مقالة منهجية

الاستنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية لجس التنظيم المكاني للتمايز الأقدار

DOI:

10.3791/54097

⸱

يونيو 17, 2016

 ,  , 
1Department of Biomedical Engineering, National University of Singapore, 2Singapore Institute of Neurotechnology (SINAPSE), National University of Singapore

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs) لديهم القدرة الذاتية للتمييز وتنظيم الذات في أنماط النسيج متميزة. على الرغم من أن هذا يتطلب عرض التدرجات البيئية المكانية. نقدم الاستنسل micropatterning كوسيلة من وسائل بسيطة وقوية لتوليد التدرجات الكيميائية الحيوية والميكانيكية للسيطرة على أنماط التمايز hPSC.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) ، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية والخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات ، لديها القدرة الجوهرية على التمايز إلى جميع الطبقات الجرثومية الثلاث. هذا يجعلها مصدرا جذابا للخلايا للطب التجديدي والنمذجة التجريبية لتكوين الأعضاء الطبيعي والمريض. ومع ذلك ، فإن تمايز hPSCs في المختبر غير متجانس ومضطرب مكانيا. من المحتمل أن توفر تقنيات النمطية الدقيقة للخلايا وسائل للتحكم مكانيا في البيئات الدقيقة للخلايا الجذعية وتنظيم مصائر التمايز الناتجة. يجب أن تأخذ hPSCs المضاربة في الاعتبار المتطلبات الصارمة لبقاء hPSC وصيانتها. هنا ، نصف النمط الدقيق للاستنسل كطريقة متوافقة للغاية مع hPSCs. يتم تحديد الأنماط الدقيقة hPSC من خلال هندسة استنسل الخلية من خلال الثقوب ، والتي تحد فعليا المواقع التي يمكن أن تصل فيها hPSCs إلى الركيزة الأساسية المطلية بالمصفوفة خارج الخلية والارتباط بها. نظرا لهذا النمط من التشغيل ، هناك مرونة أكبر لاستخدام الركائز التي يمكن أن تدعم بشكل كاف hPSCs مقارنة بطرق النمطية الدقيقة الأخرى للخلية. نسلط الضوء أيضا على الخطوات الحاسمة للتوليد الناجح للأنماط الدقيقة hPSC. على سبيل المثال ، نوضح أنه يمكن استخدام الاستنسل المجهري للاستنسل لمركبات hPSCs لتعديل الاستقطاب المكاني لخلية الخلية والالتصاقات المصفوفة الخلوية ، والتي بدورها تحدد أنماط تمايز الأديم المتوسط. تعمل هذه الطريقة البسيطة والقوية لنمط الخلايا الجذعية السرطانية على توسيع احتمالات إنشاء نماذج تجريبية للتحقيق في تنظيم الأنسجة والنمذجة أثناء التطور الجنيني المبكر.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الجذعية المحفزة الإنسان (hPSCs)، بما في ذلك الخلايا الجذعية الجنينية (hESCs) والتي يسببها الخلايا الجذعية المحفزة (hiPSCs)، وتستغل على نطاق واسع في الطب التجديدي، وكذلك نماذج تجريبية من توالد الطبيعي والمريضة بسبب إمكانية المفاضلة الخاصة بهم في الأنساب خلية من كل ثلاث طبقات جرثومية 1،2. مصير التفريق بين hPSCs شديدة الحساسية للعوامل البيئية المحلية التي يمكن أن تعدل عمليات mechanotransduction autocrine أو نظير الصماوي يشير 1 وكذلك بوساطة الإشارات الجسدية 3-5. يشمل micropatterning خلية مجموعة من التقنيات التي تم تطويرها لتنظيم مكانيا هندسة والمكان من السكان خلية كوسيلة للسيطرة على المكروية الخلوية المحلية، مثل التفاعلات خلية خلية 6 والتفاعلات خلية مصفوفة 3. في سياق hPSCs، واستخدمت micropatterning خلية للحصول على أفكار هامة في كيفية محراب تعتمدوالأنف والحنجرة إشارات autocrine ينظم HESC القرارات تعدد القدرات تمايز 7 والتنظيم في وقت مبكر أنماط التمايز الجنينية 6. وقد استخدمت 2D و 3D hPSCs micropatterned للتحكم في حجم مستعمرة من أنماط متعددة الخلايا، والتي بدورها أثرت على قرارات التمايز في الطبقات الجرثومية الثلاث 8،9. لقد استخدمنا micropatterns hPSC متعددة الخلايا لتعديل حجم خلية خلية والتفاعلات خلية مصفوفة داخل مستعمرة hPSC لمعرفة كيف يمكن للإنتغرين-E-كادهيرين الحديث المتبادل يمكن أن تؤدي إلى مصير خلية التجانس 10. المظاهرات من التقارير المذكورة تفتح مجالات جديدة نحو تطبيق micropatterns متعددة الخلايا من hPSCs كنماذج تجريبية لفحص سمية الدواء للأمراض التنموية 11، لدراسة تأثير عوامل النمو والهرمونات خلال الأنسجة أو تطوير الجهاز، ولكشف تشكيل أنماط النسيج.

