يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان

10.2K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/53995

⸱

سبتمبر 20, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

في هذه المقالة

ملخص

يصف هذا البروتوكول وسيلة لtransfecting بكفاءة سيرنا في أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان المعزولة حديثا باستخدام microporation وتحديد المجمعات الحمض النووي والبروتينات في هذه الخلايا. يمكن رصد الخلايا Transfected لطخة الغربية وEMSA يحلل خلال الوقت ثقافة لمدة 4 أيام.

الملخص

تعتبر الخلايا الغاذية الخلوية الأولية البشرية مصدرا مفيدا جدا للخلايا الأولية لدراسة وظائف المشيمة والآليات التنظيمية ، ولفهم الأمراض المتعلقة بالحمل. في هذا البروتوكول ، يتم تقطيع الأرومات الغاذية الخلوية الزغابية الأولية البشرية المعزولة حديثا من المشيمة من خلال بروتوكول DNase / trypsin القياسي باستخدام الحمض النووي الريبي المتداخل الصغير (siRNA). قدم هذا النهج كفاءة أكبر لتعداء الحمض النووي الريبي عند مقارنته بالطريقة القائمة على شفت الدهون. يمكن لاحقا تحليل الخلايا المنقولة بواسطة اللطخة الغربية القياسية في غضون إطار زمني من 3-4 أيام بعد التعداد. بالإضافة إلى ذلك ، باستخدام الخلايا الغاذية الخلوية الزغابية الأولية المستنبتة ، تم تحسين تحليل مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) وإجراؤه على المستخلصات من الأيام 1 إلى 4. يسمح استخدام هذه الخلايا الأولية المستزرعة والبروتوكول الموصوف بتقييم الآثار المترتبة على جينات معينة وعوامل النسخ في عملية تمايز الأرومة الغاذية الخلوية الزغبية إلى طبقة خلوية تشبه الأرومة الغاذية المخلوية. ومع ذلك ، فإن الفترة الزمنية المحدودة المسموح بها في الثقافة تمنع استخدام الأساليب التي تتطلب مزيدا من الوقت ، مثل توليد مجموعة خلايا مستقرة. لذلك يتطلب اختبار هذه الخلايا بروتوكولات نقل الجينات المحسنة للغاية.

المقدمة

يرتبط ضعف المشيمة البشرية بتطور العديد من الأمراض المرتبطة بالحمل مثل تسمم الحمل وتقييد النمو داخل الرحم 1. من المكونات الخلوية المهمة للمشيمة الأرومات الغاذية ، والتي يمكن تصنيفها على أنها إما أورومات غخامية خلوية خارج الزغابات أو زغبية. عند الاندماج ، تتمايز الخلايا الغاذية الخلوية الزغابية إلى طبقة الأرومة الغاذية المخلوية ، وهي بنية خلية متعددة النوى لها دور مهم في التبادل بين الأمهات الجنينية وإنتاج الهرمونات 2. تمثل الأرومات الغاذية الخلوية الزغابية الأولية البشرية ونظيراتها المتمايزة عينات بيولوجية مهمة وتسمح للباحثين بدراسة عدد من العمليات المتعلقة بالمشيمة ، مثل اندماج الخلايا ، في الثقافة. وعلاوة على ذلك، تبذل جهود كبيرة لتحديد العلامات التي من شأنها أن تيسر التدبير العلاجي المناسب وتحسين العلاجات الوقائية الخاصة بالأمراض المرتبطة بالحمل. تقوم المختبرات بشكل روتيني بعزل الخلايا الغاذية الخلوية البشرية الأولية من المشيمة الطازجة ، باستخدام إجراء عزل قياسي يعتمد على هضم التربسين لزغابات المشيمة 3. نظرا لأن الخلايا الغاذية الخلوية المزروعة تفقد قدرتها على التكاثر والتمايز بسرعة في طبقة تشبه الأرومة الغاذية المخلوية عند الثقافة 4 ، هناك حاجة إلى طرق تعداء فعالة للغاية وأساليب تحليل محسنة. حددت الدراسات السابقة الظروف المثلى لتعداء هذه الخلايا الغاذية الخلوية الأولية 5. هنا ، يتم تقديم طريقة مختلفة لتعداء siRNA ، والتي تم اختبارها سابقا في هذا النوع من الخلايا 6. بالمقارنة مع النهج القائم على فتيل الدهون ، تعمل طريقة التثقيب الدقيق هذه على تحسين التعدي ، كما تم تقييمه من خلال مدى إسكات جينات معينة.

