مقالة منهجية

من خلال المرآة: المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية من الخلايا واحدة لدراسة العلاج المضادة للسرطان

DOI:

10.3791/53994

⸱

مايو 14, 2016

 , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Colorado, Boulder

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا ، نصف طريقة للفحص المجهري طويل المدى لتتبع الخلايا المفردة طوليا استجابة للعلاجات المضادة للسرطان.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

استجابة الخلايا وحيدة إلى الأدوية المضادة للسرطان تساهم بشكل كبير في تحديد استجابة السكان، وبالتالي تعتبر عاملا رئيسيا يسهم في النتيجة الإجمالية. Immunoblotting، التدفق الخلوي والتجارب خلية ثابتة وغالبا ما تستخدم لدراسة كيفية استجابة الخلايا للأدوية المضادة للسرطان. وهذه الأساليب هي مهمة، ولكن لديهم العديد من أوجه القصور. التباين في ردود المخدرات بين السرطان والخلايا الطبيعية، وبين خلايا المنشأ السرطانية المختلفة، وعابرة وردود نادرة من الصعب أن نفهم باستخدام فحوصات المتوسط ​​السكان ودون أن تكون قادرة على تتبع مباشرة وتحليلها بشكل طولي. المجهر بشكل خاص مناسبة تماما لصورة الخلايا الحية. التطورات في مجال التكنولوجيا تمكننا من روتيني خلايا الصورة في القرار الذي تمكن ليس فقط تتبع الخلية، ولكن أيضا مراقبة مجموعة متنوعة من الاستجابات الخلوية. وصفنا هذا النهج في التفاصيل التي تسمح للتصوير المستمر الوقت الفاصل بينالخلايا خلال الاستجابة للدواء لفي الأساس طالما رغبت في ذلك، عادة ما يصل إلى 96 ساعة. استخدام الاختلافات في النهج، وخلايا يمكن رصدها لأسابيع. مع توظيف المشفرة وراثيا أجهزة الاستشعار الفلورسنت العديد من العمليات، ومسارات والاستجابات يمكن اتباعها. وتبين لنا الأمثلة التي تشمل تتبع النوعي والكمي لنمو الخلايا وتقدم دورة الخلية، وديناميات كروموسوم، الحمض النووي من التلف، وموت الخلايا. نحن أيضا مناقشة الاختلافات في الأسلوب ومرونته، وتسليط الضوء على بعض المخاطر المشتركة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المجهر الخلية الحية وتتبع طولية من الخلايا واحدة ليست تقنية جديدة. من أقرب المجاهر، وقد لاحظ المتحمسين والعلماء ودرس الخلايا وحيدة والكائنات، تصرفاتهم، والتنمية 1-3. ومن الأمثلة الشهيرة من أواخر ديفيد روجرز في جامعة فاندربيلت في 1950s يظهر العدلات الإنسان في بقعة من الدم مطاردة بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية، وفي نهاية المطاف عملية البلعمة (4). هذا الفيلم الخلية الحية هو مثال ممتاز لكيفية عمليات متعددة يمكن ملاحظتها والمترابطة في تجربة واحدة: الاستشعار من التدرج الكيميائية، والميكانيكا وسرعة الحركة خلية، خلية الأشكال ديناميكية، التصاق، والبلعمة من العوامل المسببة للأمراض.

وقد أدى ظهور المجاهر مؤتمتة بالكامل والكاميرات الرقمية حساسة للغاية في أعداد متزايدة من المحققين باستخدام المجهر لطرح الأسئلة الأساسية في بيولوجيا الخلية تتراوح ومدمج كيف تتحرك خلايا 5،6 و 7،8 تنقسم إلى العضيم ديناميات والاتجار غشاء 9-11. غير الفلورسنت، المجهري brightfield، بما في ذلك على النقيض من المرحلة (PC)، الذي حصل على جائزة نوبل للفريتس زيرنيكه في عام 1953، وعلى النقيض تدخل الفرق (DIC) تسمح لمراقبة خلايا ونوى ولكن أيضا الهياكل الفرعية الخلوية بما في ذلك حزم أنيبيب ، الكروموسومات، نويات، وديناميات العضيم، وألياف الأكتين سميكة 12. المشفرة وراثيا البروتينات الفلورية وتطوير الأصباغ الفلورية ضد عضيات أثرت بشكل كبير الوقت الفاصل بين المجهري 13-15. في حين لم يكن التركيز في هذه المادة، والتصوير في الكروية خلية وفي الموقع (intravital المجهري) باستخدام متحد البؤر والفحص المجهري multiphoton تمثل توسع آخر لهذا النهج، وهناك مواد المعلقة التي تستخدم ومناقشة هذه النهج 16-19.