عدد لا يحصى من micropatter خليةوقد تم تطوير تقنيات نينغ على النحو الذي استعرضه Falconnet وآخرون. آل 12 ولكن فقط حفنة، مثل الصغرى الاتصال الطباعة 7،8،13، ثقافة microwell 14،15، photopatterning تم تنفيذ 6 وmicrostencils 16 بنجاح مع hPSCs. التحدي مع hPSCs micropatterning يكمن في ضعفها والمتطلبات الصارمة للمصفوفات معينة خارج الخلية (ECM) وظروف النمو لمرفق الخلية والبقاء على قيد الحياة. لأنماط 2D hPSC والطباعة الاتصال الصغرى هي واحدة من أكثر الطرق شيوعا لتوليد micropatterns hPSC على زراعة الأنسجة والزجاج ركائز 13. ويمكن استخدام هذه الطريقة لECM المشترك نمط المستخدمة في الثقافة hPSC، بما في ذلك laminin والغشاء القاعدي المصفوفات، مثل Matrigel. ومع ذلك، فإنه عادة ما يتطلب عملية طلاء خطوتين بمساعدة بولي-D-ليسين، ويحتاج الظروف الجوية والرطوبة الخاملة محددة لجعل micropatterns ECM مستقر لhPSCs لنعلق على 6،13. النظر قبل كل شيء من كل طريقة micropatterning هو ما إذا كان نظام تعديل السطح يمكن أن تولد أنماط ECM hPSC لاصقة في القرار الهندسي المطلوب، مع التقليل من مرفق الخلية غير محددة إلى المناطق المحيطة بها.

هنا، ونحن التقرير استخدام micropatterning الاستنسل كوسيلة من وسائل بسيطة لتوليد micropatterns hPSC دون خطوات تعديل سطح إضافية قبل جيل من أنماط ECM لاصقة لhPSCs إرفاق جرا. ويضم الاستنسل الخلية من غشاء رقيق، ورقة على سبيل المثال، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS)، مع ميكرون إلى ملليمتر حجم من خلال ثقوب مختومة على ركيزة الثقافة الخلية لاحتواء جسديا الطلاءات ECM وhPSCs المصنف في وقت لاحق. كما تعمل الاستنسل الزخرفة بإعاقة جسدية الموقع حيث يمكن hPSC الوصول وإرفاق مباشرة إلى الركيزة ECM الأساسي المغلفة، وهذا الأسلوب هو متوافق مع مختلف ركائز التي يمكن أن تدعم الثقافات hPSC. والاحتياج فقطتي هو أن اختيار المواد الاستنسل يمكن ان تشكل ختم عكسها مع الركيزة. وتشمل هذه الركائز التقليدية البوليسترين زراعة الأنسجة (برنامج التعاون الفني) 17، ركائز مترافق يجند 18، وكذلك ركائز المرنة مع صلابة الانضباطي (على سبيل المثال، PDMS) 19. كما يسمح هذا الأسلوب طلاء ECM مختلفة، مثل vitronectin (أو البروتين VTN)، laminin والمصفوفات الغشاء القاعدي (على سبيل المثال، Matrigel وGeltrax) للسماح لمرفق السليم والتفريق بين hPSCs. ولذلك، فإننا يمكن نقل الأمثل تكوينات ECM-الركيزة للحصول على خط hPSC محددة لالاستنسل micropatterning الأمثل لخلية مصفوفة التصاق والبقاء والتمايز. في الآونة الأخيرة، كما تم الإبلاغ عن طريقة مماثلة لتوجيه التمايز كبدي من hESCs micropatterning باستخدام بولي (ميتاكريليت الميثيل) (PMMA) صفائف الاستنسل الدقيقة 16.

