Coculture فحوصات لدراسة البلاعم والخلايا الدبقية الصغيرة تحفيز من ورم أرومي دبقي الغزو

ورم أرومي الأشكال هو سرطان الدماغ البشري عدوانية مع بقاء متوسط ما يقرب من 12 شهرا من وقت التشخيص ^1،2. ورم أرومي هو واحد من أكثر أنواع السرطان الأكثر فتكا وتحديا سريريا كما هو صهر للعلاج بالادوية الكيميائية والاستئصال الجراحي. طبيعة منتشر من ورم أرومي تمكن الخلايا السرطانية تنتشر في أرجاء الدماغ العادي مما يجعل الورم متقدمة من المستحيل عمليا إلى بتر جراحيا تماما. هذا الجانب الغازية للغاية هو سمة مميزة لورم أرومي وغيرها من astrocytomas المتقدمة. ولذلك، فقد كان تركيز الكثير من الأبحاث على الآلية الجزيئية من غزو الخلايا ورم أرومي. المكروية ورم أرومي الورم تلعب دورا حيويا في تأسيس خبيثة ^3-6. / عرضت الخلايا الدبقية الصغيرة ورم المرتبطة الضامة لتكون مسؤولة عن تعزيز غزو ورم أرومي ^7،8. ولكن معظم هذه الدراسات قياس تأثير الضامة / الدبقية الصغيرة باستخدامالمقايسات التي تفصل بينهما جسديا من خلايا ورم أرومي. وقد وضعت مختبرنا إلى توليد تحسين المقايسات التي تسمح لنا لدراسة كيفية غزو ورم أرومي يعتمد على الضامة / الدبقية الصغيرة في cocultures وتمكننا من صورة التفاعل الجسدي بينهما أثناء الغزو.

المقايسات الكلاسيكية لقياس غزو الخلايا تتضمن "القياسية" بويدن الكيميائي الغرفة وصيغ chemoinvasion. ومطلي هنا الخلايا لدراستها في غرفة البلاستيكية التي تحتوي على فلتر البولي على الجزء السفلي الذي يحتوي على مسام الحجم المحدد (عادة ما بين 0.4 و 8 ميكرومتر في القطر). عملية غزو الخلايا ينطوي على حاجز مادي، وعادة ما تتألف من البروتين مصفوفة خارج الخلية. في مقايسة chemoinvasion، مصفوفة فضل المستخدمة Matrigel (يشار إليها فيما يلي باسم "ماتريكس")، وهي خليط من البروتين مصفوفة خارج الخلية التي يفرزها Engelbreth-هولم-سرب (الصحة والسلامة) خلايا فأر ساركوما وتتألف في معظمها من العقيدنوع اجين الرابع و laminin. ثم توضع الدوائر في بئر زراعة الأنسجة التي تحتوي على وسائل الإعلام ثقافة الخلية مع أو بدون عوامل النمو التي يشتبه في تحفيز الغزو. الخلايا التي لديها القدرة على أعلى الغازية سوف تغزو خلال خارج الخلية مصفوفة مرشح المغلفة على تردد أعلى والتمسك السفلي من مرشح. لقد قمنا بتعديل هذا الاختبار من أجل تقييم دور الخلايا الدبقية الصغيرة وورم الضامة المرتبطة بها على غزو الخلايا ورم أرومي.

