تعكس وفرة البروتين معدلات كل من تخليق البروتين وتدهور البروتين. تصف هذه المقالة استخدام مطاردة cycloheximide متبوعة بالنشاف الغربي لتحليل تحلل البروتين في نموذج حقيقيات النوى أحادية الخلية ، Saccharomyces cerevisiae (الخميرة الناشئة).
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
سيكلوهيكسيميد تحليل تشيس من تدهور البروتين في
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
تنظيم وفرة البروتين ضروري لكل عملية الخلوية تقريبا. تعكس البروتين وفرة التكامل بين معدلات تخليق البروتين وتدهور البروتين. العديد من فحوصات الإبلاغ عن وفرة البروتين (على سبيل المثال، لمرة واحدة نقطة النشاف الغربي، وتدفق الخلوي، المجهري مضان، أو المقايسات مراسل القائم على النمو) لا تسمح التمييز من آثار النسبية للترجمة والتحلل البروتيني على مستويات البروتين. توضح هذه المقالة استخدام مطاردة سيكلوهيكسيميد تليها الغربية النشاف لتحليل تحديدا تدهور البروتين في حقيقي النواة وحيدة الخلية النموذجية، خميرة الخباز (مهدها الخميرة). في هذا الإجراء، يتم تحضين الخلايا الخميرة في وجود سيكلوهيكسيميد متعدية المانع. يتم جمع أجزاء مأخوذة من خلايا مباشرة بعد وعند نقاط زمنية محددة بعد إضافة سيكلوهيكسيميد. وهي lysed الخلايا، ويتم فصل لست] من قبل الكهربائي للهلام بولي أكريلاميد FOص تحليل لطخة الغربي من وفرة البروتين في كل نقطة زمنية. يسمح الإجراء سيكلوهيكسيميد مطاردة تصور حركية تدهور سكان الولاية ثابت من مجموعة متنوعة من البروتينات الخلوية. ويمكن استخدام هذا الإجراء لتحقيق متطلبات الوراثية للوالتأثيرات البيئية على تدهور البروتين.
المقدمة
البروتينات تؤدي وظائف مهمة في كل عملية الخلوية تقريبا. تتطلب العديد من العمليات الفسيولوجية وجود بروتين معين (أو البروتينات) لفترة محددة من الزمن أو في ظل ظروف معينة. لذا الكائنات مراقبة وتنظيم وفرة البروتين لتلبية احتياجات الخلوية 1. على سبيل المثال، الحلقيات (البروتينات التي تتحكم في انقسام الخلايا) موجودة في مراحل محددة من دورة الخلية، وارتبط فقدان مستويات السيكلين المنظمة مع تشكيل الورم الخبيث 2. بالإضافة إلى تنظيم مستويات البروتين لتلبية احتياجات الخلوية، وخلايا توظف آليات الهادمة لمراقبة الجودة للقضاء تتجمع، غير المجمعين، أو الشاذة إلا جزيئات البروتين 3. السيطرة على وفرة البروتين ينطوي على....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. النمو والحصاد من خلايا الخميرة
- إن لم يكن تحليل حركية تدهور بروتين الخميرة الذاتية، وتحويل الخميرة المطلوب سلالة (s) مع ترميز البلازميد بروتين من الفائدة. وقد وصفت وسائل موثوق بها للتحول الخميرة سابقا 37.
- تطعيم الخميرة في 5 مل من المتوسط المناسب (على سبيل المثال، انتقائية الاصطناعية تعريف (SD) المتوسطة للصيانة بلازميد من الخلايا تحولت أو (YPD) متوسطة غير انتقائي خلاصة الخميرة، ببتون-الدكستروز للخلايا غير حولت). احتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية، بالتناوب.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
لتوضيح منهجية مطاردة سيكلوهيكسيميد، تم تحليل استقرار Deg1 -Sec62 (الشكل 1)، وهذا نموذج الخميرة الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) تدهور -associated (ايراد) الركيزة، 42-44. في ايراد، ومراقبة الجودة الانزيمات اليوبيكويتين يغاز إرفاق تساهمي سلاسل من اليوبيكويتين بروتين صغيرة لالبروتينات الشاذة مترجمة إلى غشاء ER. تتم إزالة هذه البروتينات polyubiquitylated في وقت لاحق من لائحة وتدهورت قبل proteasome و، كبير، البروتيني عص.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
في هذه الورقة، وتقدم طريقة لتحليل حركية تدهور البروتين. هذه التقنية يمكن تطبيقها بسهولة إلى مجموعة من البروتينات التي تدهورت بفعل مجموعة متنوعة من الآليات. من المهم أن نلاحظ أن التجارب سيكلوهيكسيميد مطاردة تقرير عن حركية تدهور تجمع الدولة المطرد للبروتين معين. ويمكن استخدام تقنيات أخرى لتحليل حركية تدهور فئات معينة من السكان من البروتينات. على سبيل المثال، يمكن تتبع مصير الهادمة من البروتينية الوليدة من خلال تحليل نبض مطاردة 55. في مثل هذه التجارب، والبروتينات الوليدة ه.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.
