مقالة منهجية

نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة

13.4K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54259

⸱

يوليو 29, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1R&D Reagents, Miltenyi Biotec GmbH, 2In vivo Tumorbiology, Oncotest GmbH

في هذه المقالة

ملخص

xenografts ورم الإنسان هي أوعية دموية وتسلل من قبل خلايا المنشأ الماوس أثناء مرحلة النمو في الجسم الحي. للالتفاف على التحيز الناجم عن هذه الخلايا تلويث خلال تحليل المصب، قمنا بتطوير طريقة السماح لاستنزاف شامل لجميع خلايا الماوس عن طريق فرز الخلايا المغناطيسي.

الملخص

وقد تم استخدام في المختبر نماذج خط الخلية لأبحاث السرطان أداة مفيدة. ومع ذلك، فقد تبين أن هذه النماذج تفشل في تقليد موثوق أورام المرضى في فحوصات مختلفة 1. تمثل xenografts ورم الإنسان معيار الذهب فيما يتعلق بيولوجية الورم، واكتشاف المخدرات، والبحث ورم خبيث 2-4. xenografts الورم يمكن استخلاصها من أنواع مختلفة من المواد مثل خطوط الخلايا السرطانية، نسيج الورم من الأورام المريض الأولية 4 أو الأورام المزروعة بشكل متسلسل. عندما نشر في الجسم الحي، وتسلل الأنسجة xenografted وأوعية دموية من خلايا المنشأ الماوس. عوامل متعددة مثل الكيان الورم، ومنشأ المواد xenografted، ومعدل النمو ومنطقة زرع تؤثر على تكوين وكمية من خلايا فأر الحالية في xenografts الورم. ومع ذلك، وحتى عندما يتم الاحتفاظ هذه العوامل ثابت، ودرجة تلوث الخلية الماوس متغيرة للغاية.

شاركntaminating خلايا فأر يضعف بشكل كبير التحليلات النهائية من xenografts الورم الإنسان. كما تظهر الخلايا الليفية الماوس كفاءات عالية الطلاء ومعدلات الانتشار، فإنها تميل إلى اكتسى الثقافات الخلايا السرطانية البشرية، خاصة البطيئة التكاثر القطعان. خلية الماوس المستمدة الحمض النووي، ومرنا، ومكونات البروتين يمكن التحيز تحليل التعبير الجيني المصب، الجيل التالي من التسلسل، وكذلك تحليل بروتيوم 5. للتغلب على هذه القيود، قمنا بتطوير طريقة سريعة وسهلة لعزل تمس الخلايا السرطانية البشرية من أنسجة الورم xenografted. ويستند هذا الإجراء على استنزاف شامل لخلايا المنشأ الماوس عن طريق الجمع بين تفكك النسيج الآلي مع dissociator الأنسجة الفوق والفرز خلية المغناطيسي. هنا، علينا أن نبرهن على الخلايا المستهدفة الإنسان يمكن أن يكون ويمكن الحصول عليها مع درجات نقاء أعلى من 96٪ في غضون أقل من 20 دقيقة مستقل عن نوع الورم.

المقدمة

تتكون الأورام البشرية الصلبة الفسيولوجية متعددة فضلا عن أنواع الخلايا الورمية. وهي تشكل الأنسجة غير المتجانسة مع الهياكل البيولوجية المعقدة. العمليات البيولوجية مثل الورم تشكيل والتقدم والاستجابات نحو العلاجات ليست مفهومة تماما حتى الآن. في المختبر نماذج ثقافة الخلية تمثل أداة مفيدة لدراسة وفهم بيولوجية الورم. ومع ذلك، فإنها لا يمكن إلا أن تعكس جزئيا الهياكل والعمليات الموجودة في أنسجة الورم. قبل السريرية النماذج السرطانية البشرية موثوقة ومستقرة هي شرط أساسي لتطوير الأدوية المضادة للأورام والعلاج 4،6 فضلا عن فهم بيولوجيا الأورام، والتفاعل بين الخلايا السرطانية وبيئتهم.

نماذج ورم طعم أجنبي الإنسان المستمدة من أورام المريض الأولية تظهر العلاقات عالية في الأنسجة الأصلية فيما يتعلق بنية النسيجية، التفاعل مع الهياكل الدقيقة البيئي، وإمكانات النقيلي والاستجابة للعقاقير 7 . حتى عندما تستمد xenografts الورم من الخلايا المستنبتة أو خطوط الخلايا التي تحاكي بشكل وثيق أورام المريض، وبالتالي تبين صحة العليا في معظم المقايسات مقارنة في المختبر نماذج ثقافة الخلية. هذه الميزات تجعل منها المعيار الذهبي لنماذج ما قبل السريرية 4. وإلى جانب تطبيقها في أبحاث السرطان، كما تستخدم زرع الأعضاء من الخلايا البشرية في الفئران في كثير من الأحيان في أبحاث الخلايا الجذعية لتحديد إمكانية stemness والتمايز من السكان المستهدفين 8.

