يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

في فيفو جهاز الاستشعار البيولوجي المسارات غير أفكارك كاسباس آخر في ذبابة الفاكهة

8.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53992

⸱

نوفمبر 27, 2016

 ,  ,  , 
1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins University Bloomberg School of Public Health, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong

في هذه المقالة

ملخص

للكشف عن الخلايا السليمة في الحيوانات كلها التي تحتوي على مستويات منخفضة من النشاط كاسباس، تم إنشاء جهاز الاستشعار البيولوجي حساسة للغاية المعينة CaspaseTracker لذبابة الفاكهة. تم الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي التي تعتمد على كاسباس في الخلايا السليمة عاش فترة طويلة في جميع أنحاء الأعضاء الداخلية للحيوانات الكبار تربى في ظل ظروف الأمثل في ظل غياب المحفزات الموت.

الملخص

Caspases هي الوسطاء الرئيسيين لموت الخلايا المبرمج من خلال نشاطها المحلل للبروتين. عندما يتم تنشيط الكاسباسات في الخلايا إلى مستويات يمكن اكتشافها بواسطة التقنيات المتاحة ، يفترض عموما حدوث موت الخلايا المبرمج بعد ذلك بوقت قصير. يمكن أن تشق الكاسباسات العديد من المكونات الوظيفية والهيكلية لتسبب تدميرا سريعا وكاملا للخلايا في غضون بضع دقائق. ومع ذلك ، تشير الأدلة المتراكمة إلى أنه في الخلايا السليمة الطبيعية ، يكون لنفس الكاسباسات وظائف أخرى ، على الأرجح عند مستويات إنزيمية أقل. تم إعاقة دراسات نشاط الكاسباز غير المبرمج بسبب الصعوبات في الكشف عن المستويات المنخفضة من نشاط الكاسباز وتتبع مصير الخلية النهائي في الجسم الحي. هنا ، نوضح استخدام مراسل كاسباز شديد الحساسية ، CaspaseTracker ، والذي يصنف بشكل دائم الخلايا التي تعرضت لنشاط الكاسباز في كاملة. يعبر هذا المستشعر الحيوي CaspaseTracker ثنائي اللون في الجسم الحي ذبابة الفاكهة عن البروتين الفلوري الأحمر (RFP) بشكل عابر للإشارة إلى نشاط الكاسباز الحديث أو المستمر ، ويعبر بشكل دائم عن البروتين الفلوري الأخضر (GFP) في الخلايا التي شهدت نشاط الكاسباز في أي وقت في الماضي لكنها لم تموت. الأهم من ذلك ، أن هذا المستشعر الحيوي المعتمد على الكاسباز في الجسم الحي يكشف بسهولة عن وجود نشاط كاسباز غير موت الخلايا المبرمج في أنسجة أنظمة الأعضاء في جميع أنحاء الذبابة البالغة. يتضح ذلك باستخدام تشريح التركيب الكامل للذباب الفردي للكشف عن نشاط المستشعر الحيوي في الخلايا السليمة في جميع أنحاء الدماغ والأمعاء والأنابيب المالبية والقلب وقنوات المبيض والأنسجة الأخرى. يكتشف CaspaseTracker نشاط الكاسباز غير المبرمج في الخلايا طويلة العمر ، حيث يتم الكشف عن نشاط المستشعر الحيوي في الخلايا العصبية البالغة وفي الأنسجة الأخرى بعد 10 أيام على الأقل من تنشيط الكاسباز. يعمل هذا المستشعر الحيوي كأداة مهمة للكشف عن الأدوار والآليات الجزيئية لنشاط الكاسباز غير المبرمج في الحية.

المقدمة

Caspases هي البروتياز السيستين التي تتوسط موت الخلايا أفكارك التي كتبها الشق العديد من البروتينات داخل الخلايا بعد مخلفات اسبارتاتي الرئيسية. على سبيل المثال، caspases البادئ تفعيل caspases المستجيب، nucleases الحمض النووي derepress، مكونات هيكل الخلية يلتصق وتغير تكوين الدهون أغشية الخلايا لتفكيك بسرعة الخلايا وتحفيز الاعتراف بها والغمر من الخلايا التي تتخلص من الجثث الخلية المجاورة. 1-4 ويقدر أن المليارات من الخلايا تموت يوميا في جسم الإنسان، وموت الخلايا المبرمج هو آلية هامة من موت الخلايا السرطانية الناجمة عن العلاج الكيميائي. 5 مجموعة مختلفة من caspases يمكن أن يسبب موت الخلايا عن طريق العمليات غير أفكارك واضحة لتنشيط المناعة الفطرية. 6 لذلك، وقد ركزت معظم البحوث حول caspases على وظائف الموالية للموتهم.