توفر دراسات المروج والتعبير الجيني < p class = 'jove_content'> فهما أفضل لوظيفة المشيمة. على الرغم من صعوبة الاستخدام بسبب الإطار الزمني القصير الذي يمكن من خلاله زراعة الخلايا الغاذية الخلوية الزغبية الأولية ، إلا أنه يمكن مع ذلك معالجة تحليلات المروج باستخدام البروتوكولات القياسية ، كما تم نشرها سابقا 7. يعد مقايسة تحول الحركة الكهربية (EMSA) أحد هذه الطرق الشائعة الاستخدام في المختبر ، مما يسمح بمراقبة سريعة وسهلة لتفاعلات الحمض النووي والبروتين. تم استخدام المستخلصات النووية من هذه الأرومات الغاذية الأولية لاختبار منطقة من محفز Syncytin-2 لتفاعلات محددة. كشفت النتائج أنه يمكن اكتشاف العوامل المقيدة في نقاط زمنية مختلفة من الثقافة وبطريقة محددة وقابلة للتكرار.

تؤكد

البيانات المقدمة في هذا البروتوكول أنه يمكن استخدام نهج التعدي الخاص بنا وبروتوكول EMSA للأرومات الغاذية الخلوية الزغابية الأولية المعزولة وستكون ذات فائدة كبيرة لدراسة الوظائف المتنوعة للأرومات الغاذية الخلوية الزغابية في الظروف العادية أو المرضية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وافقت لجنة الاخلاق UQAM هذه البروتوكولات، التي هي وفقا للمبادئ التوجيهية للجنة الأخلاقيات من سانت لوك مستشفى مركز HOSPITALIER الجامعي مونتريال (مونتريال، كندا). وقع المشاركون على استمارة الموافقة المسبقة.

