يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات

9K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54018

⸱

أغسطس 23, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Dept. of Biomedicine, Pharmacenter, University of Basel, 2Molecular Signalling and Gene Therapy, Narayana Nethralaya Foundation, Narayana Health City, 3Brain Ischemia and Regeneration, Department of Biomedicine, University Hospital Basel, 4Department of Neurosurgery, Klinikum Idar-Oberstein, 5Department of Neurosurgery and Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, Stanford University, 6Department of Neurology, Laboratory of Molecular Neuro Oncology, University Hospital of Zurich

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

الظهارية إلى الانتقال اللحمة المتوسطة (EMT) تسمح للسرطانات بأن تصبح غازية. للتحقيق في EMT ، يتم وصف نموذج مختبري قائم على الخلايا الجذعية العصبية (NSC) خال من المصل والإنزيمات. يسمح هذا النظام الموحد بالتقييم الكمي والنوعي لهجرة الخلايا والتعبير الجيني والبروتيني. النموذج مناسب لاكتشاف الأدوية.

الملخص

الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) يصف عملية ظهارة transdifferentiating في اللحمة المتوسطة. EMT هو عملية أساسية أثناء التطور الجنيني الذي يحدث أيضا عادة في الإصابة بالورم الأرومي الدبقي، والأكثر شيوعا ورم خبيث في الدماغ. كما لوحظ EMT في سرطان متعددة خارج الدماغ بما في ذلك سرطان الثدي، سرطان الرئة، سرطان القولون، وسرطان المعدة. يرتبط EMT مركزيا إلى خبيثة من خلال تشجيع الهجرة والغزو وتشكيل ورم خبيث. ليست مفهومة تماما آليات EMT الاستقراء. نحن هنا وصف نظام في المختبر لعزل موحدة الخلايا القشرية الجذعية العصبية (NSCs) ولاحق EMT الاستقراء. ويوفر هذا النظام المرونة اللازمة لاستخدام إما الخلايا واحد أو ثقافة يزدرع. في هذا النظام، الفئران أو الماوس NSCs الدماغ المقدم الجنينية يتم تربيتها في وسط محددة، خالية من المصل والانزيمات. أعربت NSCs Olig2 وSox10، وهما عوامل النسخ التي لوحظت في oligodendrocخلايا YTE السلائف (يجد OPCs). باستخدام هذا النظام، والتفاعلات بين FGF-، BMP- وTGFβ-إشارات تنطوي Zeb1، Zeb2، ولوحظت Twist2 حيث TGFβ تفعيل زيادة كبيرة الهجرة الخلية، مما يشير إلى التآزر BMP- / TGFβ التفاعل. وتشير النتائج إلى شبكة من FGF-، BMP- وTGFβ-يشير إلى أن تشارك في EMT تحريض والصيانة. هذا النظام النموذج هو ذات الصلة لتحقيق EMT في المختبر. فمن فعالة من حيث التكلفة ويظهر استنساخ عالية. كما أنه يسمح للمقارنة بين المركبات المختلفة فيما يتعلق الردود هجرتهم (قياس المسافة الكمي)، وفحص الإنتاجية العالية من المركبات على تثبيط أو تعزيز EMT (قياس النوعية). ولذا فإن نموذج مناسبة تماما لاختبار مكتبات المخدرات عن المواد التي تؤثر EMT.

المقدمة

خلال عدة مراحل من التطور الجنيني، تفقد الخلايا الظهارية الالتزام القوي لبعضها البعض (على سبيل المثال، منعطفات ضيقة) والحصول على النمط الظاهري المهاجرة في عملية تسمى الظهارية للانتقال الوسيطة (EMT) 1. مطلوب EMT لتشكيل أنواع الخلايا إضافية، مثل الخلايا العصبية قمة الوسيطة، يبلغ عدد سكانها أن تفصل من الظهارة العصبية 2. EMT ليست ضرورية فقط خلال المراحل الجنينية ولكن المطلوب أيضا في مراحل لاحقة من حياة الكبار للحفاظ على العمليات الفسيولوجية في الكائن الحي الكبار، مثل التئام الجروح 3 والجهاز العصبي المركزي (CNS) تجديد في المزيل للآفات 4.

ومن المعروف الأورام الظهارية لإعادة تنشيط EMT كخطوة بدء الهجرة والغزو وورم خبيث، مما يؤدي في النهاية الى الاصابة بالسرطان تقدم 1،3. في الواقع يرتبط EMT مركزيا إلى 1،3 الهجرة قوي. الخطوات الخلوية جonditioning، بدء، يمر بها والحفاظ على EMT لا تكون مفهومة تماما وتحتاج إلى مزيد من التحقيق.

هنا، يتم تقديم في المختبر نظام نموذجي موحد EMT على أساس NSCs، مع عوامل النمو تعريف وسائل الإعلام (أي مصل ولا استخدام انزيم). هذا النظام النموذج هو من أهمية للعلماء تعمل على EMT. وقد ثبت الحلزون، زيب وتويست أسر البروتين أن تكون حاسمة لEMT سواء في التنمية ومرض 1. وتشارك الحلزون، زيب وتويست العائلات أيضا في نظام المقدمة. ويستند هذا النظام على منطقة محددة من الدماغ الأمامي التي عادة لا يخضع EMT توفير ميزة خاصة لدراسة الأحداث الأولية خلال EMT الاستقراء.