لقد كنا قادرين على تحديد باستخدام فحوصات coculture موضح في غضون هذه الورقة أن الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن أن تحفز غزو اثنين من خطوط الخلايا ورم أرومي من 5-10 أضعاف ^9،10. وهذا يعكس ما لوحظ في النماذج الحيوانية من الإصابة بالورم الأرومي الدبقي. وعلاوة على ذلك، قمنا بتطوير فحص ثلاثة الغزو الأبعاد حيث / الخلايا الدبقية الصغيرة يمكن فحص التفاعلات بين الخلايا ورم أرومي والضامة أكثر مباشرة. مدى غزو الخلايا ورم أرومي يحفزه macrophaغيس / الخلايا الدبقية الصغيرة في مقايسة 3D هي مماثلة لما ينظر إليه باستخدام نهج غرفة مصفوفة المغلفة. وقد وضعت فحوصات مماثلة سابقا لدراسة التفاعلات سرطان الثدي مع الضامة أثناء الغزو ^11-13. يتعين على الطرق الموضحة في هذه الورقة أن تساعد في القدرة على تشريح الآلية الجزيئية (ق) من البلاعم الغزو / حفز الخلايا الدبقية الصغيرة من خلايا ورم أرومي.

1. الفلورسنت وصفها من الخلايا

ملاحظة: تسمية خطوط الخلايا ورم أرومي والخلايا الدبقية الصغيرة مع الأصباغ الفلورية ^9. بدلا من ذلك، وتوليد خطوط الخلايا التي تعبر بشكل جوهري البروتينات الفلورية مثل GFP / RFP كما هو موضح في ^14.

1. لوحة الخلايا على طبق من 6 جيدا بحيث أنها ستكون 70-80٪ متكدسة في يوم من تلطيخ. للخط الفئران خلايا ورم أرومي GL261 والبشري خط خلية ورم أرومي U87، لوحة 1 × 10 ⁶ و 1.5 × 10 ⁶ خلايا، على التوالي على 6 سم طبق 24 ساعة قبل تلطيخ.
2. إعداد الفلورسنت خلية وصمة عار محلول الصبغة في DMSO وإضافة صبغة 5 ميكرومتر إلى وسائل الإعلام، سواء معهد الحديقة التذكارية روزويل المتوسطة (RPMI) أو بلعم المتوسطة مجانا المصل (MSFM)، دوامة جيدا.
3. احتضان الخلايا مع صبغة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
4. إزالة الصبغة تحتوي على وسائل الإعلام وإضافة وسائط جديدة (RPMI أو MSFM) إلى الخلايا.
5. احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة. ملاحظة: الخلايا هي الآنالملون وعلى استعداد لاستخدامها في التجربة.