وقد تبين أن الأوعية الدموية الدقيقة البشري ويتم استبدال الخلايا المناعية الإنسان عليها في الجسم الحي انتشار الأورام البشرية 2،9. عوامل مثل النوع الفرعي الورم، ومعدل النمو، ومنطقة زرع لها تأثيرات كبيرة على المستوى العالمي من تسلل وكذلك تكوين أنواع الخلايا الماوس وجدت. ومع ذلك، وحتى عندما يتم الاحتفاظ هذه العوامل مستمر، ومقدار وتكوين خلايا فأر تتغير بصورة كبيرة.

وغالبا ما يتم الطعن التحليلات النهائية من الأنسجة xenografted من قبل خلايا المنشأ الفئران. وكثيرا ما متضخمة الثقافات الأولية للخلايا السرطانية البشرية من xenografts الليفية. إلى جانب إعاقة جيل من خطوط الخلايا السرطانية في المختبر، وتنحاز المقايسات المصب مثل المخدرات اختبار السمية الخلوية أو الدوائية منذ ذلك الحين في تصحيح سيليكون للآثار الناشئة من تلويث خلايا فأر من المستحيل في معظم الحالات. أبعد من ذلك، وعبر الحديث فقط توضيح جزئيا بين الخلايا الليفية الماوس والخلايا السرطانية البشرية له تأثير مباشر على النتائج التجريبية للدراسات 10. وعلاوة على ذلك، فإن الاختلاف الأكثر لا يمكن التنبؤ بها على نطاق واسع من تسلل خلايا فأر تفاقم التحليلات المصب الجزيئية دقيقة. في NGS أو بروتيوم يحلل كل إشارة المشتقة الماوس قياس بدلا من إشارة السرطانية البشرية يقلل مباشرة حساسية التسلسل. كما يتم الطعن ميكروأري على أساس التحليلات التعبير من خلال مجلس التوحيد الوطنى الفئرانالأحماض leic ربما عبر التهجين لتحقيقات الإنسان.

من أجل الالتفاف على العقبات تلوث خلايا فأر في التحليلات التحويلية للخلايا السرطانية البشرية قد اقترح من النماذج طعم أجنبي المناهج المختلفة. في العديد من الدراسات معزولة المطلوب الخلايا المستهدفة لتحليل المصب من خلال استخدام علامات أو مجموعات من علامات أعرب حصرا على الخلايا السرطانية البشرية. ومع ذلك، فإن عدم وجود علامات يمكن الاعتماد عليها لتحديد هوية الخلايا السرطانية البشرية في كثير من الأحيان يمثل عقبة كبيرة. علامات حتى أعرب على نطاق واسع، مثل EpCAM على سرطان الإنسان، وكثيرا ما تظهر الخلافات الورم جوهري التعبير 11. وهذا يزيد من خطر أن القطعان التعبير منخفضة، على سبيل المثال، الخلايا السرطانية خضعت-الظهارية لالوسيطة الانتقالية، والتي فقدت خلال العزلة. وبالإضافة إلى ذلك، الربط مباشرة من وكيل التحديد إلى الخلية المستهدفة قد تؤثر على نتائج التحليل لاحقة. محاولات المستنفدة خلايا فأر من قبلباستخدام مزيج من الاجسام المضادة المحددة لCD45 الفئران والطبقة الحواتم MHC أنا قدمت أيضا 12. ومع ذلك، هذا المزيج علامة فقط بالكشف عن مجموعة فرعية من خلايا فأر. وثمة نهج آخر هو تعزيز عمليات تحليل من قبل البرامج. ومع ذلك، كل هذه الطرق هي إما غير مناسبة لأي نوع من الإعداد التجريبية أو أي كيان الورم وطريقة الزرع.

في هذه الدراسة نقدم الرواية وطريقة سريعة لالمستنفدة شامل خلايا فأر من الأنسجة xenografted مستقلة من سلالة الماوس والأنسجة الأصلية. في العروض على عدة أجهزة المستهدفة وأنسجة للزرع من xenografts (بما في ذلك الجلد والرئة والدماغ والكلى والعضلات والهيكل العظمي) تمكنا من تحديد مجموعة من الأجسام المضادة السماح للكشف شامل خلايا فأر. اقترنت هذه الأجسام المضادة إلى جزيئات مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagnetic، معاير والأمثل لاستنزاف باستخدام فرز الخلايا المغناطيسي. محددة الماوس كما الوحيدوتستخدم الأجسام المضادة وخلايا المستهدفة الإنسان البقاء "لم تمس" وطريقة لا يقتصر على نسيج الورم xenotransplanted. علينا أن نبرهن على خلايا فأر إزالة شاملة من عينات الورم xenografted توحد وتسهل الثقافات الخلايا السرطانية البشرية. وعلاوة على ذلك، وتبين لنا أن تحليل xenografts ورم الإنسان من قبل تسلسل الجيل القادم وتحسنت بشكل ملحوظ. كما لوحظ هذا التأثير على الرغم من أن مجموعة محددة التسلسل البشري قد نفذت خلال تخصيب exome، ومن المتوقع أن تكون أكثر بروزا وتأثيرا على الجينوم كله وكله Transcriptome على التسلسل. معا، وإزالة خلايا فأر باستخدام هذه الطريقة رواية تسهل زراعة الخلايا السرطانية البشرية وتحسن كبير في التحليلات النهائية من xenografts الورم الإنسان.