ومن المثير للاهتمام، كشفت أدلة في وقت مبكر في الحقل الذي نفس caspases المسؤولة عن تعزيز موت الخلايا أيضا غير الموت وunctions. وقد أثبتت الدراسات الرائدة التي caspases يشاركون في الوظائف الخلوية المتنوعة في الخلايا السليمة، بما في ذلك تنظيم تكاثر الخلايا والهجرة خلال مرحلة التطور الجنيني. مطلوبة 7-9 Caspases لتفريد النطف في ذبابة الفاكهة 10،11، من أجل الحيلولة دون وnecroptotic مسار موت الخلايا البديل في الفئران 12،13، وتجهيز الرنا الميكروي في C. ايليجانس. 14،15 في ربما تورط الأطول عمرا الخلايا، الخلايا العصبية، caspases والآلات أفكارك أخرى في تنظيم نشاط الخلايا العصبية عن طريق تقليم النهايات متشابك، وهي عملية يعتقد أنه ضروري لتعزيز نقاط الاشتباك العصبي الأخرى للتعلم والذاكرة. 16- 18 فمن الممكن أن caspases تسهل التقليم متشابك من نوع مصغرة موت الخلايا المبرمج للتوقعات العصبية صغيرة دون موت الخلايا كله. 19 ومع ذلك، caspases قد يكون لها وظائف بديلة لا علاقة لها بأحداث مثل موت الخلايا المبرمج. 20،21 الدور المزدوجفي الحياة والموت ليست فريدة من نوعها لcaspases. بي سي إل-2 البروتينات الأسرة والسيتوكروم ج لها أدوار في قطاع الطاقة الخلوية في الخلايا السليمة ولكن هي أيضا جزء من مسار أفكارك الأساسية التي يتم تفعيلها من خلال أنواع كثيرة من الإجهاد خلية 22-25 على الرغم من أن لم يثبت، فإنه يبدو من المنطقي أن تطور ربطت اليوم -jobs إلى الموت فرصة عمل خلال نفس الجزيئات لضمان القضاء في الوقت المناسب من الخلايا غير صالحة أو غير مرغوب فيها.

في الوقت الحاضر، ليست مفهومة الآليات الجزيئية النشاط كاسباس غير أفكارك، وأيضا لا يعرف مدى النشاط كاسباس غير أفكارك أثناء التطور الجنيني وفي أنسجة البالغين. ويتمثل التحدي الرئيسي هو صعوبة في التمييز أيام عمل من الموت ظائف caspases. وعلى النقيض من الخلايا وpyroptosis، عندما يتم تضخيمه النشاط كاسباس التي كتبها شلال بروتين، ومن المتوقع أن تحدث على مستويات أدنى من النشاط الأنزيمي، على الأرجح دون الكشف عن العديد من ميتاليك يتوفر-وظائف اليوم من caspasesاذكر.

قبل العمل المقدم هنا، وضعت غيرها من مجموعة متنوعة من أجهزة الاستشعار كاسباس لأغراض مختلفة. وأجهزة الاستشعار SCAT (على سبيل المثال، ECFP-DEVD-الزهرة) كشف بسرعة في الوقت الحقيقي النشاط كاسباس في الخلايا المستزرعة والأنسجة الحيوانية باستخدام الحنق. 26،27 وبعد انشقاق كاسباس، شاردة GFP المستهدفة النووية من Apoliner (mCD8-RFP-DQVD- nucGFP) يخضع لإعادة المركزية التحت خلوية في غضون دقائق عند المشقوق في البلازما غشاء حبل من caspases. 28 وبالمثل، ApoAlert-pCaspase3 الاستشعار (NES-DEVD-YFP-NLS) relocalizes من العصارة الخلوية إلى النواة على الانقسام كاسباس. 29،30 أكثر في الآونة الأخيرة، وحامل اللون في iCasper تم هندستها بذكاء ليتألق عندما المشقوق من قبل caspases، والسماح الكشف عن نشاط جهاز الاستشعار البيولوجي في الوقت الحقيقي في الخلايا العصبية للأجنة ذبابة الفاكهة، ولكن في المقام الأول بالتعاون مع موت الخلايا التنموي. فاة 31 كاسباس التي تعتمد على الخلايا العصبية الشمية خلال الشيخوخة كان demonstقام بتقييمه المناعية الكشف عن شكل المشقوق كاسباس من أجهزة الاستشعار CPV (على سبيل المثال، mCD8-PARP فينوس). 32،33 الأهم من ذلك، تم الكشف عن شكل تفعيلها من كاسباس 3 في غياب موت الخلايا التي immunostain حساس في العمود الفقري لل الخلايا العصبية مثقف، وفي سوما باستخدام مضان تعتمد كاسباس من الصبغة مراسل CellEvent النووي، ولكن واجه صعوبات بسبب الصور سمية، على الرغم من موت الخلايا تأخر حتى بعد إزالة العمود الفقري. 19 وهكذا، هناك حاجة إلى أجهزة الاستشعار كاسباس جديدة للكشف عن وتعقب الخلايا مع النشاط كاسباس القاعدية في الجسم الحي.