من المحتمل أن يتم تطبيق نظام نموذجي لدراسة EMT في ظهائر خارج الجهاز العصبي المركزي، منذ محرضات EMT الأساسية، مثل الحلزون، زيب والبروتينات تويست، تم العثور أيضا خلال EMT في أنظمة الأنسجة خارج الجهاز العصبي المركزي. هذا النموذج الصورةystem يسمح للعزلة موحدة من NSCs من القشرة النامية لدراسة خصائص الخلايا الجذعية بشكل عام وEMT على وجه الخصوص. باستخدام هذا النظام، ونحن عزل NSCs، EMT يسببها ودرس الهجرة لاحقة تحت تأثير FGF2 وBMP4. لاحظنا أن FGF- وBMP-يشير يتفاعل مع TGFβ مما يشير إلى تشجيع الهجرة الخلية، وبالتالي إضفاء الشرعية على نظام نموذجي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وجاءت جميع الإجراءات الحيوان "دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية" (منشورات المعاهد الوطنية للصحة، ال 8 طبعة 2011) وتمت الموافقة من قبل لجنة رعاية الحيوان في بازل (المبادئ التوجيهية السويسرية للرعاية واستخدام الحيوانات). من خلال هذه المبادئ التوجيهية يعتبر بروتوكول الحيوان من "أدنى الحيوان شدة الصف".

1. إعداد التوسع المتوسطة

ملاحظة: العمل في ظروف معقمة وفقا لمعايير زراعة الأنسجة.

  1. يستغرق عامين 15 مل أنابيب، وإضافة 5 مل من خالية L-الجلوتامين DMEM / F12 (1: 1) من 500 مل زجاجة المتوسطة في كل من اثنين من 15 مل الأنابيب. لأول أنبوب 15 مل، إضافة 50 ملغم البشري APO-ترانسفيرين، 50 ميكرولتر من بوتريسين 1 م الأوراق المالية (0.1 ملي تركيز النهائي) و 30 ميكرولتر من السيلينيوم الصوديوم 500 ميكرومتر الأسهم (تركيز النهائي 30 نانومتر).
    1. تصفية من خلال حقنة مرشح 0.2 ميكرون في زجاجة DMEM / F12 الأصلية.
  2. لثاني أنبوب 15 مل، إضافة 12.5 الأنسولين ملغ. إضافة6-9 قطرات من 1 M هيدروكسيد الصوديوم. دوامة بحل الأنسولين تماما. تصفية من خلال حقنة مرشح 0.2 ميكرون في زجاجة DMEM / F12 الأصلية.
    ملاحظة: هيدروكسيد الصوديوم هو السامة والمسببة للتآكل. استخدام القفازات الواقية، ومعطف، ونظارات السلامة.
  3. إضافة 5 مل البنسلين (10،000 وحدة / مل) / الستربتومايسين (10000 ميكروغرام / مل) / أمفوتيريسين ب (25 ميكروغرام / مل) إلى زجاجة / F12 المتوسطة DMEM.
  4. إضافة 5 مل من 200 ملي-الجلوتامين الأسهم إذابة طازجة أو oligopeptides تحتوي على الجلوتامين (200 ملي L-ألانيل-L-الجلوتامين ثنائي الببتيد) إلى زجاجة / F12 المتوسطة DMEM.
  5. هز جيدا. تجهيز 50 aliquots مل.
    ملاحظة: التوسع المتوسطة يمكن تخزينها لمدة لا تقل عن 2 أسابيع في 4 درجات مئوية. تظهر أنابيب Aliquoted أقل التغييرات الرقم الهيدروجيني مقارنة مع المتوسط ​​يوضع في 500 مل الزجاجات.

2. إعداد الركض المتوسطة

  1. إلى 1 L كا 2 + - والمغنيسيوم 2 + خالية HBSS وسائل الإعلام، إضافة 990.85 ملغ الجلوكوز (5 ملي تركيز النهائي) و840.10 ملغ NaHCO 3 (10 ملي تركيز النهائي). ضبط درجة الحموضة إلى 7.3 مع حمض الهيدروكلوريك (1 M الأسهم). فلتر تعقيم مع 0.2 ميكرون تصفية وجعل 50 مل قسامات.
    ملاحظة: يمكن تخزين الركض متوسطة لمدة 4 أسابيع على الأقل في 4 درجات مئوية.

3. إعداد عوامل النمو

  1. إعداد العقيمة برنامج تلفزيوني 1X مع 1٪ BSA (PBS-BSA) وحده أو مع حمض الهيدروكلوريك (حمض الهيدروكلوريك) في 4 ملم (PBS-BSA-حمض الهيدروكلوريك).
    تحذير: حمض الهيدروكلوريك هو تآكل والسامة ويتطلب اتخاذ تدابير خاصة سلامة (المعاطف، ونظارات واقية وقفازات، غطاء محرك السيارة).
  2. حل 10 ميكروغرام / مل المؤتلف الخلايا الليفية النمو البشري عامل 2 (rhFGF2) في برنامج تلفزيوني BSA (10 نانوغرام / مل تركيز النهائي)، و 10 ميكروغرام / مل المؤتلف الإنسان بروتين العظام تخلقية 4 (rhBMP4) في برنامج تلفزيوني BSA (10 نانوغرام / نهائي مل التركيز)، و 20 ميكروغرام / مل المؤتلف عامل البشري تحويل النمو بيتا 1 (rhTGFβ1) في برنامج تلفزيوني BSA، حمض الهيدروكلوريك (40 نانوغرام / مل تركيز النهائي).
    1. لا تصفية تعقيم. إعداد قسامات.
      ملاحظة: يمكن تخزين قسامات عامل النمو في-20 درجة مئوية لمدة 2 سنة على الأقل.