البروتوكول

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية المحلية الأخلاقية والقانونية للRegierungspräsidium فرايبورغ Referat 35.

1. إعداد الكاشف

ملاحظة: قبل البدء في التجربة، وإعداد الكواشف التالية من عدة التفكك:

  1. لإعداد انزيم H حل كل قارورة من مسحوق مجفف بالتجميد في 3 مل من RPMI 1640 معهد روزويل بارك التذكاري 1640 (RPMI 1640) أو متوسطة النسر تعديل Dulbecco و(DMEM). من أجل تجنب تكرار التجميد والذوبان إعداد قسامات مناسبة (على سبيل المثال، 200 ميكرولتر) وتخزينها في - 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  2. لإعداد انزيم R حل قارورة من مسحوق مجفف بالتجميد في 2.7 مل من RPMI أو DMEM المتوسطة. من أجل تجنب تكرار التجميد والذوبان إعداد قسامات مناسبة (على سبيل المثال، 100 ميكرولتر) وتخزينها في - 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر.
  3. لإعداد الإنزيم وحل الخامسالاتحاد العالمي للتعليم من مسحوق مجفف بالتجميد في 1 مل من الاحتياطي والمتوفرة مع هذه المجموعة من دون vortexing ل. من أجل تجنب تكرار التجميد والذوبان إعداد قسامات مناسبة وتخزينها في (على سبيل المثال، 25 ميكرولتر) - 20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. تأكد من مزيج دقيق هذا تعليق على الفور قبل أن تنسحب من حجم رد الفعل المطلوب.
  4. إعداد 250 مل العازلة (برنامج تلفزيوني 1X مع 0.5٪ BSA) لإجراء فصل الخلية وتلوين الأجسام المضادة.
    ملاحظة: عند زراعة الخلايا بعد إزالة خلايا فأر تصفية جميع المخازن وحلول الانزيم من خلال مرشح 0.22 ميكرون.

2. ورم بروتوكول التفكك

ملاحظة: في هذه الدراسة xenografts المستمدة من المريض من سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC)، واستخدمت سرطان الكلى والمثانة. تم إنشاؤها الأورام من خلال زرع xenografts من سرطان الرئة ذو الخلايا غير الصغيرة (NSCLC) سرطان الكلى والمثانة في 4-6 أسابيع من العمر الإناث NMRI نو / نو الفئران كما هو موضح سابقا 13 .
ملاحظة: بما أن هذه بروتوكول مستقلة تماما عن نوع الورم، ويمكن استخدامها في أي نوع من المريض أو الخلايا المشتقة من الخط الورم وكذلك أنواع أخرى من الأنسجة xenotransplanted الإنسان دون تعديل البروتوكول.