للتغلب على هذه الصعوبات، ولدت لنا رواية المزدوج جهاز الاستشعار البيولوجي اللون كاسباس، المعين CaspaseTracker. هذه الاستراتيجية يجمع بين نسخة معدلة من ذبابة الفاكهة كاسباس الحساسة Apoliner جهاز الاستشعار البيولوجي 28 مع ذبابة الفاكهة G-TRACE نظام FRT recombinase 34 لتسمية بشكل دائم وتعقب الخلايا في الجسم الحي. <سوب> 35 نظام G-TRACE تنشيط GAL4-يسمح مستويات منخفضة جدا من caspases لتفعيل CaspaseTracker، مما أدى إلى التعبير طلب تقديم العروض في السيتوبلازم والتعبير GFP المستهدفة النووي دائم في أي خلية التي شهدت من أي وقت مضى النشاط كاسباس 35 يمكن هذا النظام تسمية الخلايا في جميع أنحاء الحياة في الحيوانات كلها باستخدام ذبابة الفاكهة، نظام نموذجي لين العريكة وتستخدم على نطاق واسع لدراسة caspases وموت الخلايا. 36-38

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. إعداد الذباب CaspaseTracker

  1. لإعداد CaspaseTracker (DQVD) يطير للتجارب، تنفيذ هذا الصليب: يو بي آي-CaspaseTracker ز س-TRACE (UAS-طلب تقديم العروض، UAS-FLP، يو بي آي> وقف> GFP-NLS)، عن طريق نقل 7-10 إناث البكر (أو الذكور) الذباب يحمل كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي الركيزة mCD8-DIAP1-GAL4 مدفوعا المروج اليوبيكويتين 35 جنبا إلى جنب مع نفس العدد من الذكور (أو أنثى) الذباب G-الشحيحة، التي لديها ثاني موازن كروموسوم CYO لتجنب الفتك من مزيج متماثل من ز- TRACE (UAS-طلب تقديم العروض، UAS-FLP، ويو بي آي> وقف> GFP-NLS) 34. مكان الذباب في قارورة المواد الغذائية الطازجة مع عجينة الخميرة الطازجة كمصدر للبروتين.
  2. احتضان الملفات عند 18 درجة مئوية لمدة 5-7 أيام (بحد أقصى 2 أسابيع) ثم قم بإزالة الأم الذباب من القنينة لتجنب الاكتظاظ مع ذرية جديدة، وإقامة قارورة تربية جديدة.
  3. تستمر الحضانة عند 18 درجة مئوية حتى الذباب ذرية eclose. حدد غير CYO-[غير جعنوان urlY الجناح] ذرية من النمط الجيني الصحيح من CaspaseTracker، والتي هي المعدلة وراثيا لCaspaseTracker وG-العناصر النزرة 35.
  4. في وقت واحد، وتوليد الرقابة الأبوية الذباب w118 غير المعدلة وراثيا وكاسباس حساسة (DQVA) الذباب في موازاة ذلك للتحقق من طلب تقديم العروض CaspaseTracker محددة ومضان GFP.
  5. أداء PCR التنميط الجيني لتأكيد الملفات مع CaspaseTracker باستخدام بادئات: 5'-TCCCCCGGGCTGCAGGAATTC، 3'-TGGAATTGGGGTACGTCTAGA، إنتاج منتج 3،897 سنة مضت. لالتنميط الجيني مواضع G-تتبع، واستخدام البادئات التالية لGFP (474 ​​بي بي)، 5'-CAC GAC عقاري عقاري مجموعة الاهلي TCC دول مجلس التعاون الخليجي ATG CCC G، 3'-CTT GTA CAG جنة مكافحة الإرهاب GTC CAT دول مجلس التعاون الخليجي GAG AGT GAT C. لطلب تقديم العروض (258 بي بي)، 5'-GGC TGC عقاري ATC TAC مجموعة الاهلي GTG مجموعة الاهلي عقاري ATC GG، 3'-GAT GTC CAG CTT GGA GTC CAC GTA GTA GTA GC. وFlpase (655 بي بي)، 5'- CCACCTAAGGTGCTTGTTCGTCAGTTTGTGG، 3'دول مجلس التعاون الخليجي TAC TAA شركة الخليج المتحدة TTG تكت TTG تكت CTG TCA C. على التنميط الجيني GAL4 في ناقلات pUWR (554 بي بي)، 5'-غا الائتلاف CAC CTT CGC ATC الهيئة العامة للضرائب CAGTCA شركة الخليج المتحدة، 3'-TGG AAT TGG GGT ACG تكت AGA.