4. طلاء الخلية أطباق الثقافة

  1. حل 1،875 ملغ بولي-L-الأورنيثين (منظمة التحرير الفلسطينية) في 500 مل المقطر H 2 O لإعداد الأوراق المالية لمنظمة التحرير الفلسطينية 250X. فلتر تعقيم باستخدام فلتر حقنة 0.2 ميكرون، وجعل 2 مل قسامات.
    ملاحظة: يمكن تخزين هذه aliquots في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 2 سنوات.
  2. حل 1 ملغ الفيبرونكتين البقري في 1 مل العقيمة المقطر H 2 O لإعداد 1،000x الأسهم فبرونيكتين. لا دوامة لأن هذا قد تجلط البروتين اللزجة. يهز بلطف باليد لمدة 10 دقيقة.
    1. احتضان لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع الهز في بعض الأحيان. تحقق من وجود حل كامل. تدفئة حل لأقل من 37 درجة مئوية لمدة حل كامل للفبرونيكتين. لا تصفية تعقيم.
      ملاحظة: قد يتم تخزين الحل في 4 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. استخدام البلاستيك أطباق زراعة الخلايا سابقة التجهيز البلازما (100 ملم أو أحجام أخرى على النحو المطلوب لالتجربة). لتقييم الهجرة، استخدام 35 ملم الأطباق مع شبكة 500 ميكرون. احتضان الأطباق بين عشية وضحاها مع 2 مل 1X منظمة التحرير الفلسطينية لمدة 12 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 نسيج الثقافة الحاضنة. يغسل مرتين مع 2 مل برنامج تلفزيوني 1X.
  4. إضافة 2 مل 1X فبرونيكتين (1 ميكروغرام / مل تركيز النهائي)، واحتضان الأطباق مدة لا تقل عن 12 ساعة على 37 درجة مئوية في 5٪ CO 2 الحاضنة. إزالة فبرونيكتين قبل طلاء الخلايا.
    ملاحظة: يمكن تخزين الأطباق المغلفة فيبرونكتين] ل2 أسابيع على الأقل عند 37 درجة مئوية.

5. الموحدة تشريح وإعداد المنطقة Subventricular القشرية (SVZ)

