يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية

14.7K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54256

⸱

سبتمبر 20, 2016

 , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

في هذه المقالة

ملخص

في هذه المخطوطة ، نصف بروتوكولا لفحص النسخ وظيفيا والنشاط المثبط للعوامل المضادة للبكتيريا التي تستهدف النسخ البكتيري.

الملخص

في المختبر وتم وضع المقايسات النسخ وتستخدم على نطاق واسع لسنوات عديدة لدراسة الآليات الجزيئية تشارك في النسخ. وتتطلب هذه العملية متعددة فرعية تعتمد على الحمض النووي RNA البلمرة (RNAP) ومجموعة من عوامل النسخ التي تعمل على تعديل نشاط RNAP خلال التعبير الجيني. ويستخدم هلام التسلسل الكهربائي من النصوص رديولبلد لتوفير المعلومات الآلية مفصلة حول كيفية عائدات النسخ، وما هي مواصفات يمكن أن تؤثر عليه. في هذه الورقة وصفنا بروتوكول لدراسة كيفية عامل استطالة ضروري نوسا ينظم التوقف النسخي، وكذلك وسيلة للتعرف على مادة مضادة للبكتريا التي تستهدف بدء النسخ من خلال تثبيط RNAP تشكيل عميم الإنزيم. هذه الأساليب يمكن أن تستخدم كمنصة لتطوير مناهج إضافية لاستكشاف آلية العمل من عوامل النسخ التي ما زالت تزال غير واضحة، وكذلك آجا المضادة للبكتيريا جديدةنهاية الخبر تستهدف النسخ وهو الهدف المخدرات غير مستخدمة بالقدر الكافي في البحث والتطوير للمضادات الحيوية.

المقدمة

النسخ هو العملية التي يتم توليفها من الحمض النووي الريبي DNA قالب معين. في الخلايا حقيقية النواة هناك ثلاثة RNAPs متميزة: RNAP أنا المحاضر السلائف الريباسي، RNAP الثاني هو المسؤول عن تخليق مرنا وبعض الرنا نووية صغيرة، ويتم تنفيذ تركيب 5S الريباسي والحمض الريبي النووي النقال من قبل RNAP الثالث. في البكتيريا، لا يوجد سوى RNAP واحدة مسؤولة عن نسخ من جميع الطبقات من الحمض النووي الريبي. هناك ثلاث مراحل النسخ: بدء، واستطالة وإنهاء الخدمة. النسخ هي واحدة من العمليات الأكثر ينظم غاية في الخلية. كل مرحلة من مراحل دورة النسخ تمثل نقطة تفتيش لتنظيم التعبير الجيني 1. لبدء، RNAP أن اقترانه عامل سيغما لتشكيل عميم الإنزيم، وهو مطلوب لتوجيه الإنزيم إلى مواقع معينة تسمى المروجين 2 لتشكيل مجمع المروج مفتوحة. وفي وقت لاحق، مجموعة كبيرة من عوامل النسخ هي المسؤولة عن تنظيم سالأنشطة و RNAP خلال استطالة وإنهاء مراحل. عامل النسخ فحص هنا هو البروتين الحفظ جدا وأساسي، نوسا. وتشارك في تنظيم التوقف النسخ وإنهاء الخدمة، وكذلك مكافحة إنهاء خلال التوليف الريباسي 3-5.

في المختبر تم تطويرها المقايسات النسخ كأدوات قوية لدراسة الخطوات التنظيمية المعقدة خلال النسخ 6. بشكل عام، لا بد من جزء طولي من الحمض النووي بما في ذلك منطقة المروج كقالب لالنسخ. عادة يتم إنشاء قالب الحمض النووي عن طريق PCR أو linearizing البلازميد. ثم تضاف تنقية البروتينات والبرامج الوطنية (بما في ذلك رديولبلد واحد NTP لأغراض الكشف) والمنتج تحليل بعد فترة المطلوبة من الحضانة. باستخدام القوالب المناسبة وظروف التفاعل، وقد تم فحص جميع مراحل النسخ باستخدام هذا النهج الذي مكن التوصيف الجزيئي مفصل من transcription خلال نصف القرن الماضي 7. جنبا إلى جنب مع معلومات عن هيكل 3-الأبعاد من RNAP كان من الممكن أيضا للتحقيق في الآلية الجزيئية لتثبيط النسخ بواسطة المضادات الحيوية ويؤدي للمضادات الحيوية، واستخدام هذه المعلومات في تطوير جديدة، والمخدرات تحسين 8-10.