2. الأنسجة إعداد وتلطيخ والتركيب

  1. لتشريح ذبابة، ومنع الأنسجة تشريح من الالتصاق على نصائح من البلاستيك ماصة وأنابيب الطرد المركزي، نصائح معطف وأنابيب مع الزلال 1٪ المصل البقري (BSA) الذائب في الماء.
  2. تشريح الذباب على وسادة سيليكون باستخدام ملقط.
    1. لتجنب إتلاف نصائح من ملقط على سطح صلب عند إجراء تشريح الأنسجة، نفذ تشريح على سطح السيليكون. لصنع لوحات السيليكون تشريح، تذوب السيليكون في عدة التجارية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (قائمة المواد). بعد ذوبان السيليكون، إضافة 3-4 مل إلى 60 ملم الأنسجة صحن قطره الثقافة. يمكن إعادة استخدامها أطباق السيليكون.
    2. تخدير ذبابة مع CO 2، وتحويلها إلى لوحة سيليكون مع 1 مل من برنامج تلفزيوني الباردة. إدخال CO 2 إلى قارورة تحتوي على الطاير باستخدام blowgun، ومن ثم نقل ر ذبابة تخديرالزراعة العضوية الوسادة التي لديها امدادات CO 2.
    3. استخدام زوج من ملقط لعقد رئيس الطاير، والزوج الثاني من الملقط لسحب الصدر في الاتجاه المعاكس لقطع رأس ذبابة من الجسم تغطي دون الإضرار العلاقة بين الرأس والمعى الأمامي.
    4. استخدام 2 أزواج من الملقط لإزالة الأجنحة والأرجل من القفص الصدري.
    5. استخدام زوج من ملقط لعقد الصدر، وزوج آخر من الملقط لسحب البطن لفصلها عن الصدر مرة أخرى دون الإضرار العلاقة بين المعى الأمامي والمعي المتوسط.
    6. تشريح الأعضاء الداخلية بما في ذلك الدماغ، الأمعاء، الأنابيب المالبيغية والمبايض كما هو موضح سابقا. 39-41
    7. إزالة كل قطعة من إهاب والهيئات الدهون مع ملقط كما تنتج هذه الأنسجة تألق ذاتي قوي. ويلزم الصبر والممارسة لإعداد نظام الجهاز كامل كما هو مبين.
  3. نقل الأنسجة تشريح إلى 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي، وإصلاح الأنسجة واي0.5 مل من 4٪ لامتصاص العرق في برنامج تلفزيوني (الفوسفات مخزنة المالحة) في RT لمدة 20 إلى 30 دقيقة مع التناوب في الظلام عشر لتجنب طلب تقديم العروض تبيض وGFP في الأنسجة. تجنب تثبيت لفترة طويلة التي يمكن أن تعرض النتائج تلطيخ لاحقة.
  4. إزالة امتصاص العرق من قبل pipetting لطيف ويغسل 3 مرات مع 0.5 مل PBST (PBS + 0.1٪ تريتون X-100) في RT.
  5. Permeabilize الأنسجة مع 0.5 مل PBST في 4 درجات مئوية خلال الليل مع اهتزاز لطيف. قد يسبب حضانات أقصر ناقصة permeabilization وتلطيخ تسوية النتائج.
    1. إذا كان ذلك ضروريا للحد من تلوين الخلفية، والنظر في احتضان الأنسجة في 0.5 مل PBST مع 1٪ BSA، بدلا من برنامج تلفزيوني.
  6. غسل الأنسجة 3 مرات مع 0.5 مل PBST.
  7. وصمة عار النوى والأكتين الخيطية (F-الأكتين)، وتطبيق 0.5 مل PBST مع 10 ميكروغرام / مل من هويشت 33342 صبغ النووي الأزرق و 0.3 ميكرومتر اليكسا فلور وصمة عار 633 Phalloidin F-أكتين واحتضان في وقت واحد مع الأنسجة لمدة 1 ساعة على RT ثإيث تناوب لطيف في الظلام. تجنب تلطيخ لفترات طويلة حيث سيؤدي ذلك إلى زيادة الخلفية.
    1. لالمناعية، واحتضان الأنسجة الثابتة وpermeabilized مع 0.1٪ تريتون X-100 في 0.5 مل PBS بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، وصمة عار مع 1: 100 التخفيف من الأجسام المضادة لمكافحة ELAV أو مع 1: 200 التخفيف من معاداة كاسباس 3 بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (300 ميكرولتر). متابعة من قبل الأجسام المضادة الثانوية المقابلة المخفف 1: 100 واحتضان لمدة 1-3 ساعة عند RT. انظر قائمة المواد للحصول على معلومات الأجسام المضادة المحددة.
  8. غسل الأنسجة 3 مرات، في كل لمدة 5 دقائق في 0.5 مل PBST مع دوران طيف.
  9. مع الماصة، وإزالة جميع PBST، ثم قم بإضافة 200 ميكرولتر مكافحة التبييض وكيل تصاعد (انظر المواد) لتغطية كامل الأنسجة لمدة 1-3 ساعة عند RT، أو 4 درجات مئوية خلال الليل. سوف الأنسجة المثلى التي استوعبت تماما وكيل تصاعد تنزل الى قاع الأنبوب.
  10. قبل تنظيف شريحة زجاجية مع الماء أو 70٪ من الإيثانول ونقل الأنسجة مع تصاعد وكيل إلى الزجاجالصورة الشرائح.
  11. المكان بعناية زلة غطاء زجاجي على الأنسجة. تطبيق الفازلين على شريحة زجاجية وانزلاق الغطاء لتفادي تدمير الأنسجة عن طريق زيادة في الضغط. إزالة عامل إضافي المتصاعدة مع المناديل الورقية.
  12. ختم زلة تغطية من خلال تطبيق طلاء الأظافر على طول حواف غطاء زلة لتجنب تسرب من تصاعد وكلاء من الأنسجة.