ردود الخلايا لمكافحة كانكونيتم تحديد المخدرات إيه أو المنتجات الطبيعية على المستوى الجزيئي والخلوي. العلاج فهم استجابات الخلايا ومصائر التالية غالبا ما ينطوي على المقايسات سكان المتوسط ​​(على سبيل المثال، immunoblotting، تدابير جيدا الكاملة)، أو الوقت نقطة ثابتة مع كشف مناعي والتدفق الخلوي، التي تقيس الخلايا وحيدة. الاختلاف في استجابة خلية واحدة إلى المخدرات ضمن مجموعة من السكان، ولا سيما في الأورام، قد يفسر بعض التباين في استجابة ينظر عبر خطوط الخلايا والأورام التي يتم التعامل مع نفس الدواء في التشبع. على المدى الطويل نهج طولية لمتابعة خلية واحدة معينة أو مجموعة من الخلايا هو نهج أقل شيوعا ولكنها قوية جدا التي تسمح للدراسة مباشرة لمسارات استجابة الجزيئية، الظواهر المختلفة (على سبيل المثال، موت الخلية أو انقسام الخلية)، ومراقبة تقلب الخلية الى خلية ضمن مجموعة من السكان، وكيف أن هذه العوامل تساهم في ديناميات استجابة السكان 20-22. بتفاؤل، أن تكون قادرةلمراقبة وقياس ردود خلية واحدة سوف تساعد على تحسين فهمنا لكيفية عمل الأدوية، لماذا فشلوا في بعض الأحيان، وكيفية استخدامها أفضل.

تقنية طويلة الأجل الوقت الفاصل بين المجهري، وتتبع الطولي، وتحليل استجابات المخدرات هي متاحة لكثير من المحققين ويمكن أن تكون بسيطة، وذلك باستخدام الضوء فقط تنتقل إلى مراقبة ردود النمط الظاهري 20،21. المكونات الرئيسية لهذا النهج ما يلي: إعداد مناسب من الخلايا من الفائدة، المجهر الآلي مع الغرفة البيئية، متكاملة الكاميرا مع جهاز الكمبيوتر للحصول على وتخزين الصور، وبرامج لإعادة النظر في الوقت الفاصل بين وقياس وتحليل الخلايا وأية أجهزة الاستشعار الفلورسنت. ونحن نقدم بروتوكول مفصلة مع العديد من النصائح لإجراء الفحص المجهري الوقت الفاصل بين الخلايا المستزرعة لطالما عدة أيام باستخدام brightfield و / أو widefield المجهر epifluorescent. ويمكن استخدامها في أي خط الخلية التي يمكن زراعتها في ثقافة هذا البروتوكوللدراسة ردودهم على العلاجات المضادة للسرطان. نحن نقدم أمثلة على البيانات التي حصل عليها وتحليلها باستخدام متعددة مختلفة أجهزة الاستشعار الفلورسنت المشفرة وراثيا ومثال على المرحلة المجهري على النقيض، ومناقشة لفترة وجيزة أنواع مختلفة من تحقيقات، ومزايا وعيوب على المدى الطويل الوقت الفاصل بين وتتبع الطولي، ما يمكن أن يكون علمت لهذا النهج الذي يصعب فهمه من النهج غير المباشرة، وبعض الاختلافات التي نأمل أن تكون ذات فائدة وقيمة للباحثين عديمي الخبرة الذين لا يعتبر استخدام هذا النهج، والباحثين من ذوي الخبرة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يستخدم بروتوكول التالية المعلمات التي تحددها التجارب في أرقام 4 و 6 بشأن إعدادات اقتناء والظروف التجريبية. العديد من هذه المعايير يمكن تعديلها لتناسب تجارب أخرى (أي التعرض مرات، binning، قنوات الفلورسنت، الخ.). ويجب على جميع إجراءات الانضمام إلى المبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية وأن تتم الموافقة عليها من قبل لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية. تحتوي مواقع تصنيع المجهر معلومات ممتازة لتصوير الخلايا الحية.

1. المجاهر والتصوير البرمجيات

  1. أداء تصوير الخلايا الحية على مجموعة واسعة من المجاهر المقلوب. وwidefield المجاهر الأكثر شيوعا epifluorescence ومتحد البؤر القرص الغزل. هنا، استخدام المجهر widefield epifluorescence الآلي ويجهز مع 200 واط مصدر الضوء معدن هاليد.
  2. الحصول على مرحلة أعلى أو المجهر غرفة البيئية. هنا، استخدم مرحلة تيغرفة البيئية المرجع.
  3. استخدام البرمجيات التجارية لتشغيل المجهر مع المرافق لتنفيذ الوقت الفاصل بين المجهري.
  4. استخدام البرمجيات المتاحة تجاريا أو يماغيج لتحليل الصور. العديد من الأدوات التحليل الأخرى المتاحة تجاريا، وهناك برامج حسب الطلب وكثير منها قد تم نشرها 8،18.

2. تصور العمليات الخلوية والردود المظهري

  1. تصور الخلايا مع المجهري brightfield. التفاضلية النقيض من التدخل والطوري وحدها يمكن أن يكون مفيدة للغاية لدراسة الردود على الردود دواء مضاد للسرطان. ويمكن أن تشمل هذه العمليات الانقسام، حركية الخلية وموت الخلايا المبرمج.
  2. تصور هياكل الخلية، عضيات والعمليات مع أجهزة الاستشعار الفلورسنت. تحقيقات الفلورسنت هي برامج إعلامية في تتبع عمليات التحت خلوية محددة. ويمكن أن تشمل هذه الديناميات أنيبيب، الميتوكوندريا وديناميكية الشبكة الإندوبلازمية، تراكم البروتين والتعريب، والإشارات الجزيئية (على سبيل المثال، الفسفرة، الكالسيوم).