  1. إعداد 5 مل من مزيج الهضم في عينة الأنسجة (تصل إلى 1 ز) حديثا بإضافة 4.7 مل من RPMI 1640 أو DMEM 200 ميكرولتر من انزيم H، و 100 ميكرولتر من أنزيم R، و 25 ميكرولتر من انزيم وفي أنبوب تفارق الخلوي ( C أنبوب). تأكد من مزيج دقيق تعليق انزيم R قبل سحب الحجم المطلوب.
  2. التضحية الحيوانات عن طريق التفكك عنق الرحم تحت التخدير. تطهير الماوس عن طريق الرش مع كمية صغيرة من الايثانول 80٪ ت / ت.
  3. ورم تحت الجلد الحصاد من الجهة فأر باستخدام ملقط ومقص في نسيج الثقافة هود. قطع الجلد مفتوحة في مكان الورم باستخدام مقص ثم فصل الورم من الأنسجة السليمة المجاورة باستخدام ملقط ومقص.
    ملاحظة: اعتمادا على الغرض منتجربة أداء هذا والخطوات التالية تحت ظروف معقمة. في هذه الدراسة تم تنفيذ جميع الخطوات في الثقافة هود خلية تحت ظروف معقمة من أجل أن تكون قادرة على زراعة الخلايا.
  4. تحضير عينة الورم لالهضم عن طريق إزالة الدهون (حيث سيؤدي ذلك إلى جعل تعويم العينة) والمناطق الميتة (لأن هذا سيؤدي في جدوى انخفضت) عن طريق خفض بعيدا باستخدام ملقط ومشرط. اللحم المفروم النسيج الى قطع من 2-4 ملم باستخدام المشارط وملقط.
  5. ونقل القطع الأنسجة في أنبوب C تحتوي على مزيج الهضم.
  6. إغلاق C أنبوب، وتأكد من أن يتم إغلاقه بإحكام. نعلق عليه رأسا على عقب على كم من dissociator الأنسجة الفوق وتأكد من أن قطعة نسيج تقع في منطقة الدوار / الموالي.
  7. اختيار وضع "h_tumor_01" عن طريق الضغط على "حتى" أو زر "أسفل" حتى يظهر الوضع في العرض ومن ثم الضغط على زر "البدء".
    1. اذا كنتالغناء وظيفة التدفئة من dissociator الأنسجة الفوق، تأكد من أن نعلق أيضا المدفأة. قم بتشغيل وضع 37C_h_TDK_1 (للأورام الناعمة)، 37C_h_TDK_2 (للأورام متوسطة) أو 37C_h_TDK_3 (للأورام الصلبة) من خلال النقر على رمز مجلد على الشاشة التي تعمل باللمس حتى يظهر المجلد "Miltenyi".
    2. لاختيار نمط، انقر فوق لأعلى أو لأسفل السهم حتى وضع التفكك يتم تمييز 37C_h_TDK_2. وصفت الأكمام من dissociator الأنسجة الفوق كمواقع على شاشة الجهاز. اختيار المناصب يتم تشغيل عينات عن طريق النقر عليها على شاشة اللمس. اضغط على "ابدأ" لتشغيل وضع وتابع الخطوة 2.16.
      ملاحظة: اعتمادا على نوع الورم قد يكون برنامج التفكك آخر مناسب (راجع الخطوة 2.7.1).
  8. مراقبة تظهر نافذة "إنهاء البرنامج" على الشاشة. بعد انتهاء البرنامج، فصل C أنبوب من dissociator الأنسجة الفوق.
  9. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37° مئوية تحت دوران مستمر، على سبيل المثال، باستخدام محور دوار أنبوب.
  10. بعد مرور فترة الحضانة إرفاق C أنبوب رأسا على عقب على كم من dissociator الأنسجة الفوق. تأكد من أن المواد عينة يقع في منطقة الدوار / الموالي مرة أخرى.
  11. تشغيل h_tumor_02 برنامج التفكك (للأورام لينة ومتوسطة) أو h_tumor_01 (للأورام الصلبة) كما هو موضح في الخطوة 2.7.1.
  12. بعد انتهاء البرنامج، فصل C أنبوب من dissociator الأنسجة الفوق.
  13. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت دوران مستمر.
  14. نعلق C أنبوب رأسا على عقب على كم من dissociator الأنسجة الفوق بعد الحضانة. تأكد من أن المواد عينة يقع في منطقة الدوار / الموالي مرة أخرى.
  15. تشغيل h_tumor_03 برنامج التفكك (للأورام الناعمة)، h_tumor_02 (للأورام متوسطة) أو h_tumor_01 (للأورام الصلبة) كما هو موضح في الخطوة 2.7.
  16. لجمع عينات المواد في أسفل أنبوب إجراء شوغ خطوة الطرد المركزي (في 100 x ج لمدة 10 ثانية).
  17. resuspend الخلايا وتنطبق على مصفاة الخلية مع 70 ميكرون حجم نيش وضعت على أنبوب 50 مل. غسل مصفاة الخلية مع 20 مل من RPMI 1640 أو DMEM.
  18. تعليق خلية الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 7 دقائق. نضح طاف تماما.
  19. خلايا resuspend في 5 مل من العازلة للفرز. المضي قدما ماوس استنفاد الخلايا التي فصل الخلية المغناطيسي (القسم 3).

3. ماوس استنفاد الخلية التي كتبها المغناطيسي تقنية فصل الخلايا

ملاحظة: وحدات التخزين لوضع العلامات المغناطيسي الواردة أدناه هي لتصل إلى 2 × 10 6 خلايا الورم أو 10 7 مجموع الخلايا بما في ذلك خلايا الدم الحمراء. اعتمادا على حجم الورم وسيتم الحصول على أقل أو أرقام الهواتف المحمولة أعلى. في حالة الخلايا أقل، واستخدام نفس كميات كما هو محدد. عند استخدام أرقام الهواتف المحمولة أعلى، رفع مستوى كافة وحدات التخزين كاشف وإجمالي حجم وفقا لذلك (على سبيل المثال، لمدة 4 × 10 6 خلايا الورم أو 2 × 10 7 مجموع الخلايا، واستخدام مرتين حجم كافة وحدات التخزين كاشف المشار إليها وإجمالي حجم).