1. إعداد المتوسطة وعزل زغبي أرومة غاذية خلوية الابتدائية

  1. إعداد مستنبت لأرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان الأساسية من خلال استكمال Dulbecco لتعديل المتوسطة النسر (DMEM) مع 25 ملي HEPES، و 10٪ مصل بقري جنيني (FBS) و 1٪ البنسلين / الستربتومايسين. تصفية المتوسطة استعداد من خلال معقم مرشح 0.22 ميكرون وتخزينها في الثلاجة -20 درجة مئوية في aliquots من 50 مل.
  2. عزل أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية من مشيمة جديدة بعد البروتوكولات القياسية 3.
    1. باستخدام كماشة، وإزالة غشاء الجنين من الأنسجة عن طريق خدش عليه بلطف، مع الحرص على عدم إزالة الأنسجة زغبي. اقطع التبقى الزغابات المشيمية في مكعبات من حوالي 3 × 3 سم باستخدام مشرط ومقص. يغسل جيدا بالماء تحتوي على 0.9٪ كلوريد الصوديوم لإزالة دم الأم.
      1. عقد كل مكعب مع كماشة، وإزالة بعناية الأنسجة زغبي من السفن المتبقية ومقص النسيج باستخدام الليفية.
      2. لمدة 15 إلى 30 ملغ من الأنسجة زغبي، يهضم أربع مرات في محلول ملحي متوازن هانك (HBSS) التي تحتوي على التربسين (من 9.6 × 10 5-1،8 × 10 6 U، التركيز النهائي 1.2 ملغ / مل)، وديوكسي ريبونيوكلياز الأول (الدناز I) ( التركيز النهائي من 200 ميكروغرام / مل) لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية في حمام مائي مع الهز المستمر.
        ملاحظة: استخدم 150 مل الحجم الكلي لهضم الأول، و 100 مل لهضم الثاني و 75 مل لمدة المتبقية الهضم.
    2. جمع طاف تحتوي على خلايا متفرقة وأجهزة الطرد المركزي في 1250 x ج لمدة 15 دقيقة دون فرامل. إزالة طاف والخلايا resuspend في 1 مل من prewarmed DMEM تحتوي على1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
    3. طبقة الخلايا المتفرقة على رأس متقطع 5٪ - 70٪ التدرج المغلفة بوفيدون السيليكا (انظر الجدول رقم 1 لإعداد التدرج) وأجهزة الطرد المركزي لمدة 23 دقيقة في 507 x ج من دون فرامل. إزالة طبقة كثافة بين 1،017-1،033 بواسطة الطموح وجمع طبقات تتراوح بين 40٪ و 50٪ في الانحدار مع ماصة جديدة. غسل الخلايا على نطاق واسع مع 10 مل من DMEM prewarmed تحتوي على 1٪ البنسلين / الستربتومايسين.
      ملاحظة: الأجزاء المتجمعة يتوافق مع الكثافة بين 1.048 و 1.062، التي تؤوي أرومة مغذية.
    4. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. لفترة وجيزة، ومزيج الخلايا وإضافة 10 ميكرولتر في أنبوب microcentrifuge جديد. إضافة 10 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان وتخلط بلطف مرة أخرى. وضع تعليق خلية وملء غرف عدادة الكريات. عد الخلايا تحت الهدف 10X.
    5. ضع 1 × 10 6 و 4.5 × 10 6 الخلايا في أنابيب منفصلة للاستخدام في أقسام 1.3 و 2، خاص بهلاي. البذور الخلايا المتبقية في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 6 خلايا / جيد في استكمال DMEM المتوسطة والثقافة في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 لمدة أقصاها 4 أيام لتجارب أخرى.
  3. تقييم نقاء أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية معزولة
    1. تدور 1 × 10 6 من أرومة غاذية خلوية المعزولة حديثا في أنابيب microcentrifuge في 300 × ز. تجاهل طاف وإضافة 1 مل من prewarmed الفوسفات مخزنة المالحة (PBS). خلايا الطرد المركزي في 300 x ج وإزالة PBS بواسطة الطموح.
    2. إضافة 1 مل من الميثانول الباردة إلى الخلايا واحتضان عند -20 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. خلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة الميثانول بواسطة الطموح.
      تحذير: استخدام قناع اسطوانة، نظارات السلامة والقفازات المطاطية أثناء التعامل مع الميثانول.
    3. إضافة 1 مل من برنامج تلفزيوني في درجة حرارة الغرفة لترطيب الخلايا، الطرد المركزي في 300 x ج وإزالة PBS بواسطة الطموح.
    4. احتضان الخلايا في برنامج تلفزيوني تحتوي على FBS (01:50 [ت / ت] تمييع) وFCRحجب كاشف (01:10) لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لقضاء ملزم انوعي.
    5. يغسل مرتين مع 500 ميكرولتر من درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني، وخلايا الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق وإزالة PBS بواسطة الطموح. Resuspend الخلايا في 100 ميكرولتر درجة حرارة الغرفة في برنامج تلفزيوني.
    6. احتضان الخلايا مع ثيوسيانات الماوس وحيدة النسيلة فلوريسئين (FITC) -conjugated مكافحة البشرية LP5K cytokeratin-7 الأجسام المضادة استنساخ (1: 200) أو isotype السيطرة المطابقة الأجسام المضادة غير محددة في برنامج تلفزيوني يحتوي على 0.2٪ BSA لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. غسل الخلايا في برنامج تلفزيوني.
    7. تحليل الخلايا عن طريق التدفق الخلوي 3. استخدام الاستعدادات الخلية، والتي تبرهن على الحد الأدنى من 96٪ خلايا إيجابية CK-7 التدفق الخلوي لمزيد من التجارب.