الإستنسل خلية يمكن أن تكون ملفقة من مواد مختلفة، بما في ذلك التقى المرض 20،21، بولي (ف xylylene) البوليمرات 22،23، PMMA 16 و الأكثر شيوعا، PDMS 24-28. السيليكون وبولي (ف xylylene) البوليمرات الإستنسل تتطلب الحفر المباشر للمن خلال ثقوب مع المعدات المتخصصة 20-23، الأمر الذي يحد من إمكانية الوصول إليها للمستخدمين البيولوجي. PDMS الإستنسل يمكن أن تكون ملفقة من قبل وسائل مختلفة اعتمادا على حجم الميزة المطلوبة، والتي تتراوح عادة من 3 ميكرون إلى 2000 ميكرومتر 11،26-29. وإذا رغبت الميزات الصغيرة، وصحائف بالستينسيل رقيقة يمكن أن تنتج من قبل الصحافة صب PDMS قبل البوليمر على قالب السيليكون microfabricated تحتوي على نقوش من micropatterns 28. لميزات> 1000 ميكرون، ويوفر قاطع ليزر CO 2 وسيلة سهلة ومنخفضة التكاليف لخفض مباشرة أنماط على ورقة PDMS محمل مسبقا خلال تلفيق الاستنسل. وإعادة التدوير من الإستنسل PDMS أيضا يجعلها فعالة من حيث التكلفة لإجراء سلسلة من التجارب بما يكفي من الاتساق.

الحمار = "jove_content"> هنا، نقدم منهجية مفصلة لصنع الاستنسل PDMS مع 1000 ميكرون الميزات بواسطة القطع بالليزر وتوليد micropatterns HESC. واستخدمت هذه micropatterns HESC لتعديل مدى إنتغرين وE-كادهيرين بوساطة التصاقات داخل مستعمرة HESC متماسكة وذلك لمعرفة كيف أدى الاستقطاب المكاني للالتصاق الخلايا في خلية مصير التجانس 10.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يصف هذا البروتوكول تلفيق PDMS الاستنسل مع 1000 ميكرون أنماط بواسطة الليزر لعدة قطاعات وmicropatterning خط HESC، H9 باستخدام الاستنسل PDMS.

1. تصميم وتصنيع PDMS استنسل لMicropatterning

  1. تصميم ورقة بالستينسيل مع الثقوب عن طريق للهندسة والحجم المطلوبين (على سبيل المثال، 1000 ميكرون الدوائر) وحشية الاستنسل باستخدام التصميم بمساعدة الكمبيوتر برنامج 10.
  2. الليزر قطع ورقة بالستينسيل وحشية على 120-150 ميكرون و 2 ملم ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان سميكة (PDMS) ورقة على التوالي يستخدم CO 2 الليزر القاطع 10.
  3. السندات طوقا PDMS مع ورقة الاستنسل PDMS باستخدام PDMS غير مخمر السائلة وتخبز في 60 درجة مئوية لمدة 3-4 ساعة للحصول على الاستنسل PDMS لmicropatterning.
  4. تعقيم الاستنسل PDMS قبل التعقيم عند 120 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة والتجفيف في الفرن قبل استعماله.