  1. الحصول على الفئران الجنينية يوم 14.5 (E14.5 سبراغ داولي) وE13.5 الماوس (C57BL / 6) الأجنة عن طريق توقيت التزاوج. تزاوج الحيوانات من الساعة 18:00 حتى 08:00 من صباح اليوم التالي. يعتبر ظهر بعد يوم من التزاوج E0.5.
  2. تخدير الحيوان حاملا 5٪ الأيزوفلورين وتدفق الأوكسجين 0.8 لتر / دقيقة. تحقق استجابة ضغط مخلب مع ديس حادملقط ection. قطع رأس الحيوان. تجنب CO 2 الاختناق كما يؤثر CO 2 وقف الانتعاش الخلية.
  3. استرداد الأجنة عن طريق عملية قيصرية.
    1. وضع الحيوان في موقف ضعيف وتطهير الفراء مع الايثانول 70٪. استخدام ملقط الجراحة ومقص لجعل على شكل حرف V شق الجلد من حوالي 8 سم في أسفل البطن فوق الرحم. شق الجلد الوحيد مع الفراء مع الحفاظ على جدران عضلية سليمة.
    2. استخدام ملقط الطازجة ومقص لشق العضلات والجدار العضلي في البطن لإدخال الصفاق.
    3. تحديد الرحم في الجزء الأسفل من الغشاء البريتوني الخلفي. إزالة الرحم عن طريق فصل حاد من الأنسجة المحيطة بها.
    4. غسل الرحم مع الجنين مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X ومكان في الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X.
    5. استخدام مقص يميل غرامة لفتح جدران الرحم لاطلاق سراح الجنين عن طريق الجنين تحت المجهر تشريح (3X التكبير، الشكل 1B). استخدام زوج من ملقط لإزالة قشر الجنينية ( الشكل 1B). إبقاء الأجنة في متوسطة التوسع على الجليد.
    6. تحقق من هذه المرحلة التنموية الصحيحة من قبل أطلس للتطوير الجرذ الجهاز العصبي 5. ويظهر حجم الجنين الصحيح في الشكل 1B.
    7. تحقق سن الصحيح أبعد من ذلك وجود بداية تشكيل أرقام في forelimb الفئران (فلوريدا) كما هو موضح في الشكل 1A.
      ملاحظة: أطرافهم هند (HL) لا تظهر بعد الفصل رقم (الشكل 1B).
  4. للتشريح، ونقل الأجنة إلى أطباق بتري غير المصقول مليئة الجليد الباردة برنامج تلفزيوني 1X. أداء تشريح تحت المجهر ستيريو تشريح (3X إلى 20X التكبير) باستخدام ملقط غرامة تعقيمها.
    ملاحظة: أطباق بتري منع الحجز على الأنسجة إلى سطح الطبق كما قد يحدث مع أطباق زراعة الخلايا المغلفة البلازما. شحذ الإبر سلك التنغستن أو ما شابه ذلك هي مفيدة لاتخاذ خطوات معينة من تشريح أيضا.
  5. إزالة الجلد الرأس والجمجمة بدءا من الأسواق العالمية ضغطهاrsection من الدماغ الانتهائي تطوير (TEL) والدماغ البيني (DI) (الشكل 1B) عن طريق سحب في وقت واحد من الأمام والخلف مع اثنين من ملقط من أجل الوصول إلى الأنبوب العصبي النامي (الشكل 1C).
  6. التعرف على الدماغ المتوسط، الدماغ المؤخر للحدود (MHB، أسود رأس السهم في الشكل 1B-D)، الذي يفصل بين الدماغ المتوسط ​​(MES) من الدماغ المؤخر. قطع الدماغ المؤخر فقط عند أو تحت MHB (1D الشكل، السهم الثلاثي).
    ملاحظة: الفضاء تحت الجلد إضافية في MHB يسهل إزالة الجلد دون الإضرار الأنبوب العصبي.
  7. قطع الصلة بين الدماغ الانتهائي / الدماغ البيني في قاعدة الجمجمة مع الهيكل العظمي في الوجه (الشكل 1E). هذه النتائج في كتلة تحتوي على الدماغ الانتهائي، الدماغ البيني والدماغ المتوسط ​​(TEL-DI-MES) (أرقام 1F-H).
  8. نقل كتلة TEL-DI-MES إلى متوسطة التوسع على الجليد. يبقيه الإنشائيةغطت اعل في متوسطة التوسع في طبق بيتري غير المصقول. عقد الكتلة في الدماغ المتوسط ​​مع زوج من ملقط لتجنب لمس الدماغ الانتهائي الذي يحتوي على SVZ القشرية مع NSCs.
  9. كرر الخطوات من 5،5-5،8 مع جميع الأجنة (الشكل 1F-H).
  10. نقل واحد TEL-DI-MES منع إلى الطازج المثلج برنامج تلفزيوني 1X. قطع على طول الخط المنقط في الدماغ المتوسط ​​الأمامي (الشكل 1F-H)، الذي يفصل بين الدماغ المتوسط ​​من الدماغ البيني، كما هو مبين في الشكل 1I.
  11. فصل DI من هاتف عن طريق قطع على طول الخطوط المتقطعة في الشكل 1F. انظر الدماغ الانتهائي معزولة في الشكل 1J.
  12. تقسيم نصفي الدماغ الانتهائي، وقطع على طول الخط المنقط في الشكل 1J. وهذا يؤدي إلى نصفين يفصل كما هو موضح في الشكل 1K.
    ملاحظة: ويضاعف من نصف الكرة المخية الأيسر في الشكل 1L.
  13. التعرف على عصابة سطيالفضيلة lionic (MGE، الشكل 2A؛ *) والبارزة العقدية الجانبية (إل جي، الشكل 2A، +) وضوحا من خلال interventriculare الثقبة المستقبل.
    1. باستخدام ملقط أو إبرة، تشريح على طول خط مستقيم عند تقاطع بين MGE وشركة إل جي والقشرة الأمامية (النمل-CTX، الشكل 2B). قطع خط مستقيم من خلال القشرة، قرن آمون (الورك) والضفيرة المشيمية (CP). هذا يفصل بين القشرة الأمامية بما في البصلة الشمية (OB) من البارزة العقدية (GE، أرقام 2B، C).
  14. قطع الخط الثاني على التوالي في تقاطع البارزة العقدية الذيلية (الفريق، الشكل 2C، D) والقشرة الخلفية (الشكل 2C)، ومرة أخرى من خلال قطع القشرة، الحصين والضفيرة المشيمية.
  15. حلق في الدماغ الانتهائي. تماما إزالة القطب الخلفي والبصلة الشمية (الشكل 2D). تحديدهدب القشرية التي تحتوي على الحصين والضفيرة المشيمية (الشكل 2C)، على النحو المحدد سابقا 6،7.
    ملاحظة: الحصين لديه الظهارة العصبية أرق من القشرة. وCP يحتوي على السفن الحمراء.
    1. فصل تنحنح القشرية من القشرة، وترك حجم قشرة مماثلة لحجم البارزة العقدية (الشكل 2D). وهذا يؤدي إلى كتلة من القشرة (النسيج المستهدف) والبارزة العقدية (GE، الشكل 2D).
  16. الوجه كتلة القشرة-GE مع (الداخلي) الجانب البطين على سطح الطبق.
    ملاحظة: سوف السطح الخارجي من نصف الكرة الأرضية تواجه المجرب (الشكل 2E). على السطح الخارجي هي السحايا التي تحتوي على الأوعية الدموية (الشكل 2E).
    1. دبوس GE على سطح الطبق مع اليد اليسرى وقشر السحايا قبالة مع زوج من الملقط في اليد اليمنى (المهيمن) (الشكل 2F ).
      ملاحظة: هذا هو تقنيا معظم خطوة تطالب لأن السحايا التمسك بقوة القشرة. ومما يسهل فصل السحايا من القشرة عن طريق قطع خط مستقيم تماما (ليست خشنة) في الخطوات 5.13.1 و 5.14.
  17. كرر الخطوات 5،12-5،16 لنصف الكرة الأرضية الأخرى وجميع الأجنة. قطع القشرة على طول إل جي في مسافة نصف قطرها الرئيسي لشركة إل جي الكترونيكس (الشكل 2G، 2H). القشرة تشريح تمتد على مساحة 1.2 مم × 2.4 مم (الشكل 2H) وتشمل SVZ / طبقة جرثومي مع NSCs.