3. إعداد العينات

  1. زراعة خلايا في أطباق شهادة زراعة الخلايا في مستوى والثقافة خلية ترطيب حاضنة (على سبيل المثال، 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، 80٪ الرطوبة النسبية).
    1. زراعة خلايا HT1080 في MEM مع EBSS. استكمال وسائل الإعلام مع 10٪ FBS ت / ت، 1٪ ت / ت القلم / بكتيريا، 1٪ ت / ت البيروفات الصوديوم و 1٪ ت / ت الأحماض الأمينية غير الأساسية.
  2. يومين قبل التصوير، وخلايا لوحة 50،000 HT1080 FUCCI إلى 3 آبار من صحن القاع 12-جيدا # 1.5 الزجاج في العقيمة هود الصفحي التدفق شهادة. ضبط عدد من الخلايا مطلي إلى تحقيق ~ 60٪ التقاء لبدء التجربة. اعتمادا على خط الخلية وطبيعة التجربة كثافة الخلية قد يكون أقل.
    ملاحظة: قد يكون كثافة الخلية تأثير عميق على نمو خط الخلية وعلى النتائج التجريبية. عد الخلايا للحد من تجربة إلى تجربة variabilitذ بسبب كثافة.
    1. اعتمادا على غرفة البيئة والظروف اللازمة للتجربة، وخلايا لوحة في الصحون جيدا واحدة (عادة 35- أو 60 ملم)، 4 جيد أطباق 35 ملم، 6-، 12- أو 24-جيدا لوحات زراعة الخلايا، أو ساترة الشرائح في أشكال مختلفة. استخدام لوحات من الزجاج السفلي مع # 1.5 الزجاج كما هي الأمثل معظم العدسات موضوعية لهذا سمك الزجاج، والتصوير من خلال البلاستيك خلية ثقافة رديئة للغاية.
      ملاحظة: بعض خطوط الخلايا لا تنمو والبقاء على قيد الحياة على الزجاج. في هذه الحالات، والزجاج يمكن أن تطلى من أجل تعزيز الالتزام خلية (على سبيل المثال، بولي يسين أو الكولاجين). بعض الشركات تصنع الضوئية البلاستيكية زراعة الخلايا، يجب أن تقرر تجريبيا إذا كان هذا هو خيارا قابلا للتطبيق.

4. غرفة البيئة مجموعة المتابعة

  1. قبل أي التجريب، انشاء غرفة البيئية بحيث تعمل في ~ 80٪ الرطوبة وبالتالي فإن درجة الحرارة في موقف العينة 37 درجة مئوية. تنمو الخلايا الأكثر مثقف في 5٪ جو الهواء CO 2 / الرصيد المستحق إلى عازلة بيكربونات الصوديوم في المتوسط. اعتمادا على مجموعة المتابعة، إما تعيين وحدة تحكم البيئي إلى 5٪ CO 2، وسوف مزيج 100٪ CO 2 مع الهواء، أو استخدام ما قبل مختلطة، شهادة غاز الهواء 5٪ CO 2 / توازن. اتبع توجيهات المصنع للغاز تدفق أسعار الفائدة.
    ملاحظة: بعض خطوط الخلايا تنمو في CO 2 متوسطة مستقلة من في هذه الحالة لا يمكن الحفاظ عليه دون CO 2. وسائل الإعلام تصوير مصممة خصيصا متاح أيضا أن يحد من إضافة مركبات autofluorescent. يجب أن يتوقف النمو في أطروحات وسائل لنوع من الخلايا المطلوبة تجريبيا مسبقا.
  2. قبل التصوير، تأكد من ملأ خزان المياه (بعد توجيهات المصنع) مع الماء المقطر المعقم. بدوره على غرفة البيئية لتحديد درجة الحرارة المطلوبة ووضعه في درج المسرح المجهر. لانقاذ الغاز، لا تبدأ في التدفق في هذه المرحلة.
    ملاحظة: إذا كان هناك أي مساحة حرة بين الغرفة مرحلة أعلى ومرحلة أقحم و / أو أي توتر على الحبال اتصال إلى غرفة ذلك قد يعرض الحركة الفنية في التجربة.
    1. وضع قطعة من فيلم البارافين على حواف أقحم مرحلة الافتتاح قبل إدخال الغرفة إلى أن الزوجين إلى غرفة المرحلة، والتأكد من عدم وجود صلات وسحب على الغرفة.
  3. السماح للغرفة لكي تتوازن إلى 37 درجة مئوية. الحفاظ على درجة حرارة ثابتة لمنع التقلبات في درجات الحرارة خلال التصوير التي يمكن أن تؤثر فسيولوجيا الخلية وإدخال الانجراف. الوصول إلى موازنة درجة الحرارة وعادة ما يتطلب 30 دقيقة إلى 1 ساعة، اعتمادا على البيئة.
    1. إدراج "دمية" الطبق مع الماء في الآبار في غرفة بينما ارتفاع درجات الحرارة. طبق التصوير مليئة يقلد المياه العينة، مما يساعد على ضمان غرفة وتحسنت بما فيه الكفاية واستقرت. ملء الغرفة مع الماء المعقم قبل تحسنتيقلل من الوقت اللازم لاستقرار درجة الحرارة ويقلل من انخفاض درجات الحرارة على إضافة العينة التجريبية.