  1. تحديد عدد الخلايا من قسامة من التعليق الخلية في خطوة 2.21 باستخدام المجهر وغرفة مناسبة لفرز الأصوات.
    ملاحظة: عند هذه النقطة يتكون تعليق الخلية من خليط غير متجانس من الخلايا السرطانية البشرية وكذلك انسجة الماوس وخلايا الدم، بما في ذلك خلايا الدم الحمراء. تكوين خلايا تعتمد بقوة على نوع الورم والمنطقة للزرع.
  2. عند إجراء تحليل cytometric تدفق بعد إزالة خلايا فأر تنسحب 100 مكل لأنابيب مناسبة لغير ملوثين واثنين من تحليل تدفق cytometric للون واحد تلطيخ التحكم. تخزينها في الثلاجة في 2-8 درجة مئوية حتى مزيد من الخطوات تلطيخ (القسم 4).
  3. تعليق خلية الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. تجاهل طاف.
  4. بيليه الخلية resuspend في 80 ميكرولتر من العازلة في 2 × 10 6 خلايا الورم أو 10 7مجموع الخلايا إضافة 20 ميكرولتر من العلامات كاشف المغناطيسي للخلايا فأر.
  5. تخلط جيدا واحتضان لمدة 15 دقيقة في الثلاجة (2-8 درجة مئوية). خلال وضع العلامات المغناطيسي، وإعداد الأعمدة واسعة النطاق (LS الأعمدة) للفصل المغناطيسي، عن طريق وضعها في الحقل المغناطيسي للمغناطيس مناسبة (انظر جدول المواد والمعدات) وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة. شطف العمود مع 3 مل من العازلة.
  6. ضبط حجم العينة 500 ميكرولتر باستخدام عازلة لمدة تصل إلى 2 × 10 6 خلايا الورم أو ما يصل إلى 10 7 مجموع الخلايا. (ما يصل إلى 1 × 10 7 خلايا الورم أو ما يصل إلى 5 × 10 7 مجموع الخلايا يمكن معالجتها على العمود LS واحد، وعندما تعمل مع أكثر من الخلايا تقسيم العينة على عدة LS أعمدة).
    1. عند إجراء تحليل cytometric تدفق، التحليل الجزيئي أو مقارنة كسور في الثقافات، سحب قسامة 50 ميكرولتر كما عينة لم يتم فرزها. تخزينها في الثلاجة في 2-8 درجة مئوية حتى مزيد من المعالجة.
  7. تطبيق 500 ميكرولتر من تعليق الخلية على العمود معدة مسبقا. جمع التدفق من خلال تحتوي على الخلايا المستهدفة غير المسماة، تمثل الخلايا السرطانية البشرية المخصب.
    ملاحظة: عند العمل مع أعداد الخلايا أعلى تصل إلى 2.5 مل من تعليق الخلية التي تم إعدادها وفقا للخطوة 3.5 يمكن تطبيقها على عمود واحد.
  8. غسل العمود مع 2 × 1 مل من العازلة. جمع الخلايا التي تمر عبر ويتحد مع التدفق من خلال خطوة 3.6. أداء الغسيل الخطوات بإضافة قسامات العازلة 1 مل في أقرب وقت الخزان عمود فارغ.
    ملاحظة: من خلال تدفق يحتوي على خلايا السرطانية البشرية النقاء.
  9. لجمع أيضا خلايا فأر الاحتفاظ بها في العمود، وإزالة عمود من الفاصل ووضعه على أنبوب مناسبة. ماصة 3 مل من العازلة على العمود وعلى الفور استخدام المكبس لطرد خلايا فأر عن طريق دفع بقوة أنه في العمود.
  10. تدور باستمرار الكسور وعينات المراقبة في 300 x ج لمدة 10 دقيقة. نضح سوبrnatant تماما والخلايا resuspend في العازلة، مستنبت أو تجميد بيليه في النيتروجين السائل، وهذا يتوقف على تطبيق المصب المطلوب.