6. التحضير للثقافات يزدرع

  1. قطع القشرة إلى إإكسبلنتس أقل من 400 ميكرون قطرها (الشكل 2I). استخدام شبكة ميكرون 400 (الشكل التكميلي 1) وضعه تحت تشريح طبق بتري كمرجع (الشكل 2H و2I). نقل جميع إإكسبلنتس في طبق بيتري جديدة مع الثلج المشتركدينار التوسع المتوسطة.
  2. إزالة الفيبرونكتين من صحن زراعة الأنسجة (الخطوة 4.4). اتركه حتى يجف. إضافة 1 مل من المتوسط ​​التوسع البارد إلى وسط الطبق 35 ملم مع البعد شبكة من 10 ملم × 10 ملم (الشكل 3). تسمح وسيلة لتشكيل قطرة كروية (الشكل 3).
  3. إدراج ما يصل إلى 8 إإكسبلنتس إلى مركز للانخفاض. وإإكسبلنتس يجب أن تتواجد بشكل مثالي على الشبكة وعلى مسافة 3 مم على الأقل بين بعضها البعض لتحليل الهجرة (انظر القسم 8).
  4. احتضان الطبق لمدة 1 ساعة في حاضنة الثقافة الخلية (37 درجة مئوية، و 21٪ O 2، 5٪ CO 2) لمرفق من إإكسبلنتس. السماح للإإكسبلنتس لتسوية ونعلق على سطح فبرونيكتين المغلفة. لا تهزه الطبق، منذ إإكسبلنتس قد فصل والخروج من وسط الشبكة الأمثل.
  5. بعد 1 ساعة حضانة (37 درجة مئوية، و 21٪ O 2، 5٪ CO 2)، تملأ الطبق إلى الحجم الكلي لل2 مل توسع المتوسطة بالإضافة إلى النمو والجهات الفاعلة أو المواد ذات الفائدة لاختبار واحتضان.
    ملاحظة: لا الأنزيمية الهضم، ولا مصل أو الطرد المركزي ضرورية لإعداد يزدرع. هذا هو الأمثل لسلامة الخلية.

7. إعداد NSC الثقافة خلية واحدة

  1. الاحماء التوسع والركض المتوسط ​​عند 37 درجة مئوية.
  2. ونقل القطع القشرة تشريح (من الخطوة 5.17) في أنبوب 15 مل مع المتوسطة التوسع البارد (أنبوب A). أجهزة الطرد المركزي لقطع القشرة لمدة 5 دقائق في 1200 ز س. نضح طاف. إضافة 200 ميكرولتر التوسع قبل حرارة متوسطة إلى resuspend وقطع القشرة.
  3. إضافة 700 ميكرولتر من قبل حرارة متوسطة الركض إلى أنبوب 15 مل مع طرف P1،000 (أنبوب A). resuspend بلطف بيليه. ضع طرف في الجزء السفلي من أنبوب 15 مل. بلطف وببطء فصل القطع الأنسجة عن طريق شفط ثلاث مرات مع طرف P1،000.
    ملاحظة: الركض المتوسطة يعزز فصل الخلية ومطلوب لتجنب استخدام الإنزيمات.
  4. السماح للأنبوب إلى الجلوس لمدة 30 إلى 60 ثانية للحصول على أكبر (أثقل) قطع undissociated ليستقر في القاع. ستبقى خلايا فصل واحد في طاف. نقل حوالي 700 ميكرولتر من طاف لأنبوب 15 مل الطازجة (أنبوب B).
  5. كرر الخطوات من 7.3 و 7.4 لفصل القطع الكبيرة.
  6. كرر الخطوات من 7.3 و 7.4 مرة ثانية لفصل القطع الكبيرة. نقل جميع طاف لأنبوب 15 مل الطازجة (أنبوب B).
  7. إضافة المتوسطة التوسع إلى إجمالي حجم 5 مل. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. تقييم الخلايا الميتة عن طريق تلطيخ التريبان الأزرق.
    ملاحظة: NSCs الصغيرة تتسامح مع الخطوات 7،2-7،6 أفضل من خلايا أكبر. من 10 الأجنة نتوقع حوالي 4 × 10 6 الخلايا مع الخلايا الميتة 10٪.
  8. لتوسيع NSCs، لوحة 1.5 × 10 6 خلايا في صحن 10 سم زراعة الأنسجة المغلفة فبرونيكتين في حجم 8 مل توسع المتوسطة. للتوسع قياسي، إضافة 8 ميكرولتر من الأسهم 1،000x rhFGF2. إضافة 8 ميكرولتر rhFGF2 كل يوم وتغيير ليديا كل يوم.
    ملاحظة: القشرة في هذه المرحلة التنموية يحتوي على غالبية NSCs وأقلية فقط من الخلايا المتمايزة. الخلايا أقلية متباينة لا تستجيب إلى rhFGF2 المعالجة ويموت خلال ثقافة التوسع.
  9. توسيع مرور NSCs في 60٪ التقاء.
    1. لNSCs مرور، وإزالة المتوسطة التوسع. غسل الخلايا بسرعة ثلاث مرات مع المتوسط ​​5 مل الركض. الانتظار 2-4 دقائق. دون كا 2 + والمغنيسيوم 2 + الخلايا فصل ببطء من على سطح الأرض، باعتقال. تحقق من مفرزة من الخلايا تحت المجهر المرحلة. انتظر بضع دقائق أخرى، إذا لزم الأمر، حتى لوحظ مفرزة البصرية من السطح.
      ملاحظة: خلايا واحدة وفصل تماما، ولكن معظم الخلايا لا تزال تلتزم سطح الطبق. مدة اللازمة لمفرزة تعتمد على مدة طلاء فبرونيكتين. طلاء الفيبرونكتين قصيرة (12 ساعة أو أقل) النتائج في أسرع مفرزة الخلية. للتجارب أطول (>. ينصح 1 أسبوع) طلاء الفيبرونكتين من أكثر من 24 ساعة.
  10. استخدام ماصة 10 مل لفصل بلطف الخلايا من السطح. جمع المتوسطة الركض 5 مل مع الخلايا وتحويلها إلى أنبوب 15 مل الطازجة. كرر مع 5 مل إضافية من المتوسطة الركض.
  11. فصل الخلايا في الأنبوب 15 مل من قبل pipetting صعودا وهبوطا ثلاث مرات، ووضع الماصة 10 مل في الجزء السفلي من الأنبوب. تدور الأنبوب لمدة 15 دقيقة في 1200 x ج في درجة حرارة الغرفة. إزالة طاف و resuspend بيليه في 2 مل توسع المتوسطة. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات. استخدام اللون الأزرق التريبان لتقييم الخلايا الميتة.
    ملاحظة: بعد توسع إلى 60٪ التقاء، ونتوقع 4-5 × 10 6 خلايا مع خلايا ميتة في حوالي 10٪.
  12. لوحة 8 × 10 5 خلايا لكل 10 طبق سم للمزيد من المقاطع.