المغلفة قبل 2. الفحص مصفوفة غرفة Coculture الغزو

1. التفريق THP-1 الخلايا باستخدام خلات phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية) ^15.
   1. لوحة 2-3 × 10 ⁵ THP-1 الخلايا في 1.5 مل من RPMI / 10٪ FBS في لوحة الثقافة 6 جيدا. فورا بعد الطلاء إضافة 100 نانومتر سلطة النقد الفلسطينية واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 48 ساعة.
      ملاحظة: بعد 48 ساعة، THP-1 الخلايا التي خضعت التمايز بنجاح ستكون ملتصقة وامتدت الى الجزء السفلي من أخذ جيدا على التشكل المستديرة.
   2. إزالة سلطة النقد الفلسطينية عن طريق الغسيل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني 1X واستبدالها مع الطازجة RPMI / 10٪ FBS. الانتظار لمدة 48 ساعة أخرى حتى الخلايا جاهزة للاستخدام في فحص.
2. تتوازن مصفوفة غرف قبل المغلفة عن طريق وضعها في بئر تحتوي على 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام وحدها (أي مصل) وإضافة 500 ميكرولتر من وسائل الإعلام وحدها إلى الأعلى. احتضان غرف لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
   الجدول المواد / المعدات.
3. فصل بلطف الخلايا (خطوط الخلايا ورم أرومي fluorescently المسمى والخلايا الدبقية الصغيرة / الضامة)، وإزالة وسائل الاعلام من الخلايا عن طريق الطموح. غسل الخلايا على الطبق مع 2 مم EDTA / PBS. إضافة 500 ميكرولتر من 2 ملي EDTA / PBS واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في حاضنة الخلية عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
4. خلايا resuspend في 5 مل من وسائل الاعلام التي تحتوي على 0.3٪ الأبقار مصل الزلال (BSA).
5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 120 × ز.
6. نضح وطاف بيليه resuspend في MSFM / 0.3٪ وسائل الإعلام BSA (للخلايا GL261 والخلايا الدبقية الصغيرة) أو RPMI / 0.3٪ BSA (لU87 وTHP-1 خلايا) بحيث يكون تركيز خلايا يساوي 1 × 10 ⁶ خلية / مل . استخدام عدادة الكريات لحساب الخلايا.
7. إضافة 500 ميكرولتر وسائل الاعلام / 0.3٪ BSA لكل بئر من 24 لوحة جيدا.
8. إزالة وسائل الاعلام من الغرف التي تم معايرتها لا يقل عن 2 ساعة (الخطوة 2.2). مكان chambeالتمرير في احتواء من 500 ميكرولتر وسائل الاعلام / 0.3٪ BSA (الخطوة 2.7).
9. إذا كان يتم استخدام مثبطات لدراسة تأثيرها على البلاعم / حفز الخلايا الدبقية الصغيرة غزو الورم، إضافة تركيز مناسب لكلا من أسفل وأعلى أجزاء من الغرفة.
   ملاحظة: تركيزات السائل النخاعي-1R المانع تستخدم لمنع تماما الخلايا الدبقية الصغيرة حفز الغزو ورم أرومي GL261 يمكن العثور عليها في إشارة ^9.
10. اعتمادا على خطوط الخلايا المستخدمة، إضافة الخلايا إلى الغرفة العليا كما هو موضح في الخطوتين التاليتين: ورم أرومي الماوس (2.10.1) وورم أرومي البشري (2.10.2).
    1. خلط 1.5 × 10 ⁵ GL261 (ورم أرومي) الخلايا (150 ميكرولتر) و 5 × 10 ⁴ الماوس الخلايا الدبقية الصغيرة (50 ميكرولتر) (راجع الخطوة 2.6 لمزيد من التفاصيل وسائل الإعلام). ليصل حجم 500 ميكرولتر بإضافة 300 ميكرولتر MSFM / 0.3٪ BSA. يضاف خليط الخلية إلى الغرفة العلوية واحتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 48 ساعة.
       ملاحظة: الخلايا الدبقية الصغيرة الفئران وعزله من الفئران حديثي الولادة كما هو موضح طن ^{1 6.}

خلط 7.5 × 10 ⁴ U87 (ورم أرومي) خلايا (75 ميكرولتر) و 2.5 × 10 ⁴ THP1 (بلعم) خلايا (25 ميكرولتر). يصل حجم في 500 ميكرولتر بإضافة 400 ميكرولتر RPMI / 0.3٪ BSA. يضاف خليط الخلية إلى الغرفة العليا. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 24 ساعة.

1. بعد الحضانة، وإزالة الخلايا من أعلى غرفة من التطلع لطيف وإصلاح الدوائر عن طريق وضع في 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. السماح غرف للبقاء في تثبيتي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية). إزالة تثبيتي من التطلع لطيف واستبدالها مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. انتقل إلى القسم (4) لتحليل الصور.
   ملاحظة: تجربة يمكن أن يكون مؤقتا في هذه اللحظة وحفظها للتصوير في برنامج تلفزيوني 1X. يمكن الكشف عن إشارات صبغة الفلورسنت لمدة تصل إلى 2 أسابيع بعد التثبيت.