5. مجهر مجموعة المتابعة

  1. بدوره على المجهر، الكمبيوتر المرتبطة بها، وأية ملحقات المطلوبة.
    1. اعتمادا على مصدر الضوء، وانتظر لتشغيله لحين الحاجة إليها (على سبيل المثال، LED).
  2. مع برج موضوعي في وضع منخفض، وحدد الهدف NA 20X 0.7 لاستخدامها.
  3. ضع العينة على الهدف - وهذا سيجعل من الأسهل العثور على الخلايا عندما تكون العينة في الغرفة.
  4. تعريف المعلمات التصوير في هذا الوقت إذا كانت معروفة من التجارب السابقة.

6. نقل الخلايا إلى مجهر وفي الغرفة

  1. نقل الخلايا للتصوير من الحاضنة إلى غرفة البيئية. تأكد من أن يتم ذلك بسرعة للحد من آثار CO منخفضة نسبيا 2 الغلاف الجوي، وانخفضت درجة الحرارة على الخلايا. متابعة جميع المبادئ التوجيهية للسلامة الأحيائية المؤسسية لنقل العينات وتنظيف في حالة وجود تسرب.
    1. وضع الخلايا في وعاء الستايروفوم مختومة أو كيس معزول لتجنب التغيرات البيئية الكبيرة.
  2. إدراج الطبق التصوير العينة إلى الغرفة التالية توجيهات المصنع.
  3. بعد أن تم تأمين الخلايا داخل غرفة البيئية، وختم الغرفة للحفاظ على بيئة مستقرة وتتحول فورا على المصدر (ق) من الغاز في الغلاف الجوي.
    1. حيث أن بعض الدوائر البيئية لا تستخدم ضيق، غطاء مختومة، لتؤخر التبخر، طبقة العقيمة، الزيوت المعدنية على شهادة الجنين على أعلى متوسط ​​النمو. التفاف فيلم البارافين نفيذ الغاز حول محيط حواف الطبق عينة والحرص على عدم عرقلة منطقة التصوير الزجاج. ويمكن استخدام محلية، طرق الترطيب الثانوية. التكثيف على غطاء الطبق عينة يمكن أن تقلل ادائهامانس المجهر brightfield.
  4. من أجل تقليل آثار الانجراف الحراري في وقت مبكر خلال التجربة، وانتظر 30 دقيقة قبل البدء في الوقت الفاصل. الوقت المطلوب باختلاف حجم الطبق التصوير وعوامل أخرى. تحديد تجريبيا.

7. إعداد التصوير

  1. حدد شروط التصوير التي سوف تمثل أفضل البيانات. اتخاذ الاحتياطات اللازمة لتجنب الضيائية عن طريق الحد من التعرض مرات، وذلك باستخدام أقل شدة الضوء واختيار تحقيقات التي ولع الأطوال الموجية للضوء.
  2. تحديد X و Y و Z-الطائرة والمطلوب الطول الموجي (الصورة) لكل موقف للتصوير. هو قرار الوقت محدودة بسبب عدد من المواقف وموجات. على المدى الطويل الوقت الفاصل بين معظم العمليات الخلوية، والحصول على صورة واحدة كل 10-20 دقيقة. دقة أعلى الوقت (فترات قصيرة، على سبيل المثال، 1 دقيقة) توفر المزيد من نقاط البيانات وتتبع الخلية وبالتالي أكثر قوة، ولكن النتائج أيضا في أكثر اندماجاالتعرض للضوء ومجموعات البيانات الكبيرة.
    1. كما HT1080 FUCCI ديك البروتينات الفلورية الخضراء والحمراء الحيوية (انظر ممثل النتائج)، استخدم مرات التعرض التالية: FITC / GFP - 50 ميللي ثانية، تكساس الأحمر / TRITC - 40 ميللي ثانية، Brightfield - 20 ميللي ثانية. استخدام الحاوية 2 × 2.
  3. تمكين برنامج autofocusing التحكم باستخدام المعلمات الافتراضية ضمن إعدادات متقدمة. تحديد مجموعة وضبط تلقائي للصورة من 10 ميكرون مع حجم خطوة الموصى بها. تأكد من القيام بذلك قبل البدء في الوقت الفاصل. ضبط تلقائي للصورة مع الصور brightfield وأبدا مع مضان للحد من الضيائية وphotobleaching من.
    1. استخدام أنظمة autofocusing البرمجيات التي تسيطر على أي المجهر مع مرحلة الآلية، والتركيز مباشرة على العينة. ومع ذلك، فإنها يمكن أن تحد من سرعة اكتساب التجربة. الأجهزة أنظمة التحكم التركيز المستمر تعمل بشكل جيد للفحص المجهري مرور الزمن وتحسين سرعة، مما يسمح للمزيد من المناصب إلى أن تصوير أو ارتفاع معدل الاستحواذ. ومع ذلك، فإنهاالاعتماد على الكشف عن واجهة من الزجاج الهواء، وقد يفقد التركيز من العينة مع وجود اختلافات في سماكة الزجاج عبر البئر.
  4. استبدال نصف وسائل الإعلام مع وسائل الإعلام التي تحتوي على تركيز الدواء المطلوب الذي تم تحسنت إلى 37 درجة مئوية. استبدال وسائل الإعلام الجزئي يساعد على الحد من الانجراف الحراري. الظروف في هذه التجربة هي المركبات ([دمس])، 1 ميكرومتر selinexor و 10 ميكرومتر PD0332991.
    ملاحظة: يمكن أيضا أن يتم هذه الخطوة بعد بدء اكتساب التوقف وإعادة تشغيل التجربة. وهذا يسمح لتتبع الطولي للردود السابقة واللاحقة للأدوية الخلايا وحيدة. إذا ثباتية الدواء أو الأيض هو مصدر قلق، والتوقف واستبدال وسائل الإعلام يمكن أن يتم بنفس الطريقة. لاختبار تدهور المخدرات أو التمثيل الغذائي، وسائل الإعلام من الخلايا المعالجة ويمكن أيضا أن توضع على خلايا ساذجة لاختبار عمل الدواء.
  5. بدء مرور الزمن.
  6. كما يعمل على مرور الزمن، وضمان أن تظل الحقول تصوير في التركيز وchambeيحافظ ص ورطب 37 درجة مئوية.
    1. ضبط التركيز حسب الحاجة التوقف الاستحواذ خلال الفجوة الزمنية بين نقاط الوقت.
  7. إذا لزم الأمر، إضافة الماء إلى الغرفة خلال التجارب أطول. تجنب تبريد الغرفة بإضافة قبل تحسنت والماء المقطر المعقم في 37 درجة مئوية.