8. تقييم الهجرة

  1. لتقييم الهجرة، عزل إإكسبلنتس وفقا للمادة 5. البذور وإإكسبلنتس في35 أطباق مم الشبكة. ساعة واحدة بعد الطلاء، إضافة FGF2 (rhFGF2). ضع الأطباق في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
    ملاحظة: للحصول على التعلق يزدرع الأمثل، وتجنب تحريك الأطباق.
  2. إزالة المتوسطة من 1000 غيض ميكرولتر. إضافة 2 مل من المتوسط ​​التوسع 1000 غيض ميكرولتر بدءا من الدائرة الداخلية (الشكل 3). وهذا يقلل التوتر السطحي على إإكسبلنتس.
  3. إضافة عوامل النمو وحده أو في مجموعة على النحو المطلوب لالتجربة. استخدام FGF2 / BMP4 / TGFβ1 تحكم إيجابية. ملاحظة: في هذه التجربة، تم إضافة 2 ميكرولتر FGF2 في 35 طبق ملم، 2 ميكرولتر BMP4 و 4 ميكرولتر TGFβ1 حده، وبالاشتراك (الشكل 5).
    1. إضافة عوامل إضافية و / أو المواد القابلة للقياس. حافظ على الأطباق مرة أخرى دون تغيير لمدة 2 أيام عند 37 درجة مئوية.
  4. التقاط صور لإإكسبلنتس على مجهر مقلوب.
    ملاحظة: إإكسبلنتس المعيشة تسفر أفضل الصور الطوري من خلايا ثابتة. يمكن استخدامها على حد سواء.
  5. للهجرةالتقييم، واستخدام برامج الرسومات التي تسمح القياسات بكسل (على سبيل المثال، فيجي 8).
  6. قياس الشبكة طبق من 500 ميكرون المسافة بالبكسل واستخدامها كمرجع الداخلية.
  7. تحديد مركز يزدرع كنقطة بداية الهجرة. قياس المسافة بين وسط يزدرع ومجموعة الأبعد من 10 خلايا.
    ملاحظة: جميع تهاجر الخلايا بشكل مركزي بعيدا عن يزدرع. وهي تشكل بشكل عفوي ورقة في محيط تحت ظروف اختبار (الشكل 5).

9. تقييم الغزو

  1. إعداد زراعة الأنسجة 24 لوحات جيدا المغلفة فبرونيكتين وفقا للمادة بروتوكول 4.
  2. وضع 300 ميكرولتر من متوسطة التوسع الدافئ في البئر العلوي من غرف غزو الخلايا. احتضان غرف لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  3. إزالة المتوسطة توسع من البئر العلوي ووضع غرفة بويدن إلى المغلفة لوحة 24-جيدا.
  4. إضافة 500 ميكرولتر من متوسطة التوسع دافئ مع 0.5 ميكرولتر من rhFGF2 وrhBMP4 0.5 ميكرولتر إلى أسفل أيضا.
  5. NSCs مرور والاعتماد كما هو موضح في القسم 7. مقاطع 1-4 هي مناسبة.
  6. لوحة 5 × 10 5 خلايا في حجم 300 ميكرولتر من متوسطة التوسع دافئ مع 0.3 ميكرولتر من rhFGF2 و 0.3 ميكرولتر من rhBMP4 في البئر العلوي من غرفة بويدن.
  7. ثقافة NSCs المصنفة لمدة 24 ساعة.
  8. إضافة عوامل إضافية و / أو المواد القابلة للقياس إلى الغرفة وثقافة الخلايا لمدة 48 ساعة أخرى.
    ملاحظة: إذا كانت الخلايا الغازية، أنها سوف تمر من أعلى أيضا من خلال طبقة الغشاء القاعدي إلى أسفل أيضا. والخلايا الغازية تتشبث إلى الجزء السفلي من الغرفة بويدن.
  9. متابعة بروتوكول المقدمة من قبل الشركة المصنعة. استخدام قطعة قطن (المدرجة في المجموعة فحص الغزو) لإزالة الخلايا غير الغازية في البئر كبير عن طريق تنظيف مرتين.
  10. إزالة المتوسطة من الآبار وإضافة 500 ميكرولتر التوسع المتوسطة معوصمة عار غشاء البلازما للخلايا الحية ومع دابي صبغ النووي إلى الآبار.
  11. احتضان لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    ملاحظة: سوف الأصباغ الاندماج في الغشاء ونواة الخلايا الغازية، على التوالي، على التصور الأمثل 8. الخيار: حذفت البلازما غشاء صبغة إذا تم التخطيط مناعية متعدد الألوان.
  12. إزالة المتوسطة مع الأصباغ ويغسل مرتين مع المتوسط ​​التوسع. تصور وعدد الخلايا الغازية مع مجهر مضان مقلوب كما هو موضح سابقا 8.
    ملاحظة: بعض الخلايا الغازية قد فصل من الجزء السفلي من الغرفة وقد انخفضت إلى السطح أقل بكثير من حيث التمسك السطح المطلي. لتحليل كامل تضمين الخلايا في السطح جيدا.
  13. إزالة المتوسطة وإصلاح الخلايا في الجليد الباردة العذبة PFA 4٪ لمدة 10 دقيقة. غسل 3X مع برنامج تلفزيوني 1X. أداء مناعية على خلايا الغازية، كما هو موضح سابقا 10/08.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