شكر وتقدير
يشكر المؤلفون الأعضاء الحاليين والسابقين في مختبر روبنشتاين لتوفير بيئة بحثية داعمة ومتحمسة. يشكر المؤلفون مارك هوشستراسر (جامعة ييل) على مشاركة الكواشف والخبرات. يشكر E.M.R. ستيفان كريفت (جامعة كونستانز) وجنيفر برونز (جامعة بيتسبرغ) لمشاركة الخبرات التي لا تقدر بثمن في التحليل الحركي للبروتينات. تم دعم هذا العمل من خلال منحة المعاهد الوطنية للصحة (R15 GM111713) إلى E.M.R. ، وجائزة بحثية من جامعة بول ستيت ASPiRE إلى E.M.R ، وجائزة بحثية من فرع جامعة بول ستيت في Sigma Xi إلى SME ، وأموال من مكتب عميد جامعة بول ستيت وقسم علم الأحياء.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| سلالات الخميرة المرغوبة ، البلازميدات ، المكونات | |||
| القياسية أنابيب زجاج البورسليكات التي تستخدم لمرة واحدة | فيشر ساينتفيك | 14-961-32 | متوفر من مجموعة متنوعة من الشركات |
| المصنعة حاضنة منظمة لدرجة الحرارة (<م > على سبيل المثال < / م > حاضنة Heratherm موديل IMH180) | Dot Scientific | 51028068 | متوفر من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة |
| أسطوانة نيو برونزويك القابلة للتبديل لأنابيب 18 مم (أسطوانة الأنبوب) | يوصى باستخدام أسطوانة الأنبوب في نيو برونزويك | M1053-0450 | للحفاظ على ثقافات بداية خلايا الخميرة في وضع التعليق بين عشية وضحاها. بدلا من ذلك ، إذا لم تكن أسطوانة الأنبوب متوفرة ، فيمكن استخدام شاكر المنصة في حاضنة يتم التحكم في درجة حرارتها لثقافات البداية بين عشية وضحاها. يمكن استخدام شاكر المنصة أو الأسطوانة الأنبوبية للحفاظ على الثقافات الأكبر في التعليق. |
| نيو برونزويك TC-7 الأسطوانة الأسطوانة 120 فولت 50/60 ساعة | نيو برونزويك | M1053-4004 | للاستخدام مع أسطوانة الأنبوب |
| SmartSpec Plus مقياس الطيف | الضوئي Bio-Rad | 170-2525 | متوفر من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة |
| الطرد المركزي 5430 | Eppendorf | 5427 000.216 ؛ | الدوار الذي يباع مع وحدة يحمل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة 1.5 و 2.0 مل. يمكن تبديل الدوار بآخر يحمل أنابيب مخروطية 15 و 50 مل دوار |
| الزاوية F-35-6-30 مع غطاء ومحولات لجهاز الطرد المركزي موديل 5430 / R ، أنابيب مخروطية 15/50 مل ، 6 أماكن | Eppendorf | F-35-6-30 | |
| غطاء لولبي مطبوع بشاشة 15 مل 17 × 20 مم مخروطي الشكل ، بولي بروبيلين | Sarstedt | 62.554.205 | متوفر من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة |
| مرن 1.5 مل ، أنابيب الطرد المركزي الدقيقة الطبيعية والطبيعية PCR | Eppendorf | 22364120 | متوفرة من مجموعة متنوعة من الشركات المصنعة |
| سخانات Dri-Bath التناظرية | Fisher Scientific | 1172011AQ | يوصى بتوفر سخانين (أحدهما لاحتضان الخلايا أثناء العلاج بالسيكلوهيكسيميد والآخر لغليان المحللات لتشويه طبيعة البروتينات). بدلا من ذلك ، 30 درجة ؛ يمكن استخدام حمام مائي C لحضانة الخلايا في وجود سيكلوهكسيميد. يمكن استخدام حمام الماء المغلي مع الصفيحة الساخنة بالتناوب لتشويه البروتينات. |
| كتلة تسخين لأنابيب مخروطية مقاس 12 × 15 مل | فيشر ساینتفيك | 11-473-70 | للاستخدام مع سخان Dri-Bath أثناء حضانة الخلايا في وجود سيكلوهيكسميد. |
| كتلة تسخين لأنابيب مخروطية 20 × 1.5 مل | فيشر ساینتفيك | 11-718-9Q | للاستخدام مع سخان Dri-Bath لغلي المحللات لتمسخ البروتين. |
| تشغيل ونقل SDS-PAGE وإمدادات الطاقة ومعدات التصوير أو الغرف المظلمة ل SDS-PAGE ونقلها إلى الغشاء | حسب المختبر والتطبيق | ||
| تصوير اللطخة الغربية ( على سبيل المثال < / em> وماسح ضوئي Li-Cor Odyssey CLx وبرنامج Image Studio) | سيختلف Li-Cor | 9140-01 | حسب المختبر والتطبيق |
| EMD Millipore Immobilon PVDF Transfer | Membranes Fisher Scientific | سيختلف IPFL00010 | حسب المختبر والتطبيق |
| الأجسام المضادة الأولية ( على سبيل المثال < / em> الفوسفورجليسيرات كيناز (Pgk1) الجسم المضاد أحادي النسيلة ، الفأر (استنساخ 22C5D8))ستختلف | Life Technologies | 459250 | حسب المختبر والتطبيق |
| الأجسام المضادة الثانوية (على سبيل المثال < / em> Alexa-Fluor 680 Rabbit Anti-Mouse IgG (H + L))ستختلف | Life Technologies | A-21065 | حسب المختبر والتطبيق |
المراجع
- Jankowska, E., Stoj, J., Karpowicz, P., Osmulski, P. A., Gaczynska, M. The proteasome in health and disease. Cur Pharm Des. 19 (6), 1010-1028 (2013).
- Nakayama, K. I., Nakayama, K. Ubiquitin ligases: cell-cycle control and cancer. Nat Rev Cancer. 6 (5), 369-381 (2006).
- Amm, I., Sommer, T.,....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