في هذا العمل ونحن تقديم أمثلة عن كيف يمكن استخدام المقايسات النسخ لتحديد آلية التنظيم من قبل النسخ استطالة / عامل إنهاء نوسا، وكيف أن آلية عمل رواية بدء النسخ المانع الرصاص يمكن تحديدها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

تحذير: تجارب تنطوي على استخدام المشعة النظائر 32 P، وينبغي أن يضطلع بها أي عمل حتى يتم استيفاء جميع شروط السلامة المناسبة. عموما هناك حاجة الموظفين لحضور دورة في السلامة والخضوع لممارسة تحت إشراف قبل التجارب باستخدام الكواشف الإشعاعية. يرجى ارتداء معدات الحماية الشخصية (مقياس الجرعة الحراري الضوئي، ونظارات السلامة والقفازات، وغرفة الأشعة معاطف معمل، كامل طول السراويل مغلقة اصبع القدم أحذية) عند تنفيذ رد فعل.

1. إعداد مواد الفحص

  1. الحصول على البروتينات المطلوبة لفحص النسخ.
    1. للتجربة وصفها هنا، تحفيزه وتنقية E. القولونية RNAP في المختبر كما هو موضح 11، أو الحصول عليها من مصدر تجاري (قائمة المواد).
      ملاحظة: كل من يقدم نتائج مماثلة. ويمكن أيضا أساليب أخرى لتنقية RNAP الأصلي أو تقارب المسمى استخدامها 12،13. ويمكن الحصول على سيغما / العوامل نوسا كما دescribed في العمل السابق 14،15.
  2. المياه إعداد اثيل Pyrocarbonate (DEPC) المعالجة
    ملاحظة: بدلا من ذلك، ريبونوكلياز خالية من المياه يمكن الحصول عليها من مصادر تجارية (قائمة المواد).
    1. إضافة 1 مل اثيل pyrocarbonate (DEPC) إلى 1 لتر من المياه النقية (0.1٪ ت / ت) وتخلط بين عشية وضحاها.
    2. المياه DEPC الأوتوكلاف ونصائح مرتين.
  3. إعداد قالب الحمض النووي
    1. تنقية البلازميد pSG1154 16 و / أو pIA226 17 باستخدام طقم تنقية البلازميد (قائمة المواد) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. لتضخيم القالب لفحوصات النسخ الاعادة (جزء 360 نقطة أساس لدراسة منطقة XYL المروج P)، التجمع تفاعل PCR على الجليد بينهم 25 ميكرولتر مزيج 2X PCR (قائمة المواد)، 2 ميكرولتر كل من الاشعال (5 ميكرومتر) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 "(إلى الأمام) و5'-CCCATTAACATCACCATC-3" (عكس)، 1 ميكرولتر pSG1154 البلازميد العلاقات العامةeparation (250 ميكرون) و 20 ميكرولتر المياه النقية).
      1. أو بدلا من ذلك، لفحوصات النسخ مستديرة واحدة، وتضخيم شظية 447 نقطة أساس يشمل λ P المنطقة R المروج من pIA226 17. إعداد تفاعل PCR على الجليد باستخدام 25 ميكرولتر 2X PCR المزيج، 2 ميكرولتر كل من الاشعال (5 ميكرومتر): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 "(إلى الأمام) و5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3" (عكس)، pIA226 1 ميكرولتر 17 إعداد البلازميد (250 ميكرون) و 20 ميكرولتر المياه النقية).
        ملاحظة: هذا القالب يفتقر السيتوزين حتى موقف +26 الإقليم الشمالي، وهو النوكليوتيدات 26 عشر من موقع النسخ البداية. ولذلك، النسخ باستخدام هذا القالب سيسمح بدء، إزالة المروج والمماطلة في +26 الإقليم الشمالي لتشكيل مجمع استطالة النسخ مستقر (EC) عندما الوحيد ATP، UTP وGTP موجودة في رد الفعل.
    3. إعداد تفاعل PCR مع الشروط التالية: 95 °؛ مئوية لمدة 30 ثانية و 50 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، وتكرار لمدة 30 دورات.
    4. تنقية المنتج باستخدام مجموعة PCR تنظيف (قائمة المواد) وفقا لتعليمات الشركة الصانعة وأزل في 100 العازلة ميكرولتر النسخ لفحص النسخ.
    5. تحديد تركيز الحمض النووي القالب باستخدام fluorospectrometer (قائمة المواد).
  4. إعداد NTP
    ملاحظة: يمكن الحصول على هذه البرامج الوطنية من مصادر تجارية مختلفة (قائمة المواد).
    1. حل هذه البرامج الوطنية (≥99٪ نقية) في المياه المعالجة DEPC لجعل 1 M الأسهم، قسامة 1 مل من محلول إلى 1.5 مل أنابيب (50 ميكرولتر في كل أنبوب) ومخزن في -20 درجة مئوية.
    2. أجل α- 32 P UTP (3000 تسى / ملمول) قبل التجربة. 32 P لديها قصيرة نصف الحياة من 14.29 يوما.
      ملاحظة: استخدام UTP المسمى ألفا يتجنب مقارنة كثافة من عصابات مع طول مختلفة.
  5. إعداد RNA سلم
    1. تجميع متابعةجي رد فعل في درجة حرارة الغرفة: 0.5 ميكروغرام RNA قالب مزيج (قائمة المواد)، 80 ملي HEPES العازلة pH7.5، 12 ملي MgCl 2، 10 مم كلوريد الصوديوم، و 10 ملي DTT، 2 ملم ATP / CTP / GTP، 0.5 ملي UTP، 2 ميكرولتر ألفا 32 P UTP، 0.5 ميكرولتر T7 RNAP (قائمة المواد)، والمياه DEPC المعالجة إلى 20 ميكرولتر.
    2. تسمح رد فعل على المضي قدما في 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة. استخدامها على الفور أو تخزين في -80 درجة مئوية.