3. غزو الفحص "3D" -embedding الورم والضامة / الدبقية الصغيرة في مصفوفة

1. مزيج مصفوفة ذوبان في 4 درجات مئوية خلال الليل. تنفيذ كافة التلاعب مزيد باستخدام مصفوفة على الجليد في غطاء محرك السيارة.
2. إعداد 10 ملغ / مل تركيز مصفوفة في وسائل الإعلام (MSFM أو RPMI) بنسبة 0.3٪ BSA على الجليد.
   ملاحظة: سهم تركيز مصفوفة هو عادة حوالي 15 ملغ / مل.
3. لإعداد الخلايا (المسمى في الخطوة 1) للتعليق في المصفوفة، وإزالة وسائل الاعلام من الخلايا عن طريق الطموح. غسل الخلايا على الطبق مع 2 مم EDTA / PBS. إضافة 500 ميكرولتر من 2 ملي EDTA / PBS إلى الخلايا واحتضان لمدة 5-10 دقيقة في حاضنة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO _2.
4. خلايا resuspend في 5 مل من وسائل الاعلام التي تحتوي على 0.3٪ BSA.
5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 120 × ز.
6. طاف نضح من بيليه. بيليه resuspend في وسائل الاعلام / 0.3٪ BSA مثل أن تركيز خلايا يساوي 1 × 10 ⁶ خلية / مل. استخدام عدادة الكريات لحساب الخلايا.
7. إضافة 1.5 × 10 ⁵ خلايا GL261 (في 150 ميكرولتر) + 5 × 10 ⁴ خلايا الدبقية الصغيرة (في 50 ميكرولتر) في أنبوب 1.5 مل microfuge.إضافة 2 × 10 ⁵ خلايا GL261 (200 ميكرولتر) في أنبوب microfuge 1.5 مل منفصل.
   ملاحظة: خلايا GL261 وحدها دون الخلايا الدبقية الصغيرة بمثابة السيطرة.
8. خلايا تدور في microfuge لمدة 5 دقائق في 120 × ز.
9. Resuspend الخلايا في 200 مصفوفة الباردة ميكرولتر على الجليد.
10. لوحة 50 ميكرولتر (50000 الخلايا) على مركز المقصورة العليا من 8 ميكرومتر غرفة حجم المسام إدراج.
11. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لبلمرة تحدث.
12. إضافة 200 ميكرولتر المتوسطة خالية من المصل لمجلس الشيوخ و 700 مصل ميكرولتر تحتوي على متوسط ​​نمو الخلية إلى أقل أيضا.
13. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 48 ساعة.
14. بعد الحضانة، وإزالة الخلايا من أعلى غرفة من التطلع لطيف وإصلاح الدوائر عن طريق وضع في 3.7٪ الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني. السماح غرف للبقاء في تثبيتي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية). إزالة تثبيتي من التطلع لطيف واستبدالها مع 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X. انتقل إلى قسم 4 FOتحليل الصور ص.

4. التصوير فحوصات

1. إزالة غرف من 3.7٪ الفورمالديهايد ويغسل جيدا في احتواء الطازجة 500 ميكرولتر برنامج تلفزيوني 1X.
   ملاحظة: لا يسمح غرف لتجف.
2. باستخدام قضيب من القطن ذات الرؤوس، بلطف تنظيف الخلايا غير الغازية من الجزء العلوي من مرشح (الجانب يواجهها داخل الغرفة) عن طريق كشط سطح المرشح. بدء بلطف وزيادة الضغط تدريجيا. هل هذا على الأقل 3 مرات في الغرفة.
3. ضع غرف إما في صحن القاع الزجاجي أو ترك في 24 لوحة جيدا.
4. ضع العينة على مرحلة من مراحل epifluorescent أو الليزر المجهر الفلورسنت مبائر مجهزة الكاميرا والتقاط صورة البرنامج ^9،10.
5. يستغرق عدة 10X أو 20X الصور من المجالات التمثيلية.
6. باستخدام برمجيات تحليل الصور، مثل يماغيج، حساب عدد خلايا ورم أرومي التي عبرت مرشح لالسفلي ^9،10.
7. إذا كان التصوير "3D. "مقايسة الغزو (الموصوفة في القسم 3)، تولد سلسلة Z كومة باستخدام الليزر فلوري المجهر متحد البؤر ^5-6 لصورة سكان الخلية الغازية على الجانب السفلي من مرشح، اتبع الخطوات بروتوكول 4،2-4،6 المذكورة أعلاه.