2. سيرنا ترنسفكأيشن الابتدائية زغبي أرومة غاذية خلوية الإنسان

  1. ترنسفكأيشن من أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان الأساسية باستخدام جهاز microporation
    1. إعداد 6 لوحات جيدة تحتوي على2 مل من المتوسط ​​DMEM تستكمل لاحتضان خلايا microporated.
    2. بعد عزل أرومة غاذية خلوية الأولية (انظر القسم 1.2)، واتخاذ قسامة من الخلايا في تعليق وتحديد عدد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
    3. نقل 1.5 × 10 6 خلايا لأنبوب microcentrifuge وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع 1 مل Dulbecco لبرنامج تلفزيوني (DPBS) (المغنيسيوم 2+، كا 2+ خالية) وبيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    4. إزالة طاف و resuspend الخلايا برفق في 100 ميكرولتر من العازلة إعادة تعليق.
      ملاحظة: تجنب الاحتفاظ تعليق خلية لمدة أطول من 15-30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وبقاء الخلية والكفاءة ترنسفكأيشن لتعظيم.
    5. إضافة 300 نانوغرام من Syncytin-2 سيرنا (أو مشوشة تحكم سيرنا) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، ونضح الخليط خلايا سيرنا باستخدام 100 ميكرولتر ترنسفكأيشن ماصة. إدراجماصة في محطة (انظر قائمة من المواد) وإخضاع الخلايا إلى نبض واحد من 30 ميللي ثانية 1300 V.
    6. على الفور نقل الخلايا إلى 6 لوحات جيدا (المعد في الخطوة 2.1.1) التي تحتوي على درجة حرارة ما قبل 37 ° C المتوسطة تستكمل لتجنب تلف الخلايا.
    7. كرر الخطوات من 2.1.5 و 2.1.6 لعينات المتبقية.
    8. صخرة بلطف لوحة لمدة 30 ثانية لضمان التوزيع العادل للخلايا. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية في ترطيب CO 2 حاضنة لل24-48 ساعة. تحديث مستنبت 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
    9. تقييم كفاءة ترنسفكأيشن عن طريق تحليل لطخة غربية (انظر الخطوات 3-6).
  2. Lipofection من سيرنا في أرومة غاذية خلوية الإنسان الأساسية
    1. بعد عزل أرومة غاذية خلوية زغبي، البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من 1.5 × 10 6 خلايا لكل بئر في 6 لوحات جيدة في 2 مل من مستنبت واحتضان لمدة 18 ساعة.
    2. تمييع 300 نانوغرام من Syncytin-2-محددة سيرنا (أو سارعت ضبطسيرنا) و 5 ميكرولتر من الدهون على أساس ترنسفكأيشن الكاشف في منفصلة 1.5 مل الأنابيب في حجم ما مجموعه 10 ميكرولتر من المتوسطة antibiotic- وخالية من المصل. احتضان لمدة 5 دقائق.
    3. مزيج من الكواشف المخفف واحتضان لمدة 20 دقيقة إضافية في درجة حرارة الغرفة لتشكيل مجمع ترنسفكأيشن. إضافة 90 ميكرولتر من المتوسطة antibiotic- وخالية من المصل إلى المزيج إلى الحجم النهائي من 100 ميكرولتر.
    4. إزالة مستنبت من 6 لوحات جيدا (الخطوة 2.2.1). إضافة 2 مل من المتوسط ​​الطازجة ومزيج ترنسفكأيشن 100 ميكرولتر إلى كل بئر. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 ل24 إلى 48 ساعة. تحديث مستنبت 24 ساعة بعد ترنسفكأيشن.
    5. تقييم كفاءة ترنسفكأيشن عن طريق تحليل لطخة غربية (انظر الخطوات 3-6).

3. إعداد لست] من ثقافة كله خلية

  1. إزالة وسائل الإعلام وشطف كل بئر (من خطوات 2.1.8 و 2.2.4) باستخدام DPBS استعد مسبقا (المغنيسيوم 2+، كا 2+ مجانا). نضح DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل / (EDTA). احتضان لمدة 1-3 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2. إيقاف العلاج التربسين وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من مصل يحتوي على وسائط النمو.
    ملاحظة: استخدام حجم وسائل الإعلام المناسبة وفقا لنوع من قارورة / طبق: 1 مل لكل 10 7 خلية / 100 طبق ملم / 150 سم 2 قارورة. 0.5 مل لكل 5 × 10 6 خلايا / 60 طبق مم / 75 سم 2 قارورة.
  2. نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع DPBS (المغنيسيوم 2+، كا 2+ خالية) وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إزالة بعناية طاف دون الإخلال بيليه. وضع أنبوب على الجليد. Resuspend وبيليه في 50-200 راديو مناعي الفحص (المعهد الملكي) العازلة الجليد الباردة ميكرولتر (انظر الجدول رقم 2 لتكوين عازلة) التي تحتوي على إضافة حديثاإد البروتيني ومثبطات إنزيم الفوسفاتيز بتركيز نهائي 1X. لفترة وجيزة، دوامة أنبوب وترك على الجليد لمدة 30 دقيقة.
  4. تدور في 16000 x ج لمدة 20 دقيقة على 4 درجات مئوية. وضع بعناية أنبوب على الجليد. باستخدام ماصة، طاف لنقل أنبوب microcentrifuge جديدة قبل تبريده أبقى على الجليد. تجاهل بيليه.

