مقالة منهجية

وسيلة فعالة للحصول على خلايا Dedifferentiated الدهون

DOI:

10.3791/54177

⸱

يوليو 15, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Division of Cell Regeneration and Transplantation, School of Medicine, Nihon University

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد قمنا بتعديل شروط توليد خلايا DFAT ونقدم هنا معلومات تتعلق باستخدام وسيط نمو محسن لإنتاج هذه الخلايا.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هندسة الأنسجة والعلاج بالخلايا على وعود كبيرة سريريا. في هذا الصدد، وخلايا متعددة القدرات، مثل الخلايا الجذعية الوسيطة (اللجان الدائمة)، ويمكن استخدام العلاجي، في المستقبل القريب، لاستعادة وظيفة لأعضاء تالفة. ومع ذلك، العديد من القضايا الفنية، بما في ذلك إجراء الغازية للغاية من عزل اللجان الدائمة وعدم الكفاءة المحيطة التضخيم، وتعيق حاليا استخدام السريرية المحتملة لهذه الطرائق العلاجية. هنا، ونحن نقدم طريقة فعالة للغاية لتوليد الخلايا الدهنية dedifferentiated (DFAT)، وخلايا لجنة السلامة البحرية الشبيهة. ومن المثير للاهتمام، وخلايا DFAT يمكن التفريق إلى عدة أنواع الخلايا بما في ذلك مكون الشحم، عظمية، والخلايا المولدة للغضروف. على الرغم من أن مجموعات أخرى قد قدمت سابقا أساليب مختلفة لتوليد خلايا DFAT من الأنسجة الدهنية ناضجة، يسمح لدينا وسيلة لنا لإنتاج خلايا DFAT أكثر كفاءة. وفي هذا الصدد، علينا أن نبرهن على ثقافة DFAT المتوسطة (DCM)، تستكمل مع 20٪ FBS،هو أكثر فعالية في توليد خلايا DFAT من DMEM، على أن تستكمل مع FBS 20٪. بالإضافة إلى ذلك، فإن الخلايا DFAT التي تنتجها طريقة لدينا ثقافة الخلية يمكن redifferentiated إلى عدة أنواع الأنسجة. على هذا النحو، وقدم نموذجا مثيرة جدا للاهتمام ومفيدة للدراسة فقد التمايز الأنسجة.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

العلاج بالخلايا وهندسة الأنسجة هي المواضيع الساخنة في مجال الطب التجديدي 1-5. في حين أن هذه الطرائق العلاجية على وعود كبيرة، العديد من القضايا الفنية تعرقل حاليا استخدام السريري. في هذا الصدد، كما هو الحال في توليد خلايا الجذع، يجب على جميع العلاجات هندسة الأنسجة تنتج خلايا خالية من transductions الجين الخارجية من أجل الحفاظ على سلامة المرضى. وفقا لذلك، كنا المجموعة الأولى لإنتاج خلايا DFAT الإنسان 6 بنجاح. وقد تبنت عدة مجموعات بحثية أخرى منذ أسلوبنا على توليد خلايا DFAT من أصل الثدييات 7-9، إلقاء مزيد من الضوء على فائدة نموذجنا.

على مدى العديد من الدراسات، وجدنا أن نوعية البيئة زراعة الخلايا يمكن تعديلها عن طريق ضبط محتوى المتوسطة الخلية. وقد أدى هذا الاكتشاف إلى زيادة في معدل النجاح من إنتاج خلايا DFAT وتحسنت نوعية الخلية؛ كل من العوامل الحاسمة فيتوليد كفاءة الخلايا للتجارب السريرية في المستقبل. في هذا الصدد، وتحسين DFAT الثقافة المتوسطة (DCM، وسيلة مماثلة لالجذعية الوسيطة المتوسطة الخلية، والتي تحتوي على الانسولين المؤتلف البشري، الزلال في الدم، وحمض-L الجلوتاميك، والعديد من الأحماض الدهنية، والكولسترول) وطريقة لتوليد الخلايا DFAT و وقد وضعت انتشار (للمزيد من المعلومات عن محتويات DCM متاحة عند الطلب). تم إنشاء استخدام هذا الأسلوب جودة عالية خلايا DFAT مع القدرة على التمايز إلى عدة أنواع الخلايا بما في ذلك مكون الشحم، عظمية، والخلايا المولدة للغضروف. وإجمالا، هذا البروتوكول زراعة الخلايا التحقق من صحة يحسن نوعية الخلايا DFAT وقد تكون مفيدة للغاية لتعزيز التطبيقات السريرية لعلاج الخلايا وهندسة الأنسجة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وقد تم الحصول على عينات من الدهون تحت الجلد البشري من المرضى الذين يخضعون لجراحة في أقسام جراحة التجميل، جراحة المسالك البولية، جراحة الأطفال وجراحة العظام في مستشفى إيتاباشي جامعة نيهون (طوكيو، اليابان). المرضى أعطى موافقة خطية مطلعة، وافقت لجنة الأخلاقيات من جامعة نيهون كلية الطب الدراسة.

