هنا ، نصف طريقة للفحص المجهري طويل المدى لتتبع الخلايا المفردة طوليا استجابة للعلاجات المضادة للسرطان.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
من خلال المرآة: المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية من الخلايا واحدة لدراسة العلاج المضادة للسرطان
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
استجابة الخلايا وحيدة إلى الأدوية المضادة للسرطان تساهم بشكل كبير في تحديد استجابة السكان، وبالتالي تعتبر عاملا رئيسيا يسهم في النتيجة الإجمالية. Immunoblotting، التدفق الخلوي والتجارب خلية ثابتة وغالبا ما تستخدم لدراسة كيفية استجابة الخلايا للأدوية المضادة للسرطان. وهذه الأساليب هي مهمة، ولكن لديهم العديد من أوجه القصور. التباين في ردود المخدرات بين السرطان والخلايا الطبيعية، وبين خلايا المنشأ السرطانية المختلفة، وعابرة وردود نادرة من الصعب أن نفهم باستخدام فحوصات المتوسط السكان ودون أن تكون قادرة على تتبع مباشرة وتحليلها بشكل طولي. المجهر بشكل خاص مناسبة تماما لصورة الخلايا الحية. التطورات في مجال التكنولوجيا تمكننا من روتيني خلايا الصورة في القرار الذي تمكن ليس فقط تتبع الخلية، ولكن أيضا مراقبة مجموعة متنوعة من الاستجابات الخلوية. وصفنا هذا النهج في التفاصيل التي تسمح للتصوير المستمر الوقت الفاصل بينالخلايا خلال الاستجابة للدواء لفي الأساس طالما رغبت في ذلك، عادة ما يصل إلى 96 ساعة. استخدام الاختلافات في النهج، وخلايا يمكن رصدها لأسابيع. مع توظيف المشفرة وراثيا أجهزة الاستشعار الفلورسنت العديد من العمليات، ومسارات والاستجابات يمكن اتباعها. وتبين لنا الأمثلة التي تشمل تتبع النوعي والكمي لنمو الخلايا وتقدم دورة الخلية، وديناميات كروموسوم، الحمض النووي من التلف، وموت الخلايا. نحن أيضا مناقشة الاختلافات في الأسلوب ومرونته، وتسليط الضوء على بعض المخاطر المشتركة.
المقدمة
المجهر الخلية الحية وتتبع طولية من الخلايا واحدة ليست تقنية جديدة. من أقرب المجاهر، وقد لاحظ المتحمسين والعلماء ودرس الخلايا وحيدة والكائنات، تصرفاتهم، والتنمية 1-3. ومن الأمثلة الشهيرة من أواخر ديفيد روجرز في جامعة فاندربيلت في 1950s يظهر العدلات الإنسان في بقعة من الدم مطاردة بكتيريا المكورات العنقودية الذهبية، وفي نهاية المطاف عملية البلعمة (4). هذا الفيلم الخلية الحية هو مثال ممتاز لكيفية عمليات متعددة يمكن ملاحظتها والمترابطة في تجربة واحدة: الاستشعار من التدرج الكيميائية، والميكانيكا وسرعة الحركة خلية، خلية الأشكال ديناميكية، التصاق، والبلعمة من العوامل المسببة للأمراض.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
يستخدم بروتوكول التالية المعلمات التي تحددها التجارب في أرقام 4 و 6 بشأن إعدادات اقتناء والظروف التجريبية. العديد من هذه المعايير يمكن تعديلها لتناسب تجارب أخرى (أي التعرض مرات، binning، قنوات الفلورسنت، الخ.). ويجب على جميع إجراءات الانضمام إلى المبادئ التوجيهية واللوائح المؤسسية وأن تتم الموافقة عليها من قبل لجنة السلامة الأحيائية المؤسسية. تحتوي مواقع تصنيع المجهر معلومات ممتازة لتصوير الخلايا الحية.
1. المجاهر والتصوير البرمجيات
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
على المدى الطويل الوقت الفاصل بين المجهر وتتبع الطولي المباشر يسمح لدراسة العديد من الآثار المضادة للسرطان خلال الاستجابة للدواء. بعد المخطط العام في الشكل 1، وترد أمثلة متعددة من الخلايا معربا عن صحفيين الفلورسنت التحقق من صحة أن تعامل مع الأدوية المضادة للسرطان، تعقب، وتحليلها باستخدام أساليب مختلفة.