4. إعداد مقتطفات النووية من الخلايا المستزرعة

  1. لكل (الخطوة 1.2.5) جيدا، وغسل أرومة غاذية خلوية مثقف مرتين مع 1 مل من قبل تحسنت DPBS (المغنيسيوم 2+، كا 2+ مجانا). نضح DPBS وإضافة 500 ميكرولتر من 0.25٪ التربسين / EDTA. احتضان لمدة 1-3 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة CO 2 ووقف العلاج التربسين وذلك بإضافة 500 ميكرولتر من مصل يحتوي على وسائط النمو.
  2. نقل الخلايا إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع DPBS (المغنيسيوم 2+، كا 2+ خالية) وخلايا بيليه بواسطة الطرد المركزيفي 300 x ج لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. إزالة بعناية كل طاف دون الإخلال بيليه ووضع أنبوب على الجليد.
  3. استخراج البروتين النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحديد تركيز البروتين من كل عينة باستخدام فحص البروتين الكمي (برادفورد أو حمض bicinchoninic فحص (BCA)).

5. تحضير العينة والكهربائي

  1. تحديد تركيز البروتين لكل استخراج الخلايا باستخدام فحص البروتين الكمي (على سبيل المثال، برادفورد 8 أو BCA 9).
  2. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (إذا كان يمكن استخدام الأجسام المضادة في ظروف انخفاض وتمسخ)، إضافة حجم مساو من 2X Laemmli عينة العازلة (الجدول 2) إلى 20-30 ميكروغرام من البروتين الكلي.
  3. لست] خلية يغلي عند 100 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. قسامة 50-100 ميكرولتر من المحللة لتجنب تكرار تجميد دورات / الذوبان وتخزين أنابيب المتبقية في -20 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.
  4. في حين أن العينات يتم تسخين، وإعداد 1 لتر من 1X العازلة على التوالي (الجدول 2).
  5. تدور العينات في 16000 x ج لمدة بضع ثوان، ووضعها على الجليد.
  6. تحميل كمية متساوية من البروتين في كل بئر من 12٪ هلام SDS-PAGE (انظر الجدول رقم 2 لتكوين هلام)، جنبا إلى جنب مع الوزن الواسمات الجزيئية. تشغيل هلام ل1-2 ساعة على 100 V.

6. نقل البروتين من جل إلى غشاء

  1. تفعيل فلوريد البولي (PVDF) الغشاء مع الميثانول لمدة 1 دقيقة ويشطف نقل 1X حل العازلة / 10٪ الميثانول. وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، ونقل لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة اعتمادا على حجم البروتين.
    ملاحظة: كفاءة نقل يمكن تقييم باستخدام الشقائقية الأحمر تلطيخ قبل خطوة الحجب.

7. تلوين الأجسام المضادة

  1. منع الغشاء لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية باستخدام 5٪ عرقلة الحل.
  2. احتضان الغشاء مع المضادة Syncytin-2-الأجسام المضادة (4 ميكروغرام / مل، 1: 5000) 6 أو مع مكافحة غليسيرألدهيد-3-فوسفات نازعة (GAPDH؛ 0.4 ​​ميكروغرام / مل، 1: 500) في 5٪ عرقلة الحل بين عشية وضحاها في 4 ° C (مكافحة Syncytin-2) أو لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. يغسل الغشاء ثلاث مرات في مخزنة المالحة تريس توين (TBST، انظر الجدول 2 لتكوين العازلة) لمدة 5 دقائق.
  3. احتضان الغشاء مع المناسبة البيروكسيديز الفجل (HRP) -conjugated المضادة للأرنب أو الأجسام المضادة لمكافحة فأر (1: 10000) في 5٪ عازلة تمنع في TBST في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. يغسل الغشاء ثلاث مرات في TBST لمدة 5 دقائق ثم يشطف في TBS. كشف الإشارات باستخدام الركيزة النشاف القائم على التوهج.

