA52281: 10،000 تخفيف
مضاد للأجسام المضادة ل N-cadherinمختبرات نقل BD# 6109201: 1،000 تخفيف
مضاد للفأر IgG ، أغنام كاملة مرتبطة ب HRP (جسم مضاد ثانوي) GEHealthcareNA931-100UL1: 20،000 تخفيف
مضاد للأرانب IgG ، حمار أب كامل مرتبط ب HRP (جسم مضاد ثانوي) GEHealthcareNA934-100UL1: 20،000
كاشف حجبGE HealthcareRPN4182٪ في TBS-T
6 لوحة ثقافة الخلايا متعددة الآبار ذات القاع المسطح الشفاف ، مع غطاءكورنينج# 353046
100 مم طبق ثقافةالخلية TPP# 93100
DMEM ، تقنيات حياة المسحوق12100-046ل 4 مرات ؛ DMEM
نوع 1 هلام الكولاجينNitta الجيلاتينCellmatrix نوع I-A
24 لوحة ثقافة الخلية الجيدةAGC TECHNOGLASS 1820-024
نظام توثيق جل   ؛ATTOAE-6911FXNGel imager
Gel Analyzer Gel Solution SoftwareATTODensitograph ، الإصدار 3.00برنامج تحليل مرفق مع AE-6911FXN
Trypsin-EDTA (0.05٪) ، تقنيات الفينول الأحمر25300054
24 لوحة بئر ،IWAKI1820-024
Trypan Blue غير المعالج ، تقنيات الحياة 0.4٪15250-061
طقم استخراج الحمض النووي الريبيQiagen74106
تقنيات حياةالنسخ العكسي18080044
نظام PCR في الوقت الحقيقيستراتاجينMx-3000P
SYBR مجموعة PCR الخضراءQiagen204145
كوكتيل مثبط البروتياز للبروتياز (100x)تقنيات الحياة78429
غشاءPVDFATTO2392390
مجموعة فحص البروتينbio-rad5000006JA  
هلام بولي أكريلاميدATTO2331810
كاشف الكشف عن النشاف الغربيGE HealthcareRPN2232
كاميرا CCD الباردةATTOEz-Capture MG / ST
مثبط التربسينسيجما ألدريتشT9003-100MG
بولي أوكسي إيثيلين (20) سوربيتان مونولوراتواكو كيماويات مختبرواكو 163-11512
بولي أوكسي إيثيلين (9) أوكتيفينيل الأثيرواكو المختبر للكيماويات141-08321
الأرنب الأرنب التخفيف محلول مجموعة PCR الخضراء

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Wynn, T. A. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. The Journal of pathology. 214, 199-214 (2008).
  2. Hardie, W. D., Glasser, S. W., Hagood, J. S. Emerging concepts in the pathogenesis of lung fibrosis. The American journal of pathology. 175, 3-16 (2009).
  3. Kovacic, J. C., Mercader, N., Torres, M., Boehm, M., Fuster, V. Epithelial-to-mesenchymal and endothelial-to-mesenchymal transition: from cardiovascular development to disease. Circulation. 125, 1795-1808 (2012).
  4. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  5. Kalluri, R., Weinberg, R. A. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 119, 1420-1428 (2009).
  6. Forino, M., et al. TGFbeta1 induces epithelial-mesenchymal transition, but not myofibroblast transdifferentiation of human kidney tubular epithelial cells in primary culture. International journal of experimental pathology. 87, 197-208 (2006).
  7. Yang, S., et al. Participation of miR-200 in pulmonary fibrosis. The American journal of pathology. 180, 484-493 (2012).
  8. Reynolds, H. Y. Lung inflammation and fibrosis: an alveolar macrophage-centered perspective from the 1970s to 1980s. American journal of respiratory and critical care medicine. 171, 98-102 (2005).
  9. Camara, J., Jarai, G. Epithelial-mesenchymal transition in primary human bronchial epithelial cells is Smad-dependent and enhanced by fibronectin and TNF-alpha. Fibrogenesis & tissue repair. 3, 2(2010).
  10. Kamitani, S., et al. Simultaneous stimulation with TGF-beta1 and TNF-alpha induces epithelial mesenchymal transition in bronchial epithelial cells. International archives of allergy and immunology. 155, 119-128 (2011).
  11. Mikami, Y., et al. Lymphotoxin beta receptor signaling induces IL-8 production in human bronchial epithelial cells. PloS one. 9, e114791(2014).
  12. Yamauchi, Y., et al. Tumor necrosis factor-alpha enhances both epithelial-mesenchymal transition and cell contraction induced in A549 human alveolar epithelial cells by transforming growth factor-beta1. Experimental lung research. 36, 12-24 (2010).