2. hESCs الرئيسيةtenance

  1. ثقافة خطوط HESC في وسط صيانة مجانية المغذية في 1 × الغشاء القاعدي مصفوفة المغلفة لوحات زراعة الخلايا HESC المؤهلين عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
  2. تمرير hESCs عندما يكونون حوالي 70٪ متموجة قبل 3 دقائق الحضانة عند 37 درجة مئوية مع dispase العلاج وعدم الربط ميكانيكيا المستعمرات HESC إلى 100-200 ميكرون كتل. لوحة كتل hESCs في مناطق ذات كثافة من 30-50 كتل في 9.6 سم 2 من مساحة النمو على الغشاء القاعدي المغلفة مصفوفة الأنسجة البوليسترين الثقافة في نسبة 1: 6 تقسيم.

3. استنسل Micropatterning من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

  1. قبل إعداد الخلية الزخرفة
    1. ختم استنسل PDMS على 60 مم طبق بيتري من قبل الاستغناء عن 700 ميكرولتر 70٪ من الإيثانول الصف التحليلي في الماء عالى النقاء في طبق بتري ووضع الاستنسل على القمة.
    2. وضع طبق بتري داخل مجلس الوزراء السلامة البيولوجية بين عشية وضحاها للسماح رانه الايثانول الجاف.
    3. تحقق أي فقاعة موجودة تحت الاستنسل لضمان الاستنسل يشكل ختم جيدة مع طبق بيتري. هذا يمنع تسرب ECM حل الطلاء. ختم طبق بيتري وتخزينها تحت ظروف معقمة حتى انها مستعدة للتلقيح الخلية.
    4. إعداد aliquots من-HESC المؤهلين الغشاء القاعدي المصفوفة وفقا لشهادة التحليل. تأكد من أن كل قسامة عوائد 1 ×-HESC المؤهلين الغشاء القاعدي حل مصفوفة عندما تضعف في 25 مل من Dulbecco لتعديل النسر متوسطة: خليط المغذيات F-12 (DMEM / F12) وفقا لصحيفة المنتجات المصنعة.
    5. إعداد الحل ECM الطلاء عن طريق إضافة قسامة واحدة من بين HESC المؤهلين الغشاء القاعدي المصفوفة إلى 16.7 مل من DMEM / F12 لجعل 1.5 ×-HESC المؤهلين الغشاء القاعدي حل المصفوفة. الحفاظ على كل ما الحل ECM طلاء على الجليد لمنع دبق.
    6. تكملة HESC المتوسطة الصيانة مع 10 ميكرومتر ROCK المانع (Y27632).
  2. طلاء ECM على الركيزة رسمت
    1. علاج طبق بيتري مع 100 WO 2 البلازما لمدة 90 ثانية. لضمان العقم، فقط فتح غطاء طبق بتري داخل غرفة البلازما قبل العلاج البلازما، وبسرعة الغطاء الخلفي طبق بيتري بعد الانتهاء من العلاج. هذا يسهل ترطيب سطح ويمنع تشكيل فقاعة الهواء في micropattern من خلال ثقوب خلال إضافة ECM حل الطلاء.
    2. إضافة 450 ميكرولتر من 1.5 × حل الغشاء القاعدي مصفوفة HESC المؤهلين لتغطية الاستنسل كله. ختم طبق بيتري مع فيلم قابل للغلق النفس، مثل بارافيلم، لمنع الحل من الجفاف، واحتضان لمدة 5 ساعة على 37 درجة مئوية قبل الاستخدام.
  3. hESCs بذر على الركيزة رسمت
    1. دراسة المستعمرات HESC في لوحة 6 جيدا لتحديد مجالات خلية متمايزة تبين فقدان التشكل HESC نموذجي (على سبيل المثال، وفقدان مدورة، بإحكام Packe ود التشكل الظهارية، وارتفاع نسبة نواة / السيتوبلازم مع نويات بارزة). إزالة مناطق متباينة باستخدام الشافطة فراغ.
    2. يغسل مرتين مع 2 مل DMEM / F12 لكل بئر.
    3. إضافة 1 مل من الانزيمات الهاضمة، مثل Accutase، لكل بئر من لوحة 6 جيدا واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 8 دقائق. اضغط على لوحة بلطف لفصل جميع المستعمرات من الركيزة.
    4. شطف كل جيدا مع لا يقل عن 4 مل من DMEM / F12 لكل 1 مل من الانزيمات الهاضمة وجمع تعليق خلية في أنبوب مخروطي 15 مل.
    5. الطرد المركزي تعليق خلية في 200 × ز لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