4. تحليل المصب

  1. تلطيخ لتحليل تدفق Cytometric
    ملاحظة: قبل إجراء المزيد من التحليلات المصب، ويمكن تحليل جزء من الخلايا التي تم الحصول عليها من إجراءات نضوب خلايا الفأر (على سبيل المثال، تقييم نقاء والمحصول) في التدفق الخلوي.
    1. لتحليل تدفق cytometric، وتدور لا يقل عن 10٪ من نسبة السلبية والإيجابية التي تم الحصول عليها من إجراءات الفصل خلية المغناطيسي (القسم 3) وكذلك عينات مراقبة من الخطوة 3.2 و 3.5 في 300 x ج لمدة 10 دقيقة.
    2. تجاهل طاف. resuspend الكرية خلية من العينات تحكم تلطيخ من الخطوة 3.2 في 90 ميكرولتر من العازلة. Resuspend وكسور تم الحصول عليها من إجراءات الفصل خلية المغناطيسي في 80 ميكرولتر من العازلة.
    3. إضافة 10 ميكرولتر من الماوس FCR حجب الكاشف للجميعالعينات. تخلط جيدا واحتضان لمدة 5 دقائق في 2-8 درجة مئوية في الثلاجة.
    4. إضافة 10 ميكرولتر من مكافحة الإنسان EpCAM-PE (يساوي تخفيف الضد من 01:10) و 25 ميكرولتر من مكافحة فأر APC-كوكتيل (يساوي تخفيف الضد من 1: 4) لعينات من الباب 3. إضافة 10 ميكرولتر المضادة -Human EpCAM-PE إلى واحدة العينة الضابطة لون واحد (يساوي تخفيف الضد من 01:10) و 10 ميكرولتر من مكافحة الإنسان EpCAM-APC إلى أخرى (تساوي الأجسام المضادة تخفيف 01:10). تخلط جميع العينات واحتضان لمدة 10 دقيقة في 2-8 درجة مئوية في الثلاجة.
      ملاحظة: EpCAM غير مناسب كعلامة الخلايا السرطانية من أي نوع الورم. لأورام المستخدمة في هذا التعبير دراسة EpCAM كان معروفا.
    5. لغسل العينات، إضافة 1 مل من العازلة كل وتدور في 300 x ج لمدة 5 دقائق.
    6. تجاهل طاف و resuspend بيليه خلية إلى تركيز لتحليل تدفق cytometric. لاستبعاد الخلايا الميتة إضافة يوديد propidium (1 ميكروغرام / مل).
    7. لتحليل cytometric تدفق باستخدام و مناسبةالكريات منخفضة وفقا لبروتوكولات الشركة المصنعة.
  2. زراعة الخلايا السرطانية البشرية
    ملاحظة: بالإضافة إلى قياس التدفق الخلوي، يمكن أن الخلايا التي تم الحصول عليها من إجراءات الفصل أن يكون مثقف واستخدامها لمزيد من فحوصات في المختبر.
    1. Resuspend وجزء مرتبة من قسم 3 في مستنبت إلى تركيز 5 × 10 5 خلية / مل.
      ملاحظة: اعتمادا على نوع طلاء الورم، وكثافة البذر مناسبة، وظروف الزراعة يمكن أن تختلف.
    2. إضافة 500 ميكرولتر من تعليق خلية في الآبار من 24 لوحة جيدا المغلفة مع الجيلاتين 0.1٪.
    3. احتضان الخلايا في حاضنة الثقافة خلية عند 37 درجة مئوية و 5٪.
      ملاحظة: تعتمد شروط الثقافة الأمثل على نوع الورم المستخدمة. لذلك، تطبيق شروط الثقافة المناسبة لنوع الورم المستخدمة.
  3. تلطيخ المناعي للخلايا المزروعة
    1. إعداد عرقلة الحل بإضافة 10٪ FCS و 0.1٪تريتون X-100 لبرنامج تلفزيوني 1X.
    2. مستنبت تجاهل. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X لكل بئر لغسل الخلايا. احتضان لمدة 2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT)، ثم تجاهل برنامج تلفزيوني 1X تماما.
    3. إصلاح الخلايا بإضافة 300 ميكرولتر من 4٪ حل PFA. في احتضان RT لمدة 15 دقيقة.
    4. تجاهل حل PFA. غسل الخلايا الثابتة 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 4.3.2.
    5. أداء permeabilization وحجب بإضافة 300 ميكرولتر من عرقلة لكل بئر. في احتضان RT لمدة 30 دقيقة.
    6. تجاهل عرقلة الحل. غسل الخلايا كما هو موضح في الخطوة 4.3.2.
    7. إضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية مخففة في عرقلة الحل للخلايا. غير المخفف EpCAM الأجسام المضادة 01:40 المناهضة للبشرية، والمخفف فيمنتين الضد 1: 200. احتضان بين عشية وضحاها في 2-8 درجة مئوية.
      ملاحظة: الأجسام المضادة المستخدمة ليست مناسبة لأي نوع الورم كما قد لا يمكن التعبير عنها EpCAM على الخلايا السرطانية و / أو فيمنتين وأعرب أيضا عن طريق الخلايا السرطانية. تأكد من أن الأجسام المضادة المستخدمة هي مناسبة لمو طعم أجنبيديل.
    8. تجاهل حل الأجسام المضادة الأولية. غسل الخلايا 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 4.3.2.
    9. إضافة 300 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المخفف في عرقلة الحل للخلايا. وتضعف كل من الأجسام المضادة، المضادة للأرنب مفتش-Alexe594 ومكافحة فأر مفتش-Alexa488 1: 400. احتضان لمدة 1 ساعة في الظلام في RT.
    10. تجاهل حل الضد الثانوية. غسل الخلايا 2 مرات كما هو موضح في الخطوة 4.3.2.
    11. إضافة 300 ميكرولتر من محلول دابي (0.1 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر. احتضان لمدة 10 دقيقة في الظلام في RT.
    12. تجاهل حل دابي. غسل الخلايا 3 مرات كما هو موضح في الخطوة 4.3.2.
    13. إضافة 500 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X إلى كل بئر. أداء المجهر مضان باستخدام المجهر مناسبة.
  4. كله التسلسل Exome
    1. لكامل exome التسلسل (WES) الكريات تجميد من الخطوة 3.9 في النيتروجين السائل. تخزين وجمع العينات في -80 درجة مئوية.
    2. بعد جمع الخلايا، نفذ اسر exome وكله exome يليهاuencing وفقا لتعليمات الشركة الصانعة لعدة منها (انظر الجدول المواد والمعدات).

النتائج

وقد اقترحت أساليب مختلفة لتحديد أو تستنفد خلايا فأر من الأورام البشرية xenografted، على سبيل المثال مجموعة من الأجسام المضادة الماوس محدد ضد CD45 وMHC من الدرجة الاولى، ولكن تم الكشف عن مجموعات سكانية فرعية فقط من خلايا فأر باستخدام هذه المجموعات في حين أن مزيج المقترحة الكشف عن CD45 وMHC الصف الأول معربا عن خلايا فأر فضلا عن بقية خلايا فأر وجدت في الأنسجة المستهدفة للزرع (الشكل 1). استخدام هذه تركيبة جديدة من الأجسام المضادة للفرز خلية المغناطيسي، والخلايا السرطانية البشرية يمكن أن تكون معزولة مستقلة عن نوع الورم (الشكل 2).