3. متحد البؤر المجهري

  1. استخدام متحد البؤر برنامج التحصين الموسع ومضان المجهر المقلوب. ومع ذلك، المجاهر يصل الصحيحة يمكن أن تستخدم أيضا. إلى الأنسجة الصورة باستخدام بلاط، والحفاظ على استقرار درجة حرارة الغرفة لتجنب الانجراف التركيز والتحول من الطائرة س ص بسبب التمدد الحراري والانكماش من المكونات. نظم التحكم البيئي ونظم التعويض التركيز الانجراف تساعد على تجنب هذه المشكلة بسبب فقدان التوازن الحراري للنظام المجهر.
  2. وضع الشريحة على مرحلة من مراحل المجهر. تأخذ بعض الصور اختبار باستخدام دقة منخفضة (125 × 125 بكسل) لد تحديد العدد المناسب من البلاط اللازم لتغطية المنطقة بأسرها من الفائدة (ROI).
  3. ضبط نظام المجهر لالتقاط الصور مع دقة المسح الضوئي مثل 500 × 500 بكسل. تحديد الهدف مثل 20X NA 0.8 أو 63X NA 1.4 هدف الخطة-امزيغ لتحليل الأنسجة من خلال coverslips الزجاج، بحيث أن كل الصور (البلاط) تداخل بنسبة 20٪ على جميع الأطراف.
  4. إعداد تسلسل الصور من أطول لأقصر موجات الإثارة، كما يتسبب في ضوء الطول الموجي الطويل أقل الصور وتبييض. تسلسل من أطول لأقصر الإثارة الطول الموجي هو: (ط) 633 نانومتر لPhalloidin F-الأكتين وعن الأجسام المضادة لcaspases تفعيلها، (ب) 561 نانومتر لطلب تقديم العروض، (ج) 488 نانومتر لGFP، و (د) 405 نانومتر ل وصمة عار النووية هويشت.
  5. أثناء التصوير، وتقليل التعرض للخلايا لإثارة الليزر الفلورسنت خلال عملية التصوير لتجنب الصور وتبييض عن طريق الحد من كثافة الليزر للحصول على صور ذات جودة عالية من الأنسجة.
  6. بعدييتم جمع السحراء، دمج الصور باستخدام برنامج المجهر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

هناك نوعان من العناصر الرئيسية التي تسمح CaspaseTracker للكشف عن النشاط كاسباس في الخلايا السليمة العادية (الشكل 1A). وأول هذه هو 146 حمض أميني كاسباس شطورة ببتيد على غرار كاسباس جهاز الاستشعار البيولوجي Apoliner (الشكل 1B). 28 ويستمد هذا ببتيد من DIAP1 (ذبابة الفاكهة المانع من موت الخلايا المبرمج) التي تحتوي على طبيعيا الموقع كاسباس واحد هو المشقوق خلال الخلايا عادة من كاسباس DrICE. 42،43<...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