    6. نضح لإزالة طاف وإضافة 400 ميكرولتر من المتوسطة صيانة HESC تستكمل مع ROCK المانع (ROCKi) لاعادة تعليق الخلايا. ماصة تعليق الخلية صعودا وهبوطا 3 مرات بلطف لكسر كتل داخل الخلايا واحدة.
    7. مزيج واحد كذلك التعليق الخلية وتمييع 10 ميكرولتر من عينات الخلايا في 190 ميكرولتر من DMEM / F12 (01:20 تمييع). استخدام hemocytomeثالثا لتحديد كثافة الخلايا في تعليق خلية الأسهم.
    8. حساب كثافة الخلية البذر اللازمة لاستنسل معين.
      ملاحظة: على سبيل المثال، قمنا تجريبيا كثافة الخلية البذر للحصول على أحادي الطبقة متموجة من الخلايا وحيدة هي حوالي 4444 خلية / ملم 2. وبالتالي، فإن الاستنسل بمساحة 450 مم 2 وحجم البذر من 400 ميكرولتر تتطلب تعليق الخلية لتكون في مناطق ذات كثافة من 2 مليون خلية / 400 ميكرولتر.
    9. تمييع تعليق خلية الأسهم إلى كثافة بذر المطلوبة (راجع الخطوة 3.3.8 ملاحظة) مع مستنبت HESC تستكمل مع ROCKi.
    10. إضافة حجم معين من تعليق الخلية التي تحتوي على العدد المطلوب من الخلايا في كل الاستنسل وترك طبق بيتري دون عائق في غطاء محرك السيارة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للخلايا ليستقر.
    11. نقل طبق بيتري في الحاضنة واحتضان لمدة 1 ساعة للسماح لمرفق الخلية. العناية للحفاظ على مستوى طبق بتري خلالنقل عملية بحيث تبقى الخلايا كما أحادي الطبقة في الاستنسل.
  4. إزالة الاستنسل والتخميل من الركيزة unpatterned
    1. دراسة طبق بيتري تحت المجهر لمعرفة ما اذا كان يتم إرفاق الخلايا بشكل صحيح على الركيزة الأساسية.
    2. نضح بعيدا تعليق خلية من الاستنسل.
    3. إضافة 2 مل / طبق من 0.5٪ ثقافة الخلية متوافق السطحي غير الأيونية في DMEM / F12 إلى المنطقة المحيطة الاستنسل.
    4. استخدام زوج من ملقط تعقيمها لتقشر بلطف الاستنسل. دوامة الحل السطحي غير الأيونية حول ما هو مقشر الاستنسل قبالة لمنع الخلايا من الجفاف. بصريا مراقبة خلايا micropatterned في طبق بيتري.
    5. احتضان خلايا micropatterned في 0.5٪ غير الأيونية حل السطحي-DMEM / F12 لمدة 10 دقيقة عند 37 درجة مئوية.
    6. نضح بعيدا غير الأيونية بالسطح-DMEM / F12 الحل. يغسل 3 مرات مع 2 مل / طبق من DMEM / F12.
    7. إضافة 2 مل / طبق من HESCمتوسطة صيانة تستكمل مع ROCKi واحتضان عند 37 درجة مئوية خلال الليل.
    8. بعد مرور فترة الحضانة بين عشية وضحاها، نضح HESC المتوسطة صيانة تستكمل مع ROCKi، ويغسل مرة واحدة مع DMEM / F12 وحمل mesoendoderm التمايز بإضافة 2 مل / طبق من متوسطة التمايز تستكمل مع 100 نانوغرام / مل Activin، 25 نانوغرام / مل BMP4 و 10 نانوغرام / FGF2 مل .
    9. تقييم micropatterns باستخدام النقيض من المرحلة التصوير وحساب متوسط ​​ملامح كثافة براتشيوري (T) لكل نمط كما هو موضح سابقا 8.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الورقة، ونحن تصف تصنيع استنسل خلية باستخدام الليزر القاطع لتوليد 1000 ميكرون الميزات. وتألفت الاستنسل من 2 أجزاء: ورقة بالستينسيل رقيقة (حوالي 100-200 ميكرون سميكة) تحتوي على micropattern من خلال الثقوب، وطوقا PDMS لاحتواء حل ECM طلاء أو تعليق خلية. هنا، تم استخدام 127 ميكرون و 2 مم صحائف PDMS المتاحة تجاريا باسم ورقة بالستينسيل وحشية على التوالي. طرق أخرى لإعداد ورقة PDMS من سماكة يمكن السيطرة عليها، مثل تدور طلاء، ويمكن أيضا أن تستخدم لتصن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تصنيع الإستنسل micropatterning