2. إعداد RNA تسلسل جل

  1. تحضير هلام
    1. تنظيف لوحات من جهاز هلام التسلسل (قائمة المواد) مرتين مع 70٪ من الإيثانول والمياه النقية، وتجميع الخلية مع مشط واثنين من الفواصل.
      ملاحظة: يمكن أن تطلى لوح واحد مع siliconizing كاشف (قائمة المواد) لتسهيل إزالة هلام في الخطوة 4.2.
    2. حل 33.6 ز اليوريا في 22 مل من الماء و 16.4 مل من 5X تريس / بورات / EDTA (TBE) العازلة (54 ز تريس (hydroxymethyl) aminomethane، 27.5 غ حمض البوريك و 10 مل من 1 M ثنائي أمين الإيثيلين رباعي حمض الخل (EDTA)، ودرجة الحموضة 7.4 في 1 لتر ماء) باستخدام محرك مغناطيسي.
    3. إضافة 16 مل من 40٪ مادة الأكريلاميد / مكرر الأكريلاميد حل (19: 1) إلى محلول اليوريا وتصفية من خلال مرشح 0.45 ميكرون.
    4. إضافة 514 ميكرولتر 10٪ (ث / ت) الطازجة فوق كبريتات الأمونيوم في الماء تليها 51.4 ميكرولتر N، N، N '، N' -Tetramethylethylenediamine (TEMED) إلى حل تصفيتها.
    5. عكس بلطف الحل هلام لتجنب التهوية المفرطة وحقن فورا وسلاسة في الخلية التسلسل معبأة قبل وضعه أفقيا من ثقب حقن السفلي. الحرص على تجنب الوقوع في فقاعات أثناء الحقن.
    6. السماح 1-1.5 ساعة حتى يتم تعيين تماما هلام قبل استخدامها في فحص النسخ. الجل يمكن أن يتم تخزينها في درجة حرارة الغرفة لمدة يومين أو ثلاثة أيام عندما ملفوفة مع الأنسجة المياه الرطب على أعلى الخلية التسلسل.