باستخدام الأساليب المذكورة هنا، لقد أظهرنا أن الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة يمكن أن تحفز بشكل كبير غزو الخلايا ورم أرومي. ويعمل اثنان فحوصات غزو مختلفة، وصورت في الشكل 1. في الشكل 2، وخلايا GL261 التي تعبر بشكل جوهري على بروتين فلوري mCherry كانت مطلية على غرف قبل المغلفة مع وبدون الخلايا الدبقية الصغيرة لمدة 48 ساعة. وكانت الخلايا GL261 الغازية الحد الأدنى من تلقاء نفسها ولكن عندما مثقف مع الخلايا الدبقية الصغيرة زادت قدرة الغازية بنحو 10 أضعاف.

نلاحظ تأثير مماثل باستخدام خطوط الخلايا البشرية. في الشكل (3)، والخلايا U87 (ملطخة 5 chloromethylfluorescein ثنائي الأسيتات (CMFDA) الأخضر) معارض 5-6 الغزو أعلى أضعاف عندما cocultured مع متباينة خلايا THP-1. THP-1 هو خط البشري الوحيدات خلية (مشتقة من مريض سرطان الدم الحاد الوحيدات) التي يمكن أن تكون ديfferentiated إلى حالة تشبه البلاعم باستخدام خلات phorbol ميريستات (سلطة النقد الفلسطينية) 15. المتباينة THP-1 خلايا عرض العديد من خصائص الضامة الإنسان مثل إفراز السيتوكينات والقدرة على تنفيذ البلعمة.

بدلا من ذلك، غزو الخلايا يمكن قياسها عن طريق دمجها في مصفوفة وتصفيح هذا مباشرة على مرشح في إدراج الغرفة. ليزر متحد البؤر المجهري يمكن استخدامها لإنتاج سلسلة من الصور التي تنتج التمثيل ثلاثي الأبعاد (Z-كومة). على غرار ما لوحظ في غرفة الفحص المغلفة المصفوفة (كما هو موضح في الشكلين 2-3)، وcoculture من الخلايا الدبقية الصغيرة (ملطخة CMPTX الأحمر) يحفز خلايا GL261 (CMFDA الأخضر) لغزو مقاسا عدد من الخلايا التي عبروا على الجانب السفلي من مرشح (الشكل 4). هذا الشكل لديه ميزة إضافية تتمثل في أن تكون قادرة على تصور التفاعلات خلية خلية محتملة بين glioخلايا ورم أرومي والخلايا الدبقية الصغيرة خلال الغزو. في الواقع، يبدو أن الخلايا الدبقية الصغيرة لربط بشكل وثيق مع خلايا الورم مع وقف التنفيذ في مصفوفة 3D (الشكل 5). إذا كان المطلوب تحليل نقطة النهاية فقط ومتحد البؤر الليزر ليست متاحة للاستخدام، غرف الخلية يمكن تنظيفها كما هو موضح في غرف مصفوفة المغلفة. ثم يمكن تحديد عدد الخلايا المتبقية (الغازية) عن طريق عد باستخدام الصور التي تم الحصول عليها من المجهر epifluorescent القياسية. الفيلم 1 يدل على تجميع الأبعاد الثلاثة مثل هذا الفحص.