المرحلة المجهر النقيض من ذلك .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
مزايا المجهري الوقت الفاصل بين وتتبع طولية
المجهر هو أداة مثالية للدراسات طولية من الاستجابة للدواء كما أنه يسمح للمحققين لتعقب الخلايا الفردية ومصائرهم وكذلك السكان. التغير في الاستجابة للدواء ضمن مجموعة من الخلايا هي قضية رئيسية للتصميم العلاجية المضادة للسرطان. تتبع طولية من الخلايا واحد يسمح للمحققين لمراقبة هذا التغير والبدء في فهم الآليات والنتائج الأساسية لأنها تتعلق السكان الخلية. استخدام.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
ليس لدى المؤلفين تضارب في المصالح للإفصاح عنها.
شكر وتقدير
نشكر جوشوا ماركوس على الدعم الفني وجوليان تايلر، دكتوراه، مدير مرفق ريتشارد جيه ماكنتوش للفحص المجهري الخفيف الأساسي، على المشورة الفنية. تم دعم هذا العمل بأموال من جامعة كولورادو بولدر وكلية الدراسات العليا بجامعة كولورادو بولدر إلى J.D.O. R.T.B. مدعوم جزئيا بمنحة تدريب ما قبل الدكتوراه من المعاهد الوطنية للصحة (T32 GM008759). نشكر شركة Karyopharm Therapeutics، Inc. على selinexor و Merck Serono لمثبط Kinesin-5. بلازميدات FUCCI مأخوذة من أتسوشي مياواكي (RIKEN ، اليابان) عبر MTA. كان mCherry-BP1-2 من Addgene. HeLa التي تعبر عن H2b-mCherry و β-tubulin-EGFP مأخوذة من دانيال جيرليش (IMBA ، الأكاديمية النمساوية للعلوم ، النمسا).
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| Taxol (paclitaxel) | Sigma | T7191 | عقار تثبيت الأنابيب |
| الدقيقة Etoposide | Selleckchem | S1225 | مثبط توبويزوميراز II |
| Selinexor | Karyopharm Therapeutics | ومثبط | XPO1 / CRM1 ، |
| مثبط Kinesin-5 | Merck Serono | و | هدية ، متوفر أيضا من شركة الكيماويات الأمريكية المخصصة CAS 858668-07-2 |
| خلية نمو | متوسطة HyClone (فيشر) أو Mediatech | العديد من الشركات المتاحة | |
| 5٪ CO2 / توازن الهواء ، Airgas | المعتمد Z03NI7222004379 | ||
| 35 مم طبق ، 20 مم قاع زجاجي | Cellvis | D35-20-1.5-N | العديد من الشركات المتاحة |
| 35 مم 4 بئر طبق ، 20 مم قاع زجاجي | Cellvis | D35C4-20-1.5-N | العديد من الشركات المتاحة |
| طبق 35 مم ، قاع زجاجي | MatTek | P35G-2-14-CGRD | العديد من الشركات المتاحة |
| متعدد الآبار ، قاع زجاجي | Cellvis | P12-1.5H-N | العديد من الشركات المتاحة |
| أوليمبوس IX81 مجهر epifluorse المقلوب | أوليمبوس | ||
| أوليمبوس IX2-UCB وحدة تحكم | أوليمبوس | ||
| بريور LumenPro200 | السابق العلمية | Lumen200PRO | |
| PRIOR Proscan III المرحلة الآلية | Prio Scientific | H117 | |
| STEV chamber | InVivo Scientific | STEV. وحده نقديه اوروبيه. HC5 STAGE TOP | |
| وحدة التحكم البيئي | InVivo Scientific | STEV. وحده نقديه اوروبيه. HC5 STAGE TOP | |
| Hamamatsu ORCA R2 CCD مع وحدة تحكم | Hamamatsu | C10600 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | ||
| نيكون بالليزر | |||
| خفيف | LUMENCOR | ||
| iXon Ultra 897 EM-CCD | ANDOR | ||
| TOKAI HIT غرفة الإكلاف | TOKAI HIT | TIZSH |
المراجع
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E., Pegrum, S. M. The locomotion of fibroblasts in culture I. Movements of the leading edge. Exp Cell Res. 59, 393-398 (1970).
- Abercrombie, M., Heaysman, J. E. Obser....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