3. رد فعل النسخ

  1. النسخ الاستطالة إن الإيقاف المؤقت الفحص
    1. تشكيل مجمع استطالة النسخ
      1. إضافة 1 ميكرولتر من RNAP انزيم الأساسية (1 ميكرومتر الأسهم في المخزن النسخ) لأنبوب 1.5 مل.
      2. إضافة 1 ميكرولتر من تنقية سيغما 70 عامل (σ 70، 3 ميكرومتر الأسهم في المخزن النسخ) إلى RNAP واحتضان على الجليد لمدة 10 دقيقة لتشكيل RNAP عميم الإنزيم.
      3. إضافة 3 ميكرولتر 500 نانومتر قالب تنقية الحمض النووي (λ P R المروج من المنتج pIA226 PCR) في المخزن النسخ لعميم الإنزيم RNAP واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق لتشكيل المجمع مفتوحة.
      4. تحضير خليط من مكونات رد الفعل في أنبوب آخر 1.5 مل باستخدام 5 ميكرولتر من 10X العازلة النسخ (قائمة المواد: 400 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك 1.6 M بوكل، 100 ملي MgCl 2 و 10 ملي DTT و 50٪ الجلسرين، ودرجة الحموضة 7.9 في DEPC المعالجة الماء)، 2 ميكرولتر من 250 ميكرومتر كل GTP وUTP، 1 ميكرولتر من 1 ملي اعبي التنس المحترفين، و 1 ميكرولتر من α- 32 P UTP (3000 تسى / ملمول). إضافة DEPC المياه المعالجة إلى 41 ميكرولتر.
        لاالشركة المصرية للاتصالات: ريبونوكلياز المانع (قائمة المواد) يمكن استخدامها للحد من التلوث ريبونوكلياز.
      5. نقل الحل الخليط إلى الأنبوب الذي يحتوي على مجمع مفتوح واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة لتشكيل توقف مجمع النسخ استطالة في +26 الإقليم الشمالي.
      6. نقل رد فعل على درجة حرارة الغرفة (~ 21 درجة مئوية) وإضافة 1 ميكرولتر من 2.5 ملغ / مل ريفامبيسين إلى تركيز النهائي من 50 ميكروغرام / مل.
      7. إضافة 1 ميكرولتر من 0.1 ملي تنقية نوسا إلى خليط التفاعل واحتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
      8. إضافة 2 ميكرولتر من 250 ميكرومتر CTP إلى خليط التفاعل لجعل الحجم النهائي من 50 ميكرولتر وقياس وقت رد الفعل باستخدام جهاز توقيت.
      9. نقل 5 ميكرولتر من محلول التفاعل إلى 2 ميكرولتر من العازلة RNA هلام تحميل (95٪ الفورماميد، 0.05٪ برموفينول الأزرق و 0.05٪ سيانول زايلين) في 30، 60، 120، 240، 480، و 1،200 ثانية لإرواء رد الفعل.
      10. التخلص من النصائح 32 P UTP والأنابيب في تابع النفايات المشعةainer.
  2. النسخ بدء الفحص
    1. تشكيل مجمع الفتح
      1. تمييع تنقيته σ 70-،5 ميكرومتر.
      2. كرر الخطوات 3.1.1.1 ل3.1.1.3 باستخدام 0.5 ميكرومتر (بدلا من 3 ميكرومتر) تنقيته σ 70، والقالب الحمض النووي (ف المنطقة XYL المروج من المنتجات pSG1154 PCR).
    2. تثبيط بدء النسخ فحص
      1. إضافة المانع تهدف إلى منع تشكيل عميم الإنزيم RNAP لانزيم الأساسية RNAP قبل إضافة σ 70 (بعد خطوة 3.1.1.1)، تليها خطوات 3.1.1.2 و3.1.1.3 لفحص ما إذا كان المانع هو قادرة على تعطيل عميم الإنزيم تشكيل.
      2. بدلا من ذلك، بعد الخطوة 3.1.1.2، إضافة مثبط لدراسة ما إذا كانت قادرة على كبح تنافسية σ 70 ملزمة لRNAP.
      3. استخدام نفس الكمية من DMSO، ومذيب للالمانع، بدلا من المانع الصورةتوك في التفاعلات السيطرة.
    3. الانتهاء من رد فعل
      1. حل الهيبارين في الماء لتركيز الأسهم من 1 ملغ / مل والأوراق المالية في -20 درجة مئوية.
        ملاحظة: الهيبارين هو منافس من الحمض النووي التي يمكن عزل RNAP التي لم تشكل مجمع مفتوح. مرة واحدة يتم تشكيل مجمع مفتوح، الهيبارين لا يمكن أن يدخل الموقع الحمض النووي ملزم من RNAP ويمنع النسخ من مجمع مفتوح شكلت مسبقا. ولذلك، مطلوب الهيبارين فقط لفحوصات جولة واحدة؛ لا حاجة لذلك لفحوصات متعددة الجولة.
      2. تحضير خليط التفاعل باستخدام 5 ميكرولتر من 10X العازلة النسخ (قائمة المواد)، 1 ميكرولتر من 1 ملغ / مل حل الهيبارين، 1 ميكرولتر من 10 ملي كل اعبي التنس المحترفين، GTP، وCTP، 2.5 ملي UTP، و 1 ميكرولتر من α- 32 P UTP (3000 تسى / ملمول). إضافة DEPC المياه المعالجة إلى 45 ميكرولتر.
      3. مزج خليط التفاعل مع النسخ فتح المجمع، وتدور النبض واحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
      4. نقل 10 ميكرولتر من رد فعل لذلكlution إلى 5 ميكرولتر من العازلة RNA هلام تحميل (95٪ الفورماميد، 0.05٪ برموفينول الأزرق و 0.05٪ سيانول زايلين) لإرواء رد الفعل.