1. نسيج التحضير

  1. جلب عينات الأنسجة من غرفة العمليات إلى المختبر.
  2. غسل 1-2 غرام من الأنسجة الدهنية مع 5 مل من برنامج تلفزيوني (-) في درجة حرارة الغرفة (RT) مرة واحدة، في أنبوب 50 مل ثم وضع العينة في طبق من البلاستيك 10 سم.

2. كولاجيناز الهضم

  1. إزالة عينة من برنامج تلفزيوني (-)، ثم إضافة 10 مل من معقم 0.1٪ (ث / ت) حل كولاجيناز (كولاجيناز النوع الثاني) إلى الطبق الذي يحتوي على عينة الأنسجة.
  2. اللحم المفروم مع النسيج المقص الجراحي لحوالي 15 دقيقة، حتى تصل إلى المهروس تتألفency.
  3. وفي وقت لاحق، هضم الأنسجة المفروم في 0.1٪ (ث / ت) حل كولاجيناز عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة (60 دورة في الدقيقة) في أنبوب 50 مل مع الإثارة لطيف على شاكر.
  4. تصفية العينة هضمها من خلال مرشح 100 ميكرومتر في أنبوب 50 مل. بعد ذلك، تمرير 10 مل من DCM (انظر الجدول المواد) تستكمل مع 2٪ FBS من خلال مرشح.

عزل 3. خلية

  1. الطرد المركزي الخلايا التي تمت تصفيتها في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.
  2. في هذه المرحلة، وإعداد 5 مل من DCM تستكمل مع 2٪ FBS في أنبوب 50 مل.
  3. بعد ذلك، وضع الخلايا الدهنية العائمة باستخدام ماصة ميكرولتر 1000 وإضافة الخلايا إلى 50 مل أنبوب يحتوي المتوسطة.
  4. وفي وقت لاحق، هز أنبوب 50 مل بلطف لمزج المتوسطة DCM مع الخلايا.
  5. ثم، الطرد المركزي الأنبوب في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.
  6. تجاهل المتوسطة في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام 18 G إبرة وحقنة 20 مل.
  7. المقبل، إضافة 10 مل من DCM الصورةupplemented مع 2٪ FBS إلى الخلايا التي تم جمعها.
  8. خلط DCM مع الخلايا عن طريق هز أنبوب 50 مل بلطف.
  9. أنبوب الطرد المركزي في 100 x ج لمدة 1 دقيقة في RT.