نحن هنا توضيح البناء والداخلية عمل من CaspaseTracker التي تسهل الكشف عن النشاط كاسباس القاعدية على نطاق واسع في الأنسجة السليمة. الخطوات الحاسمة للكشف عن النشاط كاسباس غير أفكارك في الجسم الحي هي: 1) توليد الذباب مع التحوير جهاز الاستشعار البيولوجي، 2) التحقق من وظيفة مراسل كاسباس محددة مع الضوابط المناسبة، 3) ممارسة تقنيات تشريح لمراقبة جميع أجهزة الجسم الداخلية من الكبار ذبابة الفاكهة، و4) النشاط المميز جهاز الاستشعار البيولوجي من القطع الأثرية autofluorescent....

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نشكر POLAN سانتوس ودارين Obbard عن الرسوم التوضيحية ذبابة الفاكهة في الشكل. 2A، مارسيلو جاكوبس-لورينا لاستخدام insectary JHMRI. وأيد هذا العمل من قبل زمالة مؤسسة أبحاث علوم الحياة (فرقة العمل الرفيعة المستوى)، لجنة المنح الجامعية من هونغ كونغ اوي / B-07/99 (قدم مكعبة)، والمعاهد الوطنية للصحة منح NS096677، NS037402 وNS083373 (JMH). هو لام تانغ هو زميل مؤسسة Shurl وكاي كورتشي من مؤسسة أبحاث علوم الحياة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

المواد الاستهلاكية والكواشف < / قوي > Phalloidin معرف تقنية إشارات ) التشريح < td colspan = "4" ><قوي> المعدات < / قوي >
قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Vectashieldناقلات المنتجاتH-1000تصاعد ملقط متوسط
تد بيلا# 505 (110 مم ، # 5)دومونت ملاقط درجة علم الأحياء ، الفولاذ المقاوم
للصدأ معلقة إسقاط الشرائحفيشر العلمية12-565Bالشرائح الزجاجية
Hoechst 33342المجساتالجزيئيةH1399صبغة الحمض النووي
Alexa Fluor 633 المجساتالجزيئيةA22284صبغة الأكتين
Rat-Elav-7E8A10 الأجسام المضادة للأجسام المضادة للدراساتالتنموية بنك الورم الهجين (DSHB)سجل الأجسام المضادة:  AB_528218 وصمة عار ل ذبابة الخلايا العصبية ELAV
الخلايا للجسم المضاد Clappase-3 (Asp175# 9661وصمة عار للجزء النشط من كاشف كاسباز -3
ProLong Gold المضاد للبهتانLife TechnologiesP36934للحفاظ على الفلوروفورات   ؛
ProLong Diamond Antifade MountantLife TechnologiesP36961للحفاظ على الفلوروفورات   ؛
SylGard 182 سيليكون المطاط الصناعي كيتداو كورنينج  رمز المنتج: 0001023934لألواح
LSM780 مجهر متحد البؤركارل زايسN / Aالتصوير
كارل زايس مجهر مجسم Stemi 2000Carl ZeissN / Aذبابة الفاكهة < em > تشريح
AmScope الألياف البصرية المزدوج معقوفة مجهر المضيء ، 150 & nbsp ؛ WAmScopeWBM99316مصدر الضوء
< td colspan = "4" >