4. RNA جل الجري والتنمية

  1. تشغيل بولي أكريلاميد جل تغيير طبيعة
    1. تشغيل هلام في 50 درجة مئوية و 50 W في المخزن 1X TBE لحوالي 1.5 ساعة حتى درجة حرارة جل والمخزن المؤقت مستقرا عند 50 درجة مئوية.
    2. عينات الحرارة عند 90 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، ونقلها على الجليد تحميل مسبق على هلام.
    3. نماذج تحميل في الآبار في الجزء العلوي من هلام جنبا إلى جنب مع حارة واحدة تحتوي على 2 ميكرولتر RNA سلم (1: 100 تمييع).
    4. تشغيل هلام في 50 واط و 50 درجة مئوية في المخزن 1X TBE حتى يصل برموفينول صبغة زرقاء ~ 2/3 أسفل هلام.
  2. هلام علاج
    1. فتح ببطء وبعناية فصل لوحة العلوي من الخلية التسلسل. كل الحرص لتجنب كسر هلام.
    2. قطع chromatograpاتش واى ورقة (قائمة المواد) لتتناسب مع حجم جل من أعلى إلى برموفينول صبغة زرقاء. استخدام عداد جيجر لتأكيد موقف التقريبي للنسخ الرنا المسمى بالإشعاع.
    3. تغطية بعناية الجل مع ورقة الترشيح، واضغط بشدة حتى هلام تلتزم ورقة الترشيح. قطع وتجاهل الجزء السفلي من هلام لالنفايات المشعة كما تشغيل هذه البرامج الوطنية الفردية في الجزء السفلي من هلام، والتي يمكن أن تكون ساخنة جدا.
    4. ضع قطعة مماثلة الحجم من ورق الترشيح على السرير التجفيف آلة فراغ التجفيف، ووضع بعناية ورقة هلام المغلفة على ذلك مع هلام لأعلى.
    5. تغطية الجل مع غلاف بلاستيكي وجافة عند 60 درجة مئوية لمدة 1.5 ساعة.
    6. التفاف على الجانب الآخر من هلام المغلفة ورقة فلتر مع غلاف بلاستيكي، ووضع على لوحة الفوسفور photostimulable في حالة التصوير، مع مدة التعرض المناسبة، التي يمكن أن تختلف من 1 ساعة إلى يتوقف بين عشية وضحاها على كفاءة التفاعل.
    7. صورة لوحة الفوسفور باستخدامماسح تصوير وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحديد شدة الفرقة النسبية باستخدام برنامج ImageJ وفقا لدليل البرامج.
    8. استخدام عداد جيجر لفحص التلوث الإشعاعي في منطقة العمل، والقضاء على العناصر المشتبه بهم والمنطقة مع الأنسجة وعامل تنظيف والتخلص من الأنسجة في حاوية التخلص منها.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

كفاءة النسخ يمكن تحديد ذلك عن طريق قياس مستوى الإشعاع في نطاقات في نقاط زمنية مختلفة. فحص التوقف لاختبار وظيفة عامل نوسا تمكين التصور من وقفة، وإنهاء الخدمة، وجريان المنتجات (الشكل 1A). في وجود مجال ن الطرفية نوسا (نوسا الأمراض الاستوائية المهملة، بقايا الأحماض الأمينية 1-137)، تأخر ظهور منتجات RNA بشكل ملحوظ مقارنة التجربة السيطرة تفتقر نوسا. (بقايا K36، K37، R104، Q108، K111، Q112، Q116، وR119) أدى حذف بقايا الأحماض الأمينية 104-...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