الخلايا التي تم الحصول عليها من فصل الخلية إزالة الخلايا الماوس على أساس إجراء المغناطيسي يمكن أن يكون مثقف، مما يؤدي إلى ثقافات نقية من خلايا السرطانية البشرية (الشكل 4). وبالإضافة إلى ذلك، يمكن الحصول على خلايا فأر قابلة للحياة ومثقف مننفس العينة. إلى جانب إزالة خلايا فأر، وأيضا إزالة الحطام على نضوب خلايا الفأر (MCD) (الشكل 3).

استنزاف شاملة من خلايا فأر وكذلك إزالة الأنقاض تؤدي إلى تحسين التحليلات المصب الجزيئية. وقد تجلى ذلك من خلال مقارنة النتائج المتحصل عليها من كله exome التسلسل (WES) التي أجريت على قطع الورم السائبة وعينات من الخلايا المنضب الماوس من ثلاثة نماذج مختلفة طعم أجنبي الورم المشتقة من المريض (الشكلان 5-9). وتشير البيانات المتوفرة لدينا أن إزالة خلايا فأر قبل تنفيذ WES على عينات الورم طعم أجنبي يزيد ليس فقط إلى حد كبير من المبلغ الإجمالي من يقرأ (الشكل 5)، ولكن أيضا يقلل إلى حد كبير من عدد من المضيف تستمد يقرأ تعيينها إلى الجينوم إشارة البشري (الشكل 6B). ولما كانت هذه الفأرة تعيينها خطأ يقرأ في كثير من الأحيان تتداخل مع دعوة الحزب الوطني الاسكتلندي، لاحظنا انخفاض قوي من المتوقع زوراتعدد الأشكال بعد MCD (الشكلان 7-8). وأخيرا، أظهرنا أن إزالة في سيليكون الماوس المستمدة من يقرأ بطرق المعلوماتية الحيوية لا يمكن أن تحل محل تماما إجراء التجارب، وكان لا لبس فيه على أساس تسلسل مهمة للأنواع الأصلية لا يمكن ليقرأ كل شيء. علاوة على ذلك، في إجراء سيليكون ولم يستطع الصحيح لتعزيز جودة ويصاحب ذلك تغطية قراءة العليا للفي المختبر عينات المنضب (الشكل 9).