المراجع

  1. Salvesen, G. S., Abrams, J. M. Caspase activation - stepping on the gas or releasing the brakes? Lessons from humans and flies. Oncogene. 23, 2774-2784 (2004).
  2. Hay, B. A., Guo, M. Caspase-dependent cell death in Drosophila. Annu Rev Cell Dev Biol. 22, 623-650 (2006).
  3. Segawa, K., et al. Caspase-mediated cleavage of phospholipid flippase for apoptotic phosphatidylserine exposure. Science. 344, 1164-1168 (2014).
  4. Akagawa, H., et al. The role of the effector caspases drICE and dcp-1 for cell death and corpse clearance in the developing optic lobe in Drosophila. Dev Biol. , (2015).
  5. Souers, A. J., et al. ABT-199, a potent and selective BCL-2 inhibitor, achieves antitumor activity while sparing platelets. Nat Med. 19, 202-208 (2013).
  6. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Mechanisms and functions of inflammasomes. Cell. 157, 1013-1022 (2014).
  7. Bergmann, A., Steller, H. Apoptosis, stem cells, and tissue regeneration. Sci Signal. 3, re8(2010).
  8. Hyman, B. T., Yuan, J. Apoptotic and non-apoptotic roles of caspases in neuronal physiology and pathophysiology. Nat Rev Neurosci. 13, 395-406 (2012).
  9. Juraver-Geslin, H. A., Durand, B. C. Early development of the neural plate: new roles for apoptosis and for one of its main effectors caspase-3. Genesis. 53, 203-224 (2015).
  10. Arama, E., Agapite, J., Steller, H. Caspase activity and a specific cytochrome C are required for sperm differentiation in Drosophila. Dev Cell. 4, 687-697 (2003).
  11. Kaplan, Y., Gibbs-Bar, L., Kalifa, Y., Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Gradients of a ubiquitin E3 ligase inhibitor and a caspase inhibitor determine differentiation or death in spermatids. Dev Cell. 19, 160-173 (2010).
  12. Kaiser, W. J., et al. RIP3 mediates the embryonic lethality of caspase-8-deficient mice. Nature. 471, 368-372 (2011).
  13. Gunther, C., et al. Caspase-8 regulates TNF-alpha-induced epithelial necroptosis and terminal ileitis. Nature. 477, 335-339 (2011).
  14. Weaver, B. P., et al. CED-3 caspase acts with miRNAs to regulate non-apoptotic gene expression dynamics for robust development in C. elegans. Elife. 3, e04265(2014).
  15. Ge, X., et al. A novel mechanism underlies caspase-dependent conversion of the dicer ribonuclease into a deoxyribonuclease during apoptosis. Cell Res. 24, 218-232 (2014).
  16. Fannjiang, Y., et al. BAK alters neuronal excitability and can switch from anti- to pro-death function during postnatal development. Dev Cell. 4, 575-585 (2003).
  17. Ofengeim, D., et al. N-terminally cleaved Bcl-xL mediates ischemia-induced neuronal death. Nat Neurosci. 15, 574-580 (2012).
  18. Li, Z., Sheng, M. Caspases in synaptic plasticity. Mol Brain. 5, 15(2012).
  19. Erturk, A., Wang, Y., Sheng, M. Local pruning of dendrites and spines by caspase-3-dependent and proteasome-limited mechanisms. J Neurosci. 34, 1672-1688 (2014).
  20. Campbell, D. S., Okamoto, H. Local caspase activation interacts with Slit-Robo signaling to restrict axonal arborization. J Cell Biol. 203, 657-672 (2013).
  21. Feinstein-Rotkopf, Y., Arama, E. Can't live without them, can live with them: roles of caspases during vital cellular processes. Apoptosis. 14, 980-995 (2009).
  22. Li, P., et al. Cytochrome c and dATP-dependent formation of Apaf-1/caspase-9 complex initiates an apoptotic protease cascade. Cell. 91, 479-489 (1997).
  23. Lewis, J., et al. Inhibition of virus-induced neuronal apoptosis by Bax. Nat Med. 5, 832-835 (1999).
  24. Chen, Y. B., et al. Bcl-xL regulates mitochondrial energetics by stabilizing the inner membrane potential. J Cell Biol. 195, 263-276 (2011).
  25. Yi, C. H., et al. Metabolic regulation of protein N-alpha-acetylation by Bcl-xL promotes cell survival. Cell. 146, 607-620 (2011).
  26. Takemoto, K., Nagai, T., Miyawaki, A., Miura, M. Spatio-temporal activation of caspase revealed by indicator that is insensitive to environmental effects. J Cell Biol. 160, 235-243 (2003).
  27. Takemoto, K., et al. Local initiation of caspase activation in Drosophila salivary gland programmed cell death in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 104, 13367-13372 (2007).
  28. Bardet, P. L., et al. A fluorescent reporter of caspase activity for live imaging. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 13901-13905 (2008).
  29. Tang, H. L., et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol Biol Cell. 23, 2240-2252 (2012).