4. خلايا التصفيحات

  1. إضافة 41 مل من DCM أو DMEM تستكمل مع FBS 20٪ إلى 12.5 سم قارورة.
  2. بعد ذلك، باستخدام ماصة 200 ميكرولتر إضافة 40 ميكرولتر من الخلايا الدهنية إلى القارورة.
  3. ثم، تملأ القارورة مع DCM أو DMEM تستكمل مع FBS 20٪. خطوة حاسمة: عند هذه النقطة، وضمان أن الخلايا تنتشر في جميع أنحاء المتوسط. بصريا فحص خلايا منفصلة، ​​وبعد ذلك الحفاظ على قارورة على غطاء طبق بتري مستديرة للحفاظ على انها مسطحة.
  4. وأخيرا، ضع قارورة داخل الحاضنة وترك الأمر دون عائق في 5٪ CO 2 حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 7 أيام.
  5. بعد أسبوع من الحضانة، عكس القارورة والتحقق من وجود خلايا DFAT. بعد ذلك، تقييم DFAT جيل خلية الكفاءة كما هو موضح 10 منذ في هذا fibrobl نقطةوتقع خلايا مثل AST (خلايا DFAT) في مناطق مختلفة من الخلايا الدهنية.
  6. تستكمل إضافة 5 مل من DCM أو DMEM مع FBS 20٪ إلى قارورة بعد إزالة خلية ثقافة المتوسط ​​السابق. السماح للخلايا DFAT لتنمو لمدة أسبوع آخر بعد تغيير المتوسطة.
  7. باستخدام عداد الخلية، وحساب عدد الخلايا DFAT ولدت في ظل ظروف مختلفة الثقافة الخلية (DCM مقابل DMEM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في هذه الدراسة، تم تحسين طريقة وأدوات لتوليد الخلايا DFAT (الشكل 1). لدينا وسيلة تسمح لنا لتوليد خلايا DFAT باستخدام كل DCM والمتوسطة DMEM تحتوي على 20٪ FBS (الشكل 2A). على هذا النحو، قارنا كفاءة DCM وDMEM في توليد خلايا DFAT. في هذا الصدد، وتعزيز DCM خلية DFAT انتشار من قبل ثلاث مرات بالمقارنة مع DMEM، بغض النظر عن عدد الخلايا الشحمية (الشكل 2A وباء). باستخدام 20٪ أيضا يعزز FBS نم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الخلايا الشحمية الناضجة التي تخضع لها فقد التمايز في المختبر، وهي عملية تعرف باسم الثقافة السقف، قد العودة إلى النمط الظاهري أكثر بدائية واكتساب قدرات التكاثري. ويشار إلى هذه الخلايا إلى خلايا الدهون كما dedifferentiated (DFAT). تم تقييم إمكانات multilineage تمايز الخلايا DFAT. التدفق الخلوي وكشف تحليل وتحليل التعبير الجيني أن الخلايا DFAT كانت متجانسة إلى حد كبير بالمقارنة مع مخولا لصيانة طائرات (6). في الواقع، والوضع مستضد على سطح الخلية من خلايا DFA...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا البحث جزئيا من خلال برنامج إنشاء الشركات الناشئة من البحث والتكنولوجيا المتقدمة (برنامج ستارت) من الجمعية اليابانية لتعزيز العلوم (ST261006IP ، TM) وبرنامج مؤسسة البحوث الاستراتيجية في الجامعات الخاصة (2014-2019) (S1411018 ، TM) من وزارة التعليم والرياضة والعلوم والتكنولوجيا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
CSTI303-MSC medium CSTI87-671يتم تعريف هذا الوسيط على أنه DCM في النص
PBS (-)Wako166-23555لا يحتوي على Mg2 + < / sup> و Ca2 + < / sup>
DMEM mediumGibco11965-092
مصل الأبقار الجنينيسيجما172012
الكولاجيناز النوع الثانيمقص
تاكاساجو الصناعة الطبية المحدودةTKZ-F2194-1
شاكرTAITECBioshaker V.BR-36
Falcon Cell Strainer 100 & mu ؛ م الأصفركورنينج علوم الحياة DL 352360
فالكون 12.5 سم ² ؛ قارورة ثقافة الخلايا ذات الرقبة المستطيلة مع غطاء برغي أزرق التهويةCORNING LIFE SCIENCES 353107
18 جرام إبرةNIPRO02-002
20 مل حقنة نيبرو08-753
Z سلسلة كولتر كاونترBECKMAN COULTER383550
سيجما C-6885

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lanzoni, G., et al. Concise review: clinical programs of stem cell therapies for liver and pancreas. Stem Cells. 31 (10), 2047-2060 (2013).
  2. de Girolamo, L., et al. Mesenchymal stem/stromal cells: a new "cells as drugs" paradigm. Efficacy and critical aspects in cell therapy. Curr. Pharm. Des. 19 (13), 2459-2473 (2013).
  3. Lindroos, B., Suuronen, R., Miettinen, S. The potential of adipose stem cells in regenerative medicine. Stem Cell. Rev. 7 (2), 269-291 (2011).
  4. Yan, J., Tie, G., Xu, T. Y., Cecchini, K., Messina, L. M. Mesenchymal stem cells as a treatment for peripheral arterial disease: current status and potential impact of type II diabetes on their therapeutic efficacy. Stem Cell. Rev. 9 (3), 360-372 (2013).
  5. Ringden, O., Keating, A. Mesenchymal stromal cells as treatment for chronic GVHD. Bone Marrow Transplant. 46 (2), 163-164 (2011).
  6. Matsumoto, T., et al. Mature adipocyte-derived dedifferentiated fat cells exhibit multilineage potential. J. Cell. Physiol. 215 (1), 210-222 (2008).
  7. Lessard, J., et al. Generation of human adipose stem cells through dedifferentiation of mature adipocytes in ceiling cultures. J. Vis. Exp. (97), (2015).
  8. Lessard, J., et al. Characterization of dedifferentiating human mature adipocytes from the visceral and subcutaneous fat compartments: fibroblast-activation protein alpha and dipeptidyl peptidase 4 as major components of matrix remodeling. PLoS One. 10 (3), 0122065(2015).
  9. Peng, X., et al. Phenotypic and Functional Properties of Porcine Dedifferentiated Fat Cells during the Long-Term Culture In Vitro. Biomed. Res. Int. 2015, 673651(2015).
  10. Kono, S., Kazama, T., Kano, K., Harada, K., Uechi, M., Matsumoto, T. Phenotypic and functional properties of feline dedifferentiated fat cells and adipose-derived stem cells. Vet. J. 199 (1), 88-96 (2014).
  11. Bellin, M., Marchetto, M. C., Gage, F. H., Mummery, C. L. Induced pluripotent stem cells: the new patient. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (11), 713-726 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

DFAT DCM

مقالات ذات صلة