يوفر micropatterning الاستنسل الأسلوب الأمثل لتوليد micropatterns hPSC للتحقيق بوساطة المتخصصة التمايز الزخرفة. إن الميزة الأساسية لتنميط الاستنسل على تقنيات micropatterning أخرى، مثل microcontact الطباعة وphotopatterning، هو أنه لا يتطلب تعديل السطح ويمكن تنفيذها على ركائز برامج التعاون الفني التقليدية. لذلك، وسائل الإعلام ثقافة الأمثل والطلاء ECM لخطوط hP...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الكتاب ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويدعم هذا العمل من قبل جامعة سنغافورة الوطنية بدء التشغيل منحة (R-397-000-192-133) وصندوق الفجوة ETPL (R-397-000-198-592). ع هو عالم أبحاث جامعة سنغافورة الوطنية. سيكون الكتاب أود أن أشكر الدكتور Jiangwa شينغ لها الدعم الفني على micropatterning الخلية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
  2 مم سميكة PDMS ورقةالمتخصصة في منتجات السيليكون ، الولايات المتحدة الأمريكيةSSPM823-.005تستخدم لتشكيل خزان للاستنسل
120-150 & mu ؛ م سميكة ورقة PDMSالمتخصصة سيليكون المنتجات Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكيةSSPM823-.040تستخدم لتشكيل الاستنسل   ؛
60 مم طبق بتريNunc Nunclon دلتا150326الركيزة للنمذجة الدقيقة
AccutaseAccutase ، Merck Millipore ، إنزيم سنغافورةSCR005لكسر خلايا H9 إلى خلايا مفردة
Activin & nbsp ؛  R & D Systems ، سنغافورة338-AC-010عامل النمو لتمايز H9
BMP4 & nbsp ؛R & D Systems ، سنغافورة338-BP-010عامل النمو لنظام البلازما التمايز H9
  ؛علم الفيمتو ، كورياCUTE-MPلأكسدة البلازما من الاستنسل
DispaseStemCell & trade ؛ تقنيات ، إنزيم سنغافورة7923يستخدم لإضعاف التصاق الخلية ECM أثناء المرور
DMEM / F12GIBCO ، الولايات المتحدةالأمريكية 11330032الوسط القاعدي لخلايا H9
FGF2R & D Systems ، سنغافورة233 &ndash ؛ FB– 025عامل النمو لتمايز H9
خط خلية H9WiCell Research Institute، Inc. ، الولايات المتحدة الأمريكيةWA09الخلايا الجذعية الجنينية البشرية
المصفوفة الغشاء القاعدي المؤهلة من hESCMatrigel ، BD Biosciences ، سنغافورة354277طلاء مصفوفة خارج الخلية لدعم نمو خلايا H9
المجهر المقلوبLeica Microsystems ، سنغافورةDMi1لالتقاط المجال الساطع صور
القاطع بالليزرEpilog Helix 24 نظاميستخدم لتوليد الثقوب في ورقة PDMS
mTeSR& 1 متوسط StemCell & التجارة ؛ Technologies, Singapore5850Maintainence medium for H9 cells
PDMS SYLGARD & reg; 184 ، شركة داو كورنينج ، الولايات المتحدة الأمريكية3097358-1004تستخدم للصق استنسل PDMS والاحتياطية
ROCKi Y27632Calbiochem ، Merck Millipore ، سنغافورة688000يحافظ على خلايا H9 كخلايا مفردة   ؛
STEMdiff < سوب > & التجارة ؛ < / sup> APEL& < / sup> متوسطة StemCell & التجارة ؛ Technologies, Singapore5210وسيط التمايز لخلايا H9
فيلم البولي إيثيلين تيريفثاليتSureMark SingaporeSQ-6633يستخدم لتشكيل الاستنسل  
خافض للتوتر السطحي غير أيوني متوافق مع زراعة الخلاياحمض البلورونيك F-127 ، سيجما ، سنغافورةP2443كاشف تخميل لصد التصاق الخلايا في ركائز غير منقوشة مجهرية
الليزر