8. إنهاء الوقت الفاصل

  1. عند تشغيل التجربة على الانتهاء، والتوقف عن اكتساب إذا لم يتم تعيين لتتوقف تلقائيا.
  2. تأكد من أن الفاصل بين الوقت قد تم حفظها بشكل صحيح على القرص الصلب، وعلى الرغم من أن معظم حزم البرمجيات حفظ تلقائيا خلال اقتناء إذا لم تنته بشكل صحيح يمكن أن يتم فقدان البيانات.
  3. إزالة غرفة من المجهر والتخلص من الخلايا في النفايات biohazardous التالية إجراءات السلامة البيولوجية المؤسسية المعتمدة.

9. تتبع طولية وتحليل البيانات في الوقت الفاصل بين

  1. اختيار منهجية لتحليل ما هوالمناسبة للعمليات البيولوجية من الفائدة. وقد تم إنتاج العديد من الإضافات ليماغيج، البرامج باستخدام ماتلاب، ومنصات مخصصة لتطبيقات محددة. وتغطي المنهجية التالية تتبع نوى وتحليل تحقيقات الفلورسنت النووية كما هو موضح في الشكلين 4 و 5.
  2. فتح مداخن صورة. TIF عن القنوات المستخدمة في ImageJ. بدلا من ذلك، فتح الملفات الأصلية من برنامج شراء مباشرة في ImageJ باستخدام البرنامج المساعد Bioformats.
  3. رسم المنطقة ذات الاهتمام (ROI) داخل النواة من خلية واحدة باستخدام صورة brightfield أو قناة التسمية النووية (في حال استخدامها) وإضافته إلى مدير العائد على الاستثمار. ملاحظة: إذا كانت الخلايا المصورة لديها التسمية النووية (على سبيل المثال، هيستون H2B-EGFP.)، ثم يمكن الاستفادة تتبع الخلية التلقائي لخلق مناطق الفائدة (رويس) التي تمثل نواة الفردية عبر الزمن.
  4. انتقل إلى نقطة زمنية المقبلة ووضع العائد على الاستثمار داخل نفس nucleuالصورة. إضافة العائد على الاستثمار إلى مدير العائد على الاستثمار.
  5. مواصلة تتبع وجعل رويس للخلية فردية حتى يكون هناك حدث الخلوي (الانقسام، موت الخلايا المبرمج، الخ.) أو لم يعد من الممكن تعقب خلية (أي، يتحرك خارج الإطار أو التجربة ينتهي).
  6. عندما أنشئت رويس للخلايا من خلال ذلك الوقت هم في الميدان، ركب لهم على القنوات الفلورسنت من الفائدة. قياس كثافة يعني من مضان في كل قناة عن كل نقطة زمنية. حفظ قائمة العائد على الاستثمار لاستخدامها لاحقا.
    1. قياسات مختلفة يستطيع كنت جعلت ضمن العائد على الاستثمار لتقديم الطلبات في تجارب مختلفة. انقر فوق تحليل → مجموعة القياسات ... لإحضار قائمة لاختيار الطريقة التحليلية (على سبيل المثال، يعني كثافة في العائد على الاستثمار، وكثافة متكاملة، الخ.).
  7. ملاحظة مصير الخلية لخلايا فردية (على سبيل المثال، موت الخلايا المبرمج، وتقسيم، البقاء على قيد الحياة)، في حين تتبع. وهذا يسمح لإنشاء منحنيات البقاء على قيد الحياة وابعد من ذلكالتحليل السكاني ص.
  8. مع كثافة يعني لكلا قنوات، وخلق مؤامرة مبعثر لعرضه ديناميات دورة الخلية ردا على العلاجات (الشكل 5B، C).
    ملاحظة: يمكن إنشاء قطع اراضي للخلايا فردية مع مرور الوقت أو متوسط ​​على مجموعة من الخلايا تتبعها. التصوير الكمي يمكن أن تكون حاسمة لتحديد استجابات معقدة والعلاقات الخلايا في الاستجابة لعلاجات السرطان. على المدى الطويل الوقت الفاصل بين المجهري، وتتبع الطولي وتحليل البيانات هو عملية متعددة الخطوات، مع العديد من الخيارات لنوع من الفحص المجهري والتحليل والأدوات، ويتبع المخطط العام المنصوص عليه في الشكل 1.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