في جميع الكائنات الحية، والنسخ هو عملية تنظيم محكم. في المختبر وضعت المقايسات النسخ لتوفير منصة لاختبار آثار عوامل النسخ، والجزيئات الصغيرة ومثبطات النسخ. في هذه الورقة الأسلوب، وقد وصفت مقايسة لنسخ البكتيرية العام. المقايسات النسخ جنبا إلى جنب مع تسلسل هلام الكهربائي من النصوص مهمة جدا لدراسات الميكانيكية لأنها تسمح التصور لجميع المنتجات النسخ على طول الخط. ونتيجة لذلك، وهذه الطريقة هي قادرة على تحديد تأثير التغيرات الطفيفة في ظروف التفاعل والكشف عن آلية مقبولة للعمل. وع...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يعترف هذا العمل بمنحة الكلية المهنية المبكرة من جامعة نيوكاسل (CM).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الحصول على البروتينات المطلوبة لمقايسة
الإشريكية القولونية < / em> RNAPEpicentreS90250
تحضير المياه
المعالجة بالمياه المعالجة ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC)   ؛سيجما ألدريتش D5758
RNase خالية من المياه 
Ambion Nuclease-Free WaterThermoFisherAM9937
معالج إعداد
النووي   Plus  SV Minipreps DNA Purification SystemPromegaA1330
ACCUZYME MixBiolineBIO-25028
PCR primers
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System PromegaA9281
NanoDrop 3300 مقياس الطيف الفلوريThermo ScientificND-3300
NTP إعداد
ATPSigma-Aldrich & nbsp ؛A6559
UTPسيجما ألدريتش  U1006
GTPSigma-Aldrich G3776
CTPسيجما ألدريتش  C9274
عالية النقاء rNTPsجنرال إلكتريك للرعاية الصحية27-2025-01
α-32P UTP PerkinElmer   BLU007C001MC
تحضير سلم الحمض النووي الريبي المركب المشع  
نوفاجين الكمال RNA ماركر قالب ميكس 0.1 &ndash ؛ 1 كيلو بايتMillipore69003
HEPESSigma-Aldrich H7006
كلوريد الصوديومسيجما ألدريتش  S7653
كلوريد المغنيسيومسيجما-ألدريتش  M8266
DTTSigma-AldrichDTT-RO
T7 RNAPPromegaP2075
تحضير
Sequi-Gen GT خلية تسلسل الحمض النووي  Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   سيجما ألدريتش SL2
اليوريا   سيجما ألدريتش U6504
تريس (هيدروكسي ميثيل) أمينوميثان   ؛  سيجما ألدريتش 154563
حمض البوريك  سيجما ألدريتش B7901
حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك   ؛سيجما ألدريتش ED
40٪ أكريلاميد / ثنائي أكريلاميد   ؛سيجما ألدريتش A9926
بيرسلفات الأمونيوم  سيجما ألدريتش A3678
N,N,N',N'-Tetramethylethylenediamine (TEMED)Sigma-Aldrich T9281
النسخ
كلوريد البوتاسيومSigma-Aldrich P9541
الجلسرين   سيجما ألدريتش G5516
ريفامبيسين    سيجما ألدريتش R3501
فورماميد   سيجما ألدريتش F9037
بروموفينول أزرق   ؛سيجما ألدريتش B0126
زيلين سيانول سيجما ألدريتش X4126
الهيبارين سيجما ألدريتش 84020
RNasin Ribonuclease InhibitorPromegaN2511
Transcription Buffer 
قاعدة تريسسيجما ألدريتش  T1503
كلوريد البوتاسيومسيجما-ألدريتش  P9541
كلوريد المغنيسيومسيجما ألدريتش   ؛M2393
DTT    سيجما ألدريتش DTT-RO
glycerol   سيجما ألدريتش G5516
ورق
Whatman  3 مم Chr كروماتوغرافيا ورقةفيشر Scientific05-714-5
مزيل
Decon 90Decondecon90
علاج جل
Typhoon Trio + تصويرGE Healthcare Life Sciences63-0055-89
النسخقالب الحمضجل فحص الترشيحالتلوث الإشعاعي