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Graf, T., Stadtfeld, M. Heterogeneity of embryonic and adult stem cells. Cell Stem Cell. 3 (5), 480-483 (2008).
  2. Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
  3. Guilak, F., Cohen, D. M., Estes, B. T., Gimble, J. M., Liedtke, W., Chen, C. S. Control of stem cell fate by physical interactions with the extracellular matrix. Cell Stem Cell. 5 (1), 17-26 (2009).
  4. Dalby, M. J., Gadegaard, N., Oreffo, R. O. Harnessing nanotopography and integrin-matrix interactions to influence stem cell fate. Nat Mater. 13 (6), 558-569 (2014).
  5. Joddar, B., Ito, Y. Artificial niche substrates for embryonic and induced pluripotent stem cell cultures. J Biotechnol. 168 (2), 218-228 (2013).
  6. Warmflash, A., Sorre, B., Etoc, F., Siggia, E. D., Brivanlou, A. H. A method to recapitulate early embryonic spatial patterning in human embryonic stem cells. Nat Methods. 11 (8), 847-854 (2014).
  7. Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
  8. Lee, L. H., Peerani, R., Ungrin, M., Joshi, C., Kumacheva, E., Zandstra, P. Micropatterning of human embryonic stem cells dissects the mesoderm and endoderm lineages. Stem Cell Res. 2 (2), 155-162 (2009).
  9. Hwang, Y. S., Chung, B. G., Ortmann, D., Hattori, N., Moeller, H. C., Khademhosseini, A. Microwell-mediated control of embryoid body size regulates embryonic stem cell fate via differential expression of WNT5a and WNT11. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (40), 16978-16983 (2009).
  10. Toh, Y. C., Xing, J., Yu, H. Modulation of integrin and E-cadherin-mediated adhesions to spatially control heterogeneity in human pluripotent stem cell differentiation. Biomaterials. 50 (0), 87-97 (2015).
  11. Xing, J., Toh, Y. C., Xu, S., Yu, H. A method for human teratogen detection by geometrically confined cell differentiation and migration. Sci Rep. 5, 10038(2015).
  12. Falconnet, D., Csucs, G., Grandin, H. M., Textor, M. Surface engineering approaches to micropattern surfaces for cell-based assays. Biomaterials. 27 (16), 3044-3063 (2006).
  13. Bauwens, C. L., et al. Control of human embryonic stem cell colony and aggregate size heterogeneity influences differentiation trajectories. Stem Cells. 26 (9), 2300-2310 (2008).
  14. Khademhosseini, A., et al. Co-culture of human embryonic stem cells with murine embryonic fibroblasts on microwell-patterned substrates. Biomaterials. 27 (36), 5968-5977 (2006).
  15. Mohr, J. C., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. 3-D microwell culture of human embryonic stem cells. Biomaterials. 27 (36), 6032-6042 (2006).
  16. Yao, R., et al. Hepatic differentiation of human embryonic stem cells as microscaled multilayered colonies leading to enhanced homogeneity and maturation. Small. 10 (21), 4311-4323 (2014).
  17. Mei, Y., et al. Combinatorial development of biomaterials for clonal growth of human pluripotent stem cells. Nat Mater. 9 (9), 768-778 (2010).