8. Radiolabeling من واحدة الذين تقطعت بهم السبل قليل النوكليوتيد

  1. رد فعل الفسفرة
    1. في أنبوب microcentrifuge، إضافة 50 نانوغرام من النوكليوتيد إلى الأمام جنبا إلى جنب مع 1X T4 عازلة عديد النوكليوتيد كيناز، 1 UT4 كيناز عديد النوكليوتيد و 20 μCi (γ- 32 P) ATP وتشكل حجم رد الفعل إلى 20 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه.
    2. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وقف رد فعل عن طريق إضافة 5 ميكرولتر من 0.5 M EDTA. تشكل وحدة التخزين إلى 50 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه.
  2. إزالة النيوكليوتيدات الفردية من أليغنوكليوتيد]
    1. إعداد العمود G-25 معايرتها مع العازلة TE (الجدول 2) بعد تعليمات الشركة الصانعة. وضع عمود في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge خالية الدناز جديدة.
    2. ببطء إضافة 50 ميكرولتر من التحقيق (من الخطوة 8.1.2) على الراتنج، والحرص على عدم تعكير صفو السرير الراتنج. تدور لمدة 2 دقيقة في 350 x ج لجمع عينة النقاء في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. غسل العمود G-25 مع 36 ميكرولتر من nuclease خالية من المياه وتدور لمدة 2 دقيقة في 350 x ج لأنه جمع في أنبوب microcentrifuge.
  3. التهجين مع رأ حبلا التكميليةigonucleotide
    1. نقل التحقيق رديولبلد (86 ميكرولتر) إلى أنبوب microcentrifuge 1.5 مل وإضافة 200 نانوغرام من قليل النوكليوتيد العكسي و1X العازلة الصلب (الجدول 2). الحرارة 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية، وتترك ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة لتبريد.
    2. إعداد أليغنوكليوتيد المزدوج تقطعت بهم السبل غير المشعة عن طريق إضافة 50 نانوغرام من ليس لها علامة إلى الأمام وعكس أليغنوكليوتيد و1X العازلة الصلب في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. تشكل وحدة التخزين إلى 100 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. الحرارة والحفاظ على درجة حرارة الغرفة كما هو موضح في الخطوة 8.3.1.

9. إعداد عدم تغيير طبيعة بولي أكريلاميد جل لEMSA

  1. إعداد 4٪ هلام الأصلي (10 × 12 سم) مع 1.5 ملم الفضاء مشط (انظر الجدول رقم 2 لتكوين هلام). تنظيف جميع لوحات الزجاج باستخدام الماء المقطر.
    ملاحظة: من المهم للغاية أن لوحات تكون خالية تماما من المنظفات الأيونية، مثل SDS.
  2. على الفور صلدينا الحل الأكريلاميد في بين لوحات والسماح البلمرة للمضي قدما (حوالي 30 دقيقة).
  3. تجميع الأجهزة الكهربائي وملء خزان مع TBE 0.5X. قبل تشغيل هلام لمدة 30 دقيقة إلى 1 ساعة على 150 V قبل تحميل عينة.

10. الحمض النووي ملزم رد الفعل

  1. في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل، إضافة 10 ميكروغرام من استخراج النووي (الخطوة 4.3) في 1X جل ملزم التحول عازلة (الجدول 2) ويشكلون الحجم النهائي إلى 10 ميكرولتر مع nuclease خالية من المياه. كعنصر تحكم، وإعداد أنبوب مع عدم وجود مستخلص النووي. للتفاعل المنافسة، إضافة 1 ميكرولتر من النوكليوتيد البارد غير محددة أو معينة المزدوج تقطعت بهم السبل (الخطوة 8.3.2).
  2. إضافة 1 ميكرولتر من التحقيق المشع من الخطوة 8.3.1 لكل رد فعل. احتضان رد الفعل في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة 1 ميكرولتر من العازلة تحميل 10X جل في رد الفعل وتحميل كل عينة على هلام أعدت في الباب 9.
  3. تشغيل هلام ل1 1/2 إلى 2 ساعة على 150 خامسا بعد الهجرة، والتفاف جل والزجاج في غلاف بلاستيكي وموقف في الكاسيت التعرض أدناه شاشة الفوسفور. ترك كاسيت عند 4 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
  4. إزالة الشاشة من الكاسيت التعرض وضعه في الجهاز الفوسفور التصوير للمسح الضوئي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