ويستند هذا النظام نموذج EMT على عزل موحدة من NSCs على حد سواء كما الخلايا واحد أو إإكسبلنتس من منطقة محددة من الأنبوب العصبي النامية، القشرة المركزية (الشكلان 1 و 2). للتقييم الكمي، وكانت المصنفة إإكسبلنتس الحق في وسط الطبق الثقافة شبكة 500 ميكرون (الشكل 3). وقد كشفت إإكسبلنتس من القشرة المركزية أول من FGF2 لمدة يومين، تليها يومين إضافيين في تركيبات مختلفة من عوامل النمو (الجدول 1).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في هذه الدراسة تم وصف نظام موحد لEMT تحليل NSCs استخدام (تلخيصها في الشكل التكميلي 3). توحيد يضمن استنساخ (الجدول 1 و 2). وتستمد NSCs من القشرة النامية، والأنسجة التي عادة لا يخضع EMT. هذا هو ميزة لتحليل الخطوات الأولى في EMT. الخطوات الأولية في EMT لا يمكن دراستها بشكل كاف في الخلايا السرطانية التي تراكمت التغيرات الجينية وربما تكون قد اعتمدت بالفعل ملامح EMT. وعلاوة على ذلك، وعينات الأورام الأولية ليست مثالية لفهم EMT لأن معظم الأورام الخبيثة هي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

يعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.

شكر وتقدير

وأيد هذه الدراسة من قبل مؤسسة جامعة بازل علوم ومؤسسة العلوم الوطنية السويسرية عن طريق منحة إلى MHS وAG (الجبهة الوطنية الصومالية IZLIZ3_157230). نشكر الدكتور تانيا رينالدي Burkat لتوفير بسخاء البنية التحتية. جميع أعضاء مجموعة Bettler للمناقشات وتعليقات. نشكر جيرهارد Dorne (لايكا مايكروسيستمز، سويسرا) لتركيب المهنية والكفاءة للالكاملة كاميرا الفيديو HD MC170 (لايكا مايكروسيستمز، سويسرا).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
BMP4, rhBMP4RnD Systems 314-BP-01M
البنكرياس البقري الأنسولينSigma I1882
غرفة Boyden ، مقايسة غزو الخلية CytoSelectCell BiolabsCBA-11024 نظام لوحة البئر
طبق ثقافة الخلية مع طبق شبكيIbidi 500 مم ، 35 مم80156
CellMask OrangeLife TechnologiesC10045صبغة غشاء البلازما ، استخدم عند 1: 1،000.
DAPILifeTechnologiesD1306بسعر 5 مجم / مل ، استخدم عند 1: 10,000. السرطان. الحماية المناسبة (القفازات والمعطف والنظارات الواقية) المطلوبة.
DMEM / F12 1: 1 زجاجة متوسطةGibco Invitrogen21331-020
FGF2 ، أنظمة rhFGF2RnD233-FB-01M
Fibronectine ، بقريSigma & nbsp ؛F4759
الملحق Glutamax  Gibco Invitrogen 35050-061
برنامج الرسومات مع ميزة قياس البكسلفيجيالإصدار fiji.sc/Fiji2.0.0-rc-30 / 1.49s
HBSS وسائطSigma H9394
الإنسان apo-TransferrinSigmaT1147محتمل مهيج للرئة. تجنب الاستنشاق. استخدم الحماية المناسبة.
L-الجلوتامينGibco Invitrogen 25030-024
Nestin ، الفأر المضاد للجسم المضادNestinGenetex GTX26142الاستخدام في 1: 100 ، تثبيت 4٪ PFA ، Triton X100 بنسبة 0.1٪
Olig2 ، أجسام مضادة للأرانب مضادة للOlig2مقدمة من Hirohide Takebayashالمخزون الشخصيالاستخدام عند 1: 2,000 ، تثبيت PFA بنسبة 4٪ ، Triton X100 بنسبة 0.1٪
بنسلين / ستربتومايسين / FungizoneGibco Invitrogen   ؛15240-062
بودوبلانين ، الفأر المضاد للجسم المضاد للبودوبلانينAcrisDM3614Pالاستخدام عند 1: 250 ، تثبيت 4٪ PFA ، تجنب Triton X100
Poly-L-ornithineSigma   ؛P3655
PutrescineSigma P5780مهيج للجلد والعين. الحماية المناسبة مطلوبة.
سيلينيت الصوديومسيجما S5261
Sox10 ، الأرنب المضاد للجسم المضاد ل Sox10Millipore ChemiconAB5774استخدم في الساعة 1: 200 ، تثبيت 4٪ PFA ، Triton X100 عند 0.1٪
TGFb1 ، rhTGFb1أنظمة RnD240-B-010
أطباق بتري غير المطليةFalconCorning 351029
مخزون