  13. Grinnell, F. Fibroblasts, myofibroblasts, and wound contraction. The Journal of cell biology. 124, 401-404 (1994).
  14. Ramos, C., et al. FGF-1 reverts epithelial-mesenchymal transition induced by TGF-{beta}1 through MAPK/ERK kinase pathway . American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 299, L222-L231 (2010).
  15. Ren, Z. X., Yu, H. B., Li, J. S., Shen, J. L., Du, W. S. Suitable parameter choice on quantitative morphology of A549 cell in epithelial-mesenchymal transition. Bioscience reports. 35, (2015).
  16. Brinkmann, V., Kinzel, B., Kristofic, C. TCR-independent activation of human CD4+ 45RO- T cells by anti-CD28 plus IL-2: Induction of clonal expansion and priming for a Th2 phenotype. Journal of immunology. 156, 4100-4106 (1996).
  17. Krug, M. S., Berger, S. L. First-strand cDNA synthesis primed with oligo(dT). Methods in enzymology. 152, 316-325 (1987).
  18. Morozumi, M., et al. Simultaneous detection of pathogens in clinical samples from patients with community-acquired pneumonia by real-time PCR with pathogen-specific molecular beacon probes. Journal of clinical microbiology. 44, 1440-1446 (2006).
  19. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Analytical biochemistry. 150, 76-85 (1985).
  20. Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation. Analytical biochemistry. 175, 231-237 (1988).
  21. Ursitti, J. A., Mozdzanowski, J., Speicher, D. W., et al. Electroblotting from polyacrylamide gels. Current protocols in protein science. Chapter 10, Unit 10.7(2001).
  22. Kricka, L. J., Voyta, J. C., Bronstein, I. Chemiluminescent methods for detecting and quantitating enzyme activity. Methods in enzymology. 305, 370-390 (2000).
  23. Noguchi, S., et al. An integrative analysis of the tumorigenic role of TAZ in human non-small cell lung cancer. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 20, 4660-4672 (2014).
  24. Kasai, H., Allen, J. T., Mason, R. M., Kamimura, T., Zhang, Z. TGF-beta1 induces human alveolar epithelial to mesenchymal cell transition (EMT). Respiratory research. 6, 56(2005).
  25. Chen, X., et al. Integrin-mediated type II TGF-beta receptor tyrosine dephosphorylation controls SMAD-dependent profibrotic signaling. The Journal of clinical investigation. 124, 3295-3310 (2014).
  26. Saito, A., et al. An integrated expression profiling reveals target genes of TGF-beta and TNF-alpha possibly mediated by microRNAs in lung cancer cells. PloS one. 8, e56587(2013).
  27. Dvashi, Z., et al. Protein phosphatase magnesium dependent 1A governs the wound healing-inflammation-angiogenesis cross talk on injury. The American journal of pathology. 184, 2936-2950 (2014).
  28. Hallgren, O., et al. Enhanced ROCK1 dependent contractility in fibroblast from chronic obstructive pulmonary disease patients. Journal of translational medicine. 10, 171(2012).
  29. Kobayashi, T., et al. Matrix metalloproteinase-9 activates TGF-beta and stimulates fibroblast contraction of collagen gels. American journal of physiology. Lung cellular and molecular physiology. 306, L1006-L1015 (2014).
  30. Horie, M., et al. Histamine induces human lung fibroblast-mediated collagen gel contraction via histamine H1 receptor. Experimental lung research. 40, 222-236 (2014).
  31. Kohyama, T., et al. PGD(2) modulates fibroblast-mediated native collagen gel contraction. American journal of respiratory cell and molecular biology. 27, 375-381 (2002).
  32. Muir, A. B., et al. Esophageal epithelial cells acquire functional characteristics of activated myofibroblasts after undergoing an epithelial to mesenchymal transition. Experimental cell research. 330, 102-110 (2015).
  33. Zhong, Q., et al. Role of endoplasmic reticulum stress in epithelial-mesenchymal transition of alveolar epithelial cells: effects of misfolded surfactant protein. American journal of respiratory cell and molecular biology. 45, 498-509 (2011).
  34. Liu, X. Inflammatory cytokines augments TGF-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in A549 cells by up-regulating TbetaR-I. Cell motility and the cytoskeleton. 65, 935-944 (2008).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Epithelial Mesenchymal TransitionGel Contraction AssayMesenchymal CellsTGF Beta 1TNF AlphaA549 CellsCell ContractilityWestern Blot AnalysisImmunofluorescence StainingCell Culture Incubator

Related Articles