على المدى الطويل الوقت الفاصل بين المجهر وتتبع الطولي المباشر يسمح لدراسة العديد من الآثار المضادة للسرطان خلال الاستجابة للدواء. بعد المخطط العام في الشكل 1، وترد أمثلة متعددة من الخلايا معربا عن صحفيين الفلورسنت التحقق من صحة أن تعامل مع الأدوية المضادة للسرطان، تعقب، وتحليلها باستخدام أساليب مختلفة.

المرحلة المجهر النقيض من ذلك ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

مزايا المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية

المجهر هو أداة مثالية للدراسات طولية من الاستجابة للدواء كما أنه يسمح للمحققين لتعقب الخلايا الفردية ومصائرهم وكذلك السكان. التغير في الاستجابة للدواء ضمن مجموعة من الخلايا هي قضية رئيسية للتصميم العلاجية المضادة للسرطان. تتبع طولية من الخلايا واحد يسمح للمحققين لمراقبة هذا التغير والبدء في فهم الآليات والنتائج الأساسية لأنها تتعلق السكان الخلية. استخدام...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر جوشوا ماركوس على الدعم الفني وجوليان تايلر، دكتوراه، مدير مرفق ريتشارد جيه ماكنتوش للفحص المجهري الخفيف الأساسي، على المشورة الفنية. تم دعم هذا العمل بأموال من جامعة كولورادو بولدر وكلية الدراسات العليا بجامعة كولورادو بولدر إلى J.D.O. R.T.B. مدعوم جزئيا بمنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من المعاهد الوطنية للصحة (T32 GM008759). نشكر شركة Karyopharm Therapeutics، Inc. على selinexor و Merck Serono لمثبط Kinesin-5. بلازميدات FUCCI مأخوذة من أتسوشي مياواكي (RIKEN ، اليابان) عبر MTA. كان mCherry-BP1-2 من Addgene. HeLa التي تعبر عن H2b-mCherry و β-tubulin-EGFP مأخوذة من دانيال جيرليش (IMBA ، الأكاديمية النمساوية للعلوم ، النمسا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
Taxol (paclitaxel)SigmaT7191عقار تثبيت الأنابيب
الدقيقة EtoposideSelleckchemS1225مثبط توبويزوميراز II
SelinexorKaryopharm TherapeuticsومثبطXPO1 / CRM1 ،
مثبط Kinesin-5Merck Seronoوهدية ، متوفر أيضا من شركة الكيماويات الأمريكية المخصصة CAS 858668-07-2
خلية نمومتوسطة HyClone (فيشر) أو Mediatechالعديد من الشركات المتاحة
5٪ CO2 / توازن الهواء ، Airgasالمعتمد Z03NI7222004379
35 مم طبق ، 20 مم قاع زجاجيCellvisD35-20-1.5-Nالعديد من الشركات المتاحة
35 مم 4 بئر طبق ، 20 مم قاع زجاجيCellvisD35C4-20-1.5-Nالعديد من الشركات المتاحة
طبق 35 مم ، قاع زجاجيMatTekP35G-2-14-CGRDالعديد من الشركات المتاحة
متعدد الآبار ، قاع زجاجيCellvisP12-1.5H-Nالعديد من الشركات المتاحة
أوليمبوس IX81 مجهر epifluorse المقلوبأوليمبوس
أوليمبوس IX2-UCB وحدة تحكمأوليمبوس
بريور LumenPro200السابق العلميةLumen200PRO
PRIOR Proscan III المرحلة الآليةPrio ScientificH117
STEV chamberInVivo ScientificSTEV. وحده نقديه اوروبيه. HC5 STAGE TOP
وحدة التحكم البيئيInVivo ScientificSTEV. وحده نقديه اوروبيه. HC5 STAGE TOP
Hamamatsu ORCA R2 CCD مع وحدة تحكمHamamatsuC10600
Nikon Eclipse TiNikon
نيكون بالليزر
خفيفLUMENCOR
iXon Ultra 897 EM-CCDANDOR 
TOKAI HIT غرفة الإكلافTOKAI HITTIZSH
شبكي إطلاق نيكون محرك