. الغزو توضح تخطيطي للبروتوكولين مختلفة ليعاير الدبقية الصغيرة / حفز البلاعم ورم أرومي دبقي خلية لوحة أعلى المغلفة قبل غرفة مصفوفة فحص الغزو (القسم 2): الشكل 1. وتبين اللوحة السفلية 3D فحص غزو مصفوفة (القسم 3). شخصية مقتبسة من9. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2. الخلايا الدبقية الصغيرة (MG) تعزيز GL261 ورم أرومي دبقي الخلية الغزو. (A) صور الممثل غزو الخلايا GL261 (التعبير عن mCherry) في ظل غياب (اللوحة اليسرى، GL261 وحده) أو وجود الخلايا الدبقية الصغيرة (اللوحة اليمنى، GL261 + MG) تم دمج ومطلي على غرف المغلفة مصفوفة، تليها الحضانة لمدة 48 ساعة وبعد ذلك تقييم عدد من الخلايا التي عبروا التصفية. الصور التي يتم التقاطها باستخدام الهدف 10X. شريط مقياس = 400 ميكرومتر. (ب) الكميات من فحص تعول فقط الخلايا GL261 الغازية (الحمراء). أظهرت البيانات يعني ± SEM من ثلاث تجارب مستقلة. (C) الكميات من الغزو GL261 حفز الخلايا الدبقية الصغيرة في presenc(ه) من الدوائي gefitinib مثبطات (5 ميكرومتر)، JNJ-28312141 (10 ميكرون)، PLX3397 (1 ميكرومتر)، PLX5562 (1 ميكرومتر). البيانات المعروضة هي متوسط ± SEM من ست تجارب مستقلة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 3. THP1 الضامة • تعزيز U87 ورم أرومي دبقي غزو الخلايا. (A) صور الممثل غزو الخلايا U87 ملطخة CMFDA الأخضر مطلي على غرف المغلفة المصفوفة وحدها (اللوحة اليسرى، U87) أو مع الضامة THP1 متباينة (اللوحة اليمنى، U87 + THP1)، تليها الحضانة لمدة 24 ساعة ومن ثم تقييم عدد الخلايا التي عبرت التصفية. الصور الملتقطة باستخدام الهدف 10X. مقياس شريط = 400 ميكرومتر. (ب) الكميات من فحص تعول فقطخلايا U87 الغازية (الخضراء). البيانات المعروضة هي متوسط ​​± SEM من عشر تجارب مستقلة.

. الشكل 4. 3D الغزو الفحص من GL261 ودبقية Coculture (A) الصور المعروضة هي التوقعات من Z-سلسلة من الصور من خلايا GL261 (ملطخة CMFDA الأخضر) جزءا لا يتجزأ من المصفوفة وحدها (اللوحة اليسرى، GL261) أو مع الخلايا الدبقية الصغيرة الفئران ( وصفت مع CMPTX الأحمر، لوحة اليمنى. GL261 + MG). وكانت التوقعات-Z من أسفل 4 شرائح من المكدس صورة التي تشمل الجزء السفلي من مرشح الدائرة، وبالتالي تمثل الخلايا الغازية. شريط مقياس = 200 ميكرومتر. (ب) الكميات من خلايا GL261 (الأخضر) وقررت أن يكون على الجانب السفلي من مرشح كما هو موضح أعلاه. تم تحديد العدد الكلي للغزو الخلايا GL261 وتطبيع لتلك الخلايا GL261 في الأحادية. تمثل البيانات الواردة في المتوسط ​​± SEM من 3 تجارب مستقلة، أجريت في مكررة (الرقم مقتبس من 10). الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ويسلط الضوء على الشكل 5. صورة من شريحة داخل كومة 3D من GL261 (الخضراء) والخلايا الدبقية الصغيرة (الحمراء) Coculture جزءا لا يتجزأ في مصفوفة. GL261 والتفاعلات الخلية الدبقية الصغيرة مع السهام البيضاء. شريط مقياس = 100 ميكرومتر.

فيلم 1: ورم أرومي دبقي والخلايا الدبقية الصغيرة التفاعل في 3D الدوران حول المحور العاشر من الإسقاط 3D من كامل Z سلسلة من الصور التي التقطت من GL261 (الخضراء) والخلايا الدبقية الصغيرة (الحمراء) coculture جزءا لا يتجزأ من أماهتريكس. شرائح هي في 5 ميكرومتر الزيادات. الرجاء انقر هنا لعرض هذا الفيديو.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.