المراجع

  1. Nieto, M. A. Epithelial-Mesenchymal Transitions in development and disease: old views and new perspectives. Int J Dev Biol. 53, 1541-1547 (2009).
  2. Sauka-Spengler, T., Bronner-Fraser, M. A gene regulatory network orchestrates neural crest formation. Nat Rev Mol Cell Biol. 9, 557-568 (2008).
  3. Barriere, G., Fici, P., Gallerani, G., Rigaud, M. Mesenchymal Transition: a double-edged sword. Clin Transl Med. 4, 14(2015).
  4. Zawadzka, M., et al. CNS-resident glial progenitor/stem cells produce Schwann cells as well as oligodendrocytes during repair of CNS demyelination. Cell Stem Cell. 6, 578-590 (2010).
  5. Paxinos, G., Ashwell, K. W. S., Törk, I. Atlas of the developing rat nervous system. , 2nd edn, Academic Press. (1994).
  6. O'Leary, D. D., Chou, S. J., Sahara, S. Area patterning of the mammalian cortex. Neuron. 56, 252-269 (2007).
  7. O'Leary, D. D., Sahara, S. Genetic regulation of arealization of the neocortex. Curr Opin Neurobiol. 18, 90-100 (2008).
  8. Sailer, M. H., et al. Non-invasive neural stem cells become invasive in vitro by combined FGF2 and BMP4 signaling. J Cell Sci. 126, 3533-3540 (2013).
  9. Sailer, M. H., et al. BMP2 and FGF2 cooperate to induce neural-crest-like fates from fetal and adult CNS stem cells. J Cell Sci. 118, 5849-5860 (2005).
  10. Sailer, M., Oppitz, M., Drews, U. Induction of cellular contractions in the human melanoma cell line SK-mel 28 after muscarinic cholinergic stimulation. Anat Embryol (Berl). 201, 27-37 (2000).
  11. Wicki, A., Christofori, G. The potential role of podoplanin in tumour invasion. Br J Cancer. 96, 1-5 (2007).
  12. Wicki, A., et al. Tumor invasion in the absence of epithelial-mesenchymal transition: podoplanin-mediated remodeling of the actin cytoskeleton. Cancer Cell. 9, 261-272 (2006).
  13. Mishima, K., et al. Increased expression of podoplanin in malignant astrocytic tumors as a novel molecular marker of malignant progression. Acta Neuropathol. 111, 483-488 (2006).
  14. Motomura, K., et al. Immunohistochemical analysis-based proteomic subclassification of newly diagnosed glioblastomas. Cancer Science. 103, 1871-1879 (2012).
  15. Kono, T., et al. Immunohistochemical detection of the lymphatic marker podoplanin in diverse types of human cancer cells using a novel antibody. Int J Oncol. 31, 501-508 (2007).
  16. Raica, M., Cimpean, A. M., Ribatti, D. The role of podoplanin in tumor progression and metastasis. Anticancer Res. 28, 2997-3006 (2008).
  17. Panchision, D. M., McKay, R. D. The control of neural stem cells by morphogenic signals. Curr Opin Genet Dev. 12, 478-487 (2002).
  18. Lamouille, S., Xu, J., Derynck, R. Molecular mechanisms of epithelial-mesenchymal transition. Nat Rev Mol Cell Biol. 15, 178-196 (2014).
  19. Gonzalez-Perez, O., Alvarez-Buylla, A. Oligodendrogenesis in the subventricular zone and the role of epidermal growth factor. Brain Res Rev. 67, 147-156 (2011).
  20. Hu, J. G., et al. PDGF-AA mediates B104CM-induced oligodendrocyte precursor cell differentiation of embryonic neural stem cells through Erk, PI3K, and p38 signaling. J Mol Neurosci. 46, 644-653 (2012).
  21. Galvao, R. P., et al. Transformation of quiescent adult oligodendrocyte precursor cells into malignant glioma through a multistep reactivation process. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, E4214-E4223 (2014).
  22. Liu, C., et al. Mosaic analysis with double markers reveals tumor cell of origin in glioma. Cell. 146, 209-221 (2011).
  23. Das, S., Srikanth, M., Kessler, J. A. Cancer stem cells and glioma. Nat Clin Pract Neurol. 4, 427-435 (2008).
  24. Modrek, A. S., Bayin, N. S., Placantonakis, D. G. Brain stem cells as the cell of origin in glioma. World J Stem Cells. 6, 43-52 (2014).
  25. Sampetrean, O., et al. Invasion precedes tumor mass formation in a malignant brain tumor model of genetically modified neural stem cells. Neoplasia. 13, 784-791 (2011).
  26. McNeill, R. S., et al. Modeling astrocytoma pathogenesis in vitro and in vivo using cortical astrocytes or neural stem cells from conditional, genetically engineered mice. JoVE. , e51763(2014).
  27. Lara-Padilla, E., Caceres-Cortes, J. R. On the nature of the tumor-initiating cell. Curr Stem Cell Res Ther. 7, 26-35 (2012).
  28. Busch, C., et al. BMP-2-dependent integration of adult mouse subventricular stem cells into the neural crest of chick and quail embryos. J Cell Sci. 119, 4467-4474 (2006).
  29. Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139, 871-890 (2009).
  30. McDonald, O. G., Wu, H., Timp, W., Doi, A., Feinberg, A. P. Genome-scale epigenetic reprogramming during epithelial-to-mesenchymal transition. Nat Struct Mol Biol. 18, 867-874 (2011).
  31. Rahimi, R. A., Leof, E. B. TGF-beta signaling: a tale of two responses. J Cell Biochem. 102, 593-608 (2007).
  32. Xu, J., Lamouille, S., Derynck, R. TGF-beta-induced epithelial to mesenchymal transition. Cell Res. 19, 156-172 (2009).
  33. Suva, M. L., Riggi, N., Bernstein, B. E. Epigenetic reprogramming in cancer. Science. 339, 1567-1570 (2013).
  34. Sullivan, R., et al. A possible new focus for stroke treatment - migrating stem cells. Expert Opin Biol Ther. , 1-10 (2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

الخلايا الجذعية العصبيةتحفيز الانتقال الظهاري المتوسطزراعة المستأصلات النسيجيةهجرة الخلاياتأشير TGF Betaالمعالجة بـ BMP4تشريح القشرة المخيةطلاء الفبرونيكتينالفرز عالي الإنتاجية
نموذج الانزيمات والمصل خالية من العصبية الثقافة الخلايا الجذعية لEMT التحقيق مناسبة للاكتشاف المخدرات
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.