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
  2. Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Observations on the social behaviour of cells in tissue culture. I. Speed of movement of chick heart fibroblasts in relation to their mutual contacts. Exp Cell Res. 5, 111-131 (1953).
  3. Landecker, H. Seeing things: from microcinematography to live cell imaging. Nat Methods. 6, 707-709 (2009).
  4. The Chase - Panoramic QuickTime Movie of Classic Rogers Neutrophil Chasing S aureus Bacteria. Bepress. , Available from: http://works.bepress.com/gmcnamara (2012).
  5. van Roosmalen, W., Le Devedec, S. E., Zovko, S., de Bont, H., Bvan de Water, Functional screening with a live cell imaging-based random cell migration assay. Methods Mol Biol. 769, 435-448 (2011).
  6. Krueger, E. W., Orth, J. D., Cao, H., McNiven, M. A. A dynamin-cortactin-Arp2/3 complex mediates actin reorganization in growth factor-stimulated cells. Mol Biol Cell. 14, 1085-1096 (2003).
  7. Cluet, D., Stebe, P. N., Riche, S., Spichty, M., Delattre, M. Automated high-throughput quantification of mitotic spindle positioning from DIC movies of Caenorhabditis embryos. PLoS One. 9 (e93718), (2014).
  8. Held, M., et al. Cell Cognition: time-resolved phenotype annotation in high-throughput live cell imaging. Nat Methods. 7, 747-754 (2010).
  9. Orth, J. D., Krueger, E. W., Weller, S. G., McNiven, M. A. A novel endocytic mechanism of epidermal growth factor receptor sequestration and internalization. Cancer Res. 66, 3603-3610 (2006).
  10. Rowland, A. A., Chitwood, P. J., Phillips, M. J., Voeltz, G. K. ER contact sites define the position and timing of endosome fission. Cell. 159, 1027-1041 (2014).
  11. Merrifield, C. J., Feldman, M. E., Wan, L., Almers, W. Imaging actin and dynamin recruitment during invagination of single clathrin-coated pits. Nat Cell Biol. 4, 691-698 (2002).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase contrast and differential interference contrast (DIC) microscopy. J Vis Exp. , (2008).
  13. Drummen, G. P. Fluorescent probes and fluorescence (microscopy) techniques--illuminating biological and biomedical research. Molecules. 17, 14067-14090 (2012).
  14. Guan, Y., et al. Live-cell multiphoton fluorescence correlation spectroscopy with an improved large Stokes shift fluorescent protein. Mol Biol Cell. 26, 2054-2066 (2015).
  15. Snapp, E. L. Fluorescent proteins: a cell biologist's user guide. Trends Cell Biol. 19, 649-655 (2009).
  16. Orth, J. D., et al. Analysis of mitosis and antimitotic drug responses in tumors by in vivo microscopy and single-cell pharmacodynamics. Cancer Res. 71, 4608-4616 (2011).
  17. Brown, E., Munn, L. L., Fukumura, D., Jain, R. K. In vivo imaging of tumors. Cold Spring Harb Protoc. (5452), (2010).
  18. Chittajallu, D. R., et al. In vivo cell-cycle profiling in xenograft tumors by quantitative intravital microscopy. Nat Methods. 12, 577-585 (2015).
  19. Nakasone, E. S., Askautrud, H. A., Egeblad, M. Live imaging of drug responses in the tumor microenvironment in mouse models of breast cancer. J Vis Exp. (50088), (2013).
  20. Orth, J. D., et al. Quantitative live imaging of cancer and normal cells treated with Kinesin-5 inhibitors indicates significant differences in phenotypic responses and cell fate. Mol Cancer Ther. 7, 3480-3489 (2008).
  21. Gascoigne, K. E., Taylor, S. S. Cancer cells display profound intra- and interline variation following prolonged exposure to antimitotic drugs. Cancer Cell. 14, 111-122 (2008).
  22. Yang, R., Niepel, M., Mitchison, T. K., Sorger, P. K. Dissecting variability in responses to cancer chemotherapy through systems pharmacology. Clin Pharmacol Ther. 88, 34-38 (2010).
  23. Orth, J. D., McNiven, M. A. Get off my back! Rapid receptor internalization through circular dorsal ruffles. Cancer Res. 66, 11094-11096 (2006).
  24. Li, J., et al. Co-inhibition of polo-like kinase 1 and Aurora kinases promotes mitotic catastrophe. Oncotarget. 6, 9327-9340 (2015).
  25. Orth, J. D., Loewer, A., Lahav, G., Mitchison, T. J. Prolonged mitotic arrest triggers partial activation of apoptosis, resulting in DNA damage and p53 induction. Mol Biol Cell. 23, 567-576 (2012).
  26. Batchelor, E., Loewer, A., Mock, C., Lahav, G. Stimulus-dependent dynamics of p53 in single cells. Mol Syst Biol. 7 (488), (2011).
  27. Purvis, J. E., et al. p53 dynamics control cell fate. Science. 336, 1440-1444 (2012).
  28. Zhang, C. Z., Leibowitz, M. L., Pellman, D. Chromothripsis and beyond: rapid genome evolution from complex chromosomal rearrangements. Genes Dev. 27, 2513-2530 (2013).
  29. Zhang, C. Z., et al. Chromothripsis from DNA damage in micronuclei. Nature. 522, 179-184 (2015).