  18. Melkoumian, Z., et al. Synthetic peptide-acrylate surfaces for long-term self-renewal and cardiomyocyte differentiation of human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 28 (6), 606-610 (2010).
  19. Evans, N. D., et al. Substrate stiffness affects early differentiation events in embryonic stem cells. Eur Cell Mater. 18, 1-13 (2009).
  20. Carter, S. B. Haptotactic islands: a method of confining single cells to study individual cell reactions and clone formation. Exp Cell Res. 48 (1), 189-193 (1967).
  21. Jimbo, Y., Robinson, H. P., Kawana, A. Simultaneous measurement of intracellular calcium and electrical activity from patterned neural networks in culture. IEEE Trans Biomed Eng. 40 (8), 804-810 (1993).
  22. Wright, D., et al. Reusable, reversibly sealable parylene membranes for cell and protein patterning. J Biomed Mater Res. A. 85 (2), 530-538 (2008).
  23. Jinno, S., et al. Microfabricated multilayer parylene-C stencils for the generation of patterned dynamic co-cultures. J Biomed Mater Res A. 86 (1), 278-288 (2008).
  24. Jackman, R. J., Duffy, D. C., Cherniavskaya, O., Whitesides, G. M. Using elastomeric membranes as dry resists and for dry lift-off. Langmuir. 15 (8), 2973-2984 (1999).
  25. Folch, A., Jo, B. H., Hurtado, O., Beebe, D. J., Toner, M. Microfabricated elastomeric stencils for micropatterning cell cultures. J Biomed Mater Res. 52 (2), 346-353 (2000).
  26. Park, J., et al. Microfabrication-based modulation of embryonic stem cell differentiation. Lab Chip. 7 (8), 1018-1028 (2007).
  27. Choi, J. H., Lee, H., Jin, H. K., Bae, J. S., Kim, G. M. Micropatterning of neural stem cells and Purkinje neurons using a polydimethylsiloxane (PDMS) stencil. Lab Chip. 12 (23), 5045-5050 (2012).
  28. Li, W., et al. NeuroArray: a universal interface for patterning and interrogating neural circuitry with single cell resolution. Sci Rep. 4, 4784(2014).
  29. Guvanasen, G. S., Mancini, M. L., Calhoun, W. A., Rajaraman, S., DeWeerth, S. P. Polydimethylsiloxane Microstencils Molded on 3-D-Printed Templates. J Microelectromech S. 23 (5), 1045-1053 (2014).
  30. Palchesko, R. N., Zhang, L., Sun, Y., Feinberg, A. W. Development of polydimethylsiloxane substrates with tunable elastic modulus to study cell mechanobiology in muscle and nerve. PLoS One. 7 (12), 51499(2012).
  31. Chowdhury, F., et al. Material properties of the cell dictate stress-induced spreading and differentiation in embryonic stem cells. Nat Mater. 9 (1), 82-88 (2010).
  32. Gjorevski, N., Boghaert, E., Nelson, C. M. Regulation of Epithelial-Mesenchymal Transition by Transmission of Mechanical Stress through Epithelial Tissues. Cancer Microenviron. 5 (1), 29-38 (2012).
  33. Thery, M. Micropatterning as a tool to decipher cell morphogenesis and functions. J Cell Sci. 123, (Pt 24) 4201-4213 (2010).
  34. Eroshenko, N., Ramachandran, R., Yadavalli, V. K., Rao, R. R. Effect of substrate stiffness on early human embryonic stem cell differentiation. J Biol Eng. 7 (1), 7(2013).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PDMS

مقالات ذات صلة