استخدمت مشيمة جديدة من حالات الحمل المدى لعزل أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان الأساسية لإجراء مجموعة من التجارب المقدمة في قسم البروتوكول. بعد عزلتهم، علينا أولا بتحليل نقاء أرومة غاذية خلوية من خلال استخدام علامة cytokeratin-7 (الشكل 1). وهكذا ملطخة الاستعدادات خلية باستخدام وحيدة النسيلة المضادة للcytokeratin-7 الأجسام المضادة الشكل 1 يمثل نتائج تجربة نموذجية التالية تنقية أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية وتحليلها ب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

قد تحسنت الدراسات على وظيفة المشيمة الإنسان والتنمية إلى حد كبير من قبل بروتوكولات تهدف إلى تحسين عزل مختلف السكان الخلية المشيمة. واحدة من أفضل السكان الخلية المشيمة المدروس يبقى أرومة غاذية خلوية زغبي، ودراسة التي استفادت كثيرا من البروتوكولات الأمثل السماح عزلة فعالة وموثوق بها. وقد سمح ذلك أيضا على عدد من التجارب، مثل دراسات ترنسفكأيشن والمروج. باستخدام بروتوكول الموصوفة سابقا 3، مجموعات نقية من أرومة غاذية خلوية زغبي الأولية يمكن الحصول عليها. CK-7 هو بروتين خيوط و...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

وأيد هذا العمل من خلال منحة من العلوم والبحوث الهندسية المجلس الوطني لكندا (NSERC) (# 298527) (BB). وأيد CT من قبل منحة دراسية FARE المؤسسية. وأيد AV التي كتبها على درجة الدكتوراه NSERC غراهام بيل منحة دراسية. عقدت BB كرسي أبحاث كندا في Retrovirology الإنسان (المستوى 2). بفضل بياتريكس Beisner للمساعدة في إعادة النظر في النص.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
HBSS بدون  Ca2+, Mg2+ سيجما#H2387
HBSS (10x)Sigma# 14060-057
DMEM ارتفاع الجلوكوز بدون HepesGibco# 12100-061
Hepes (1 M)Gibco# 15630-080
Penicillin-Streptomycin-Neomycin (100x)Gibco# 15640-055
Amphotericin B & nbsp ;Sigma#A2411
CaCl2Sigma#C4901
MgSO4.7H2O سيجما#M
مصل الأبقار الجنينيGibco#16170-078 
Percoll سيجما#P-1644لتدرج الكثافة
Syncytin-2 siRNAAmbion Life #AM16708
مخفوق siRNAQiagen# SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
Trypsine ، النوع I & nbsp ؛Sigma#T8003
DharmaFECT Lipotransfection  الكواشف GEhealthcare# T-2001-01
Trypsin / EDTALife technologies# 25300-062
مثبط البروتيناتRoche Diagnostic# 11873580001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific# 23225
BSASigma#A7906
TWEEN 20Sigma#P9416  ؛
مكافحة الأرانب IgG ، الأجسام المضادة المرتبطة ب HRP   ؛إشارات الخلية# 7074
BM التلألؤ الكيميائي الركيزة الغربية النشاف (POD) RocheDiagnostic# 11500708001
DPBS & nbsp ؛تقنيات الحياة# 14287-080
T4 بولي النوكليوتيدات كينازNEB#M0201S
ATP ، [&gamma ؛ - 32 < / sup> P] بيركينإلمر#BLU002A100UC
أكريلميدسيجما   ؛#A9099
TEMEDLife Technologies#17919
Ammonium PersulfateSigma #A3678
استنساخ الأجسام المضادة للسيتوكيراتين -7 المضادة للإنسان LP5K ، FITC مترافقMilliporeCBL194Fالتخفيف 1: 200
كاشف حجب FcR   ؛Miltenyi Biotec130- 059-901التخفيف 1:10
مقياس التدفق الخلوي BD Acuri نظامBecton Dickinson
Microporator MP-100 جهاز  الرقمي لإعادة التعليق الحيوي
R (نظام نقل النيون 100   ؛ ومايكرو. ل كيت)تقنيات الحياةMPK10096
غشاء PVDF   ؛MilliporeIPVH00010 تنشيطه بالميثانول
الأجسام المضادة GAPDH المضادة للإنسانسانتا كروز التكنولوجيا الحيويةsc-1371791:500
Horseradi Peroxidase (HRP) - مترافق الماعز المضاد للأرانب أو الأجسام المضادة للفأرإشارات الخلية# 70741: 10،000
حصان الفجل بيروكسيداز (HRP) - الماعز المترافق الأجسام المضادة للفأرإشارات الخلية# 7076   ؛1:10,000
NE-PER كاشف الاستخراج النووي والسيتوبلازميThermo Scientific# 78833
G-25 column GE Healthcare# 27-5325-01
جهاز التصوير الكيميائي والفلورةMontr & eacute ؛ al BiotechFusion FX5
4٪ جل محليالصنع
PBSمحلي الصنع1x
نظام التصوير الجزيئي الشخصي (PMI)BioRad
كوكتيل المخزن المؤقت