  30. Golbs, A., Nimmervoll, B., Sun, J. J., Sava, I. E., Luhmann, H. J. Control of programmed cell death by distinct electrical activity patterns. Cereb Cortex. 21, 1192-1202 (2011).
  31. To, T. L., et al. Rationally designed fluorogenic protease reporter visualizes spatiotemporal dynamics of apoptosis in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 112, 3338-3343 (2015).
  32. Florentin, A., Arama, E. Caspase levels and execution efficiencies determine the apoptotic potential of the cell. J Cell Biol. 196, 513-527 (2012).
  33. Chihara, T., et al. Caspase inhibition in select olfactory neurons restores innate attraction behavior in aged Drosophila. PLoS Genet. 10, e1004437(2014).
  34. Evans, C. J., et al. G-TRACE: rapid Gal4-based cell lineage analysis in Drosophila. Nat Methods. 6, 603-605 (2009).
  35. Tang, H. L., Tang, H. M., Fung, M. C., Hardwick, J. M. In vivo CaspaseTracker biosensor system for detecting anastasis and non-apoptotic caspase activity. Sci Rep. 5, 9015(2015).
  36. Suzanne, M., Steller, H. Shaping organisms with apoptosis. Cell Death Differ. 20, 669-675 (2013).
  37. Jenkins, V. K., Timmons, A. K., McCall, K. Diversity of cell death pathways: insight from the fly ovary. Trends Cell Biol. 23, 567-574 (2013).
  38. Sarkissian, T., Timmons, A., Arya, R., Abdelwahid, E., White, K. Detecting apoptosis in Drosophila tissues and cells. Methods. 68, 89-96 (2014).
  39. Williamson, W. R., Hiesinger, P. R. Preparation of developing and adult Drosophila brains and retinae for live imaging. J Vis Exp. , (2010).
  40. Wong, L. C., Schedl, P. Dissection of Drosophila ovaries. J Vis Exp. , e52(2006).
  41. Tauc, H. M., Tasdogan, A., Pandur, P. Isolating intestinal stem cells from adult Drosophila midguts by FACS to study stem cell behavior during aging. J Vis Exp. , e52223(2014).
  42. Ditzel, M., et al. Degradation of DIAP1 by the N-end rule pathway is essential for regulating apoptosis. Nat Cell Biol. 5, 467-473 (2003).
  43. Li, X., Wang, J., Shi, Y. Structural mechanisms of DIAP1 auto-inhibition and DIAP1-mediated inhibition of drICE. Nat Commun. 2, 408(2011).
  44. Yi, S. X., Moore, C. W., Lee, R. E. Rapid cold-hardening protects Drosophila melanogaster from cold-induced apoptosis. Apoptosis. 12, 1183-1193 (2007).
  45. Drummond-Barbosa, D., Spradling, A. C. Stem cells and their progeny respond to nutritional changes during Drosophila oogenesis. Dev Biol. 231, 265-278 (2001).
  46. Fan, Y., Bergmann, A. The cleaved-Caspase-3 antibody is a marker of Caspase-9-like DRONC activity in Drosophila. Cell Death Differ. 17, 534-539 (2010).
  47. Fogarty, C. E., Bergmann, A. Detecting caspase activity in Drosophila larval imaginal discs. Methods Mol Biol. 1133, 109-117 (2014).
  48. Koushika, S. P., Lisbin, M. J., White, K. ELAV, a Drosophila neuron-specific protein, mediates the generation of an alternatively spliced neural protein isoform. Curr Biol. 6, 1634-1641 (1996).
  49. Albeck, J. G., et al. Quantitative analysis of pathways controlling extrinsic apoptosis in single cells. Mol Cell. 30, 11-25 (2008).
  50. Galluzzi, L., et al. Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring cell death in higher eukaryotes. Cell Death Differ. 16, 1093-1107 (2009).
  51. Holland, A. J., Cleveland, D. W. Chromoanagenesis and cancer: mechanisms and consequences of localized, complex chromosomal rearrangements. Nat Med. 18, 1630-1638 (2012).
  52. Green, D. R. Means to an end : apoptosis and other cell death mechanisms. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2011).
  53. Chau, B. N., et al. Signal-dependent protection from apoptosis in mice expressing caspase-resistant Rb. Nat Cell Biol. 4, 757-765 (2002).
  54. Lin, Y., Devin, A., Rodriguez, Y., Liu, Z. G. Cleavage of the death domain kinase RIP by caspase-8 prompts TNF-induced apoptosis. Genes Dev. 13, 2514-2526 (1999).
  55. Han, M. H., et al. The novel caspase-3 substrate Gap43 is involved in AMPA receptor endocytosis and long-term depression. Mol Cell Proteomics. 12, 3719-3731 (2013).
  56. Nakagawa, A., Shi, Y., Kage-Nakadai, E., Mitani, S., Xue, D. Caspase-dependent conversion of Dicer ribonuclease into a death-promoting deoxyribonuclease. Science. 328, 327-334 (2010).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

ذبابة الفاكهة (Drosophila Melanogaster)المستشعر الحيوي CaspaseTrackerالمراسل الفلوريالمجهر البؤريتشريح الأنسجةالتهجين الوراثيتعبير البروتينات RFP وGFPانقسام الكاسباز
في فيفو جهاز الاستشعار البيولوجي المسارات غير أفكارك كاسباس آخر في ذبابة الفاكهة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.