  30. Sakaue-Sawano, A., et al. Visualizing spatiotemporal dynamics of multicellular cell-cycle progression. Cell. 132, 487-498 (2008).
  31. Neggers, J. E., et al. Identifying drug-target selectivity of small-molecule CRM1/XPO1 inhibitors by CRISPR/Cas9 genome editing. Chem Biol. 22, 107-116 (2015).
  32. Gravina, G. L., et al. XPO1/CRM1-Selective Inhibitors of Nuclear Export (SINE) reduce tumor spreading and improve overall survival in preclinical models of prostate cancer (PCa). Journal of hematology and oncology. 7 (46), (2014).
  33. Mendonca, J., et al. Selective inhibitors of nuclear export (SINE) as novel therapeutics for prostate cancer. Oncotarget. 5, 6102-6112 (2014).
  34. Marcus, J. M., Burke, R. T., DeSisto, J. A., Landesman, Y., Orth, J. D. Longitudinal tracking of single live cancer cells to understand cell cycle effects of the nuclear export inhibitor, selinexor. Scientific reports. 5, 14391(2015).
  35. Senapedis, W. T., Baloglu, E., Landesman, Y. Clinical translation of nuclear export inhibitors in cancer. Semin Cancer Biol. 27, 74-86 (2014).
  36. Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. 53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility. Nature. 456, 524-528 (2008).
  37. D'Arpa, P., Beardmore, C., Liu, L. F. Involvement of nucleic acid synthesis in cell killing mechanisms of topoisomerase poisons. Cancer Res. 50, 6919-6924 (1990).
  38. Palmitelli, M., de Campos-Nebel, M., Gonzalez-Cid, M. Progression of chromosomal damage induced by etoposide in G2 phase in a DNA-PKcs-deficient context. Chromosome research : an international journal on the molecular, supramolecular and evolutionary aspects of chromosome biology. , (2015).
  39. Albeck, J. G., Burke, J. M., Spencer, S. L., Lauffenburger, D. A., Sorger, P. K. Modeling a snap-action, variable-delay switch controlling extrinsic cell death. PLoS biology. 6, 2831-2852 (2008).
  40. N'Diaye, E. N., et al. PLIC proteins or ubiquilins regulate autophagy-dependent cell survival during nutrient starvation. EMBO reports. 10, 173-179 (2009).
  41. Xu, J., Liu, Z. F., Wang, J., Deng, P., Jiang, Y. Study of localization and translocation of human high mobility group protein B1 in eukaryotic cells. Zhongguo wei zhong bing ji jiu yi xue = Chinese critical care medicine = Zhongguo weizhongbing jijiuyixue. 18, 338-341 (2006).
  42. Hoppe, G., Talcott, K. E., Bhattacharya, S. K., Crabb, J. W., Sears, J. E. Molecular basis for the redox control of nuclear transport of the structural chromatin protein Hmgb1. Exp Cell Res. 312, 3526-3538 (2006).
  43. Moshfegh, Y., Bravo-Cordero, J. J., Miskolci, V., Condeelis, J., Hodgson, L. A Trio-Rac1-Pak1 signalling axis drives invadopodia disassembly. Nat Cell Biol. 16, 574-586 (2014).
  44. Yu, X., Machesky, L. M. Cells assemble invadopodia-like structures and invade into matrigel in a matrix metalloprotease dependent manner in the circular invasion assay. PLoS One. 7 (e30605), (2012).
  45. Neumann, B., et al. Phenotypic profiling of the human genome by time-lapse microscopy reveals cell division genes. Nature. 464, 721-727 (2010).
  46. Burnette, D. T., et al. A role for actin arcs in the leading-edge advance of migrating cells. Nat Cell Biol. 13, 371-381 (2011).
  47. Matov, A., et al. Analysis of microtubule dynamic instability using a plus-end growth marker. Nat Methods. 7, 761-768 (2010).
  48. Wollman, R., Meyer, T. Coordinated oscillations in cortical actin and Ca2+ correlate with cycles of vesicle secretion. Nat Cell Biol. 14, 1261-1269 (2012).
  49. Day, R. N., Davidson, M. W. The fluorescent protein palette: tools for cellular imaging. Chemical Society reviews. 38, 2887-2921 (2009).
  50. Kilgore, J. A., Dolman, N. J., Davidson, M. W., et al. A review of reagents for fluorescence microscopy of cellular compartments and structures, Part II: reagents for non-vesicular organelles. Current protocols in cytometry. Robinson, J. . P. aul 66, (2013).
  51. Pittet, M. J., Weissleder, R. Intravital imaging. Cell. 147, 983-991 (2011).
  52. Shi, J., Zhou, Y., Huang, H. C., Mitchison, T. J. Navitoclax (ABT-263) accelerates apoptosis during drug-induced mitotic arrest by antagonizing Bcl-xL. Cancer Res. 71, 4518-4526 (2011).
  53. Tan, N., et al. Navitoclax enhances the efficacy of taxanes in non-small cell lung cancer models. Clin Cancer Res. 17, 1394-1404 (2011).
  54. Ramapathiran, L., et al. Single-cell imaging of the heat-shock response in colon cancer cells suggests that magnitude and length rather than time of onset determines resistance to apoptosis. J Cell Sci. 127, 609-619 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Single Cell TrackingHT1080 CellsEnvironmental ChamberFluorescent BiosensorsCell Growth AnalysisChromosome DynamicsDNA DamageCell Death

مقالات ذات صلة