المراجع

  1. Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
  2. Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta. 31, Suppl . S75-S81 (2010).
  3. Le Bellego, F., Vaillancourt, C., Lafond, J. Isolation and culture of term human cytotrophoblast cells and in vitro methods for studying human cytotrophoblast cells' calcium uptake. Methods Mol. Biol. 550, 73-87 (2009).
  4. Morrish, D. W., et al. In vitro cultured human term cytotrophoblast: a model for normal primary epithelial cells demonstrating a spontaneous differentiation programme that requires EGF for extensive development of syncytium. Placenta. 18, 577-585 (1997).
  5. Forbes, K., Desforges, M., Garside, R., Aplin, J. D., Westwood, M. Methods for siRNA-mediated reduction of mRNA and protein expression in human placental explants, isolated primary cells and cell lines. Placenta. 30, 124-129 (2009).
  6. Vargas, A., et al. Syncytin-2 plays an important role in the fusion of human trophoblast cells. J. Mol. Biol. 392, 301-318 (2009).
  7. Toufaily, C., Lokossou, A. G., Vargas, A., Rassart, E., Barbeau, B. A CRE/AP-1-Like Motif Is Essential for Induced Syncytin-2 Expression and Fusion in Human Trophoblast-Like Model. PLoS One. 10, e0121468(2015).
  8. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).
  9. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).
  10. Blaschitz, A., Weiss, U., Dohr, G., Desoye, G. Antibody reaction patterns in first trimester placenta: implications for trophoblast isolation and purity screening. Placenta. 21, 733-741 (2000).
  11. Desforges, M., et al. The SNAT4 isoform of the system A amino acid transporter is functional in human placental microvillous plasma membrane. J. Physiol. 587, 61-72 (2009).
  12. Felgner, P. L., et al. Lipofection: a highly efficient, lipid-mediated DNA-transfection procedure. Proc Natl Acad Sci U S A. 84, 7413-7417 (1987).
  13. Guilbert, L. J., et al. Preparation and functional characterization of villous cytotrophoblasts free of syncytial fragments. Placenta. 23, 175-183 (2002).
  14. Petroff, M. G., Phillips, T. A., Ka, H., Pace, J. L., Hunt, J. S. Isolation and culture of term human trophoblast cells. Methods Mol. Med. 121, 203-217 (2006).
  15. Ma, B., Zhang, S., Jiang, H., Zhao, B., Lv, H. Lipoplex morphologies and their influences on transfection efficiency in gene delivery. J. Control. Release. 123, 184-194 (2007).
  16. Freeley, M., Long, A. Advances in siRNA delivery to T-cells: potential clinical applications for inflammatory disease, cancer and infection. Biochem. J. 455, 133-147 (2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

تقنية الثقب المجهريتحليل مقايسة تغيير الحركة الكهربائية (EMSA)قياس التدفق الخلويتحليل لطخة ويسترنالحمض الريبي النووي الصغير المتداخل لبروتين Syncytin-2التفاعل بين البروتين والحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجينعزل الخلايا الأوليةحيوية الخلية
سيرنا ترنسفكأيشن وEMSA تحاليل المعزولة حديثا أرومة غاذية خلوية زغبي الإنسان
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.