المراجع

  1. Mooney, R. A., Artsimovitch, I., Landick, R. Information processing by RNA polymerase: recognition of regulatory signals during RNA chain elongation. J. Bacteriol. 180 (13), 3265-3275 (1998).
  2. Burgess, R. R., Anthony, L. How sigma docks to RNA polymerase and what sigma does. Curr. Opin. Microbiol. 4 (2), 126-131 (2001).
  3. Gusarov, I., Nudler, E. Control of intrinsic transcription termination by N and NusA: the basic mechanisms. Cell. 107 (4), 437-449 (2001).
  4. Ha, K. S., Toulokhonov, I., Vassylyev, D. G., Landick, R. The NusA N-terminal domain is necessary and sufficient for enhancement of transcriptional pausing via interaction with the RNA exit channel of RNA polymerase. J. Mol. Biol. 401 (5), 708-725 (2010).
  5. Yang, X., Lewis, P. J. The interaction between RNA polymerase and the elongation factor NusA. RNA Biol. 7 (3), 272-275 (2010).
  6. Artsimovitch, I., Henkin, T. M. In vitro approaches to analysis of transcription termination. Methods. 47 (1), 37-43 (2009).
  7. Decker, K. B., Hinton, D. M. Transcription regulation at the core: Similarities among bacterial, archaeal, and eukaryotic RNA polymerases. Annu. Rev. Microbiol. 67, 113-139 (2013).
  8. Artsimovitch, I., Vassylyev, D. G. Is it easy to stop RNA polymerase? Cell Cycle. 5 (4), 399-404 (2006).
  9. Murakami, K. S. Structural biology of bacterial RNA polymerase. Biomolecules. 5 (2), 848-864 (2015).
  10. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription as a target for antibacterial drug development. Microbiol. Mol. Biol. Rev. 80 (1), 139-160 (2016).
  11. Yang, X., Ma, C., Lewis, P. A vector system that allows simple generation of mutant Escherichia coli RNA polymerase. Plasmid. 75, 37-41 (2014).
  12. Burgess, R. R. A new method for the large scale purification of Escherichia coli deoxyribonucleic acid-dependent ribonucleic acid polymerase. J. Biol. Chem. 244, 6160-6167 (1969).
  13. Artsimovitch, I., Svetlov, V., Murakami, K. S., Landick, R. Co-overexpression of Escherichia coli RNA polymerase subunits allows isolation and analysis of mutant enzymes lacking lineage-specific sequence insertions. J. Biol. Chem. 278 (14), 12344-12355 (2003).
  14. Ma, C., Yang, X., Lewis, P. J. Bacterial transcription inhibitor of RNA polymerase holoenzyme formation by structure-based drug design: From in silico screening to validation. ACS Infect. Dis. 2, 39-46 (2016).
  15. Ma, C., Mobli, M., Yang, X., Keller, A. N., King, G. F., Lewis, P. J. RNA polymerase-induced remodelling of NusA produces a pause enhancement complex. Nucleic Acids Res. 43 (5), 2829-2840 (2015).
  16. Lewis, P. J., Marston, A. L. GFP vectors for controlled expression and dual labelling of protein fusions in Bacillus subtilis. Gene. 227 (1), 101-110 (1999).
  17. Artsimovitch, I., Landick, R. Pausing by bacterial RNA polymerase is mediated by mechanistically distinct classes of signals. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (13), 7090-7095 (2000).
  18. Vassylyev, D. G., et al. Crystal structure of a bacterial RNA polymerase holoenzyme at 2.6 Å resolution. Nature. 417, 712-719 (2002).
  19. Artsimovitch, I., et al. Structural basis for transcription regulation by alarmone ppGpp. Cell. 117 (3), 299-310 (2004).
  20. Bordier, C. Inhibition of rifampicin-resistant RNA synthesis by rifampicin-RNA polymerase complexes. FEBS lett. 45 (1-2), 259-262 (1974).
  21. Tang, G. Q., Anand, V. S., Patel, S. S. Fluorescence-based assay to measure the real-time kinetics of nucleotide incorporation during transcription elongation. J. Mol. Biol. 405 (3), 666-678 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

معقد استطالة النسخهولوزيم بوليميراز الحمض النووي الريبيعامل النسخ NusAالفصل الكهربائي بهلام التسلسلمقايسة توقف النسخطريقة تثبيط النسخالكشف عن الحمض النووي الريبي المشعتحليل عوامل النسخفحص العوامل المضادة للبكتيريا
النسخ في المختبر فحوصات وتطبيقها في اكتشاف الأدوية
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.