figure-results-1
الشكل 1. إنشاء وكوكتيل الضد إدراكا جميع خلايا الفأر في جميع أنحاء متعددة هيئات 14. غربلة في أجهزة متعددة، بما في ذلك الجلد والرئة والدماغ والكلى والعضلات والهيكل العظمي، قد أجريت. وتمثل هذه الأجهزة الأنسجة المستهدفة الرئيسية لزرع الأعضاء. مجموعات مثل تلك مذكرة التفاهم الاعترافوقد تم بالفعل استخدام ذاتها CD45 والطبقة الحواتم معقد التوافق النسيجي الكبير من أجل استنزاف خلايا فأر بعد زرع الأعضاء. ومع ذلك، هذه المجموعات علامة اعترفت مجموعة فرعية فقط من خلايا فأر في جميع الأنسجة تحليلها. في العروض السابقة تم التعرف على مجموعة من خمسة أجسام مضادة السماح للكشف شامل لجميع الخلايا من أصل الماوس. وتشمل هذه اللوحة خلايا الدم الحمراء ومستقلة عن نسيج من أصل (A، B، و لا تظهر البيانات). تعديل من 14. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-2
الشكل 2. استنزاف موثوق وسريع للخلايا الفأر (15). تقارن من مزيج الأجسام المضادة مع ن مغنطيسية مسايرة فائقة superparamagneticواستخدمت anoparticles لوضع بروتوكول الأمثل للنضوب خلايا فأر من xenografts الورم الإنسان من قبل خلية المغناطيسي الفرز (فصل الخلية المغناطيسي) (A). يسمح هذا البروتوكول رواية للقضاء على> 99٪ من تلوث خلايا فأر في أقل من 20 دقيقة، بغض النظر عن نوع الورم. وصفت كسور خلية تم الحصول عليها من إجراءات الفصل خلية المغناطيسي مع كوكتيل عموم الماوس الأجسام المضادة والأجسام المضادة المحددة البشري ضد CD326 (EpCAM) (B). تعديل من 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-3
وقد استخدم الرقم 3. عزل خلايا ورم أرومي دبقي الإنسان. ماوس استنفاد خلية كيت لعزل خلايا ورم أرومي الإنسان من مذكرات التفاهم الكبارالبريد الدماغ. خلال تفكك كميات الأنسجة العصبية عالية من الحطام يتم إنشاؤها عادة. MCDK يستنزف كفاءة الخلايا الميتة والحطام كما يراها مؤامرة تبين حجم الخلية مقابل تحبب الخلايا. مع هذا الكوكتيل المترافقة، كان من الممكن للقضاء على> 99٪ من خلايا فأر تلويث و> 60٪ من الحطام. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-4
الشكل 4. نضوب خلايا الفأر يسهل الثقافات المصب من الخلايا السرطانية البشرية 14. الليفية الماوس في كثير من الأحيان تعرقل زراعة الخلايا السرطانية البشرية بعد تفكك الأنسجة المزروعة أو تؤدي إلى ثقافات غير متجانسة. الليفية إرفاق وتوسيع أكثر كفاءة، وبالتالي زيادة في النمو المستهدف ج ملتعلمي اللغة اإلنكليزية. هذا يشوش في تجارب زراعة الخلية في المختبر (على سبيل المثال، المخدرات السمسة اختبار)، منذ التصحيح الرياضي للآثار الناجمة عن تلوث خلايا فأر من المستحيل في معظم الحالات. كانت سلبية (ب) وكسور الإيجابية (C) بعد نضوب خلايا الفأر تربيتها لمدة ثلاثة أيام، الثابتة والملون لالليفية علامة الفأر معين (فيمنتين) ومحددة البشرية ورم علامة CD326 (EpCAM). كعنصر تحكم، كان جزء الأصلي تحتوي على خلايا unseparated (A) مثقف وملطخة كذلك. حتى بعد ثلاثة أيام من الثقافة، لوحظ وجود السكان نقية تقريبا من الخلايا السرطانية البشرية في جزء سلبي (B)، في حين كان جزء لم يتم فرزها (A) متضخمة تقريبا من الخلايا الليفية. فقد سوى جزء صغير من الخلايا المستهدفة للجزء إيجابي (C). تعديل من 14.ge.jpg مرحبا "الهدف =" _ فارغة "> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-5
الرقم 5. الجامع Exome التسلسل (WES) من عينات الورم قبل وبعد استنفاد ماوس الخليوي (MCD) 15. أجرينا WES على ثلاثة نماذج طعم أجنبي المختلفة المستمدة من الكلى الإنسان والرئة وسرطان المثانة من أجل تقييم أثر MCD على جودة البيانات التسلسل من الجيل التالي. تم استخدام الحمض النووي من ورم بالجملة ومن الخلايا السرطانية معزولة بعد نضوب الخلية الماوس لإنشاء مكتبات التسلسل الملتقطة exome بتطبيق عدة أسر exome. لتسلسل على صك المنظم سطح المكتب، المنظم سطح المكتب كاشف عدة دورات 150، واستخدمت لتوليد 75-BP إقران نهاية يقرأ. زيادة كبيرة (ف <0.05) في كثافة الكتلة (A) وكذلك افيوقد لوحظ زيادة الغضب في التهم قراءة من 33٪ (ب) لعينات المنضب من خلايا فأر، مشيرا إلى تحسين جودة العينة. في المقابل، يمكن أيضا أظهرت انخفاضا قويا من الحطام والخلايا الميتة على MCD بواسطة تحليل التدفق الخلوي (انظر الشكل 3). تعديل من 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-6
الشكل 6. ماوس خلية نضوب (MCD) يقلل بشدة عدد ماوس المعينة خطأ يقرأ بعد الجامع Exome التسلسل (WES) 15. وأليغنوكليوتيد القبض تستخدم لتخصيب المستهدفة من تسلسل تشفير البروتين صممت على أساس الجينوم البشري، وهو ما قبل الأولي إثراء شظايا الحمض النووي من الاب أصل الإنسانام كان من المتوقع خليط من الماوس والخلايا البشرية. من أجل تقييم عدد من أليغنوكليوتيد التقاط قد عبور-هجن مع الماوس الحمض النووي الجيني، أجرينا عمليات البحث انفجار من كل السريع التحقيق القبض على exome واحد ضد جينوم الفأر. استخدمت المعلمات المحاذاة مما أدى إلى تحديد الممكن عبر التهجين. (.. طول المحاذاة، لا من عدم التطابق، أي من الثغرات) اعتمادا على عتبات الاختيار، وتوقعنا بعد عبر التفاعل من 5-10٪ من تحقيقات التقاط مع النصوص الماوس (لا تظهر البيانات). بعد لقطة محول (trimmomatic v0.32 16)، ونحن تعيين يقرأ من جميع العينات ضد الجينية للإنسان والفأر (التحالف v0.7.12 17)، وتحديد مصدرها المفترض استنادا إلى معايير المواءمة منها (لينكس قذيفة، سطر الأوامر بيرل) (A). ويعزى ما معدله 12٪ من يقرأ المستمدة من عينات الورم السائبة لخلايا فأر. يمكن تخفيض هذا المبلغ إلى 0.3٪ بسبب استنزاف مسبق من خلايا فأر (B ). كما في المتوسط ​​15٪ من يقرأ تعيينها خطأ في الجينوم البشري، أي ما يعادل 1.9٪ من مجموع يقرأ في عينات الورم الأكبر والمستمدة من الماوس 0.04٪ في الخلايا السرطانية معزولة، له تأثير إيجابي قوي من نضوب الخلية الماوس على تحليلات المصب يمكن أن يتوقع. الشكل 6B يجسد التنازل قراءة مفصلة لورم الأكبر والخلايا السرطانية البشرية معزولة المستمدة من طعم أجنبي سرطان المثانة. تعديل من 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

figure-results-7
الرقم 7. MCD يقلل بشدة عدد من تعدد الأشكال وتوقع زورا (15). ومن أجل تحديد أثر الماوس يقرأ تعيينها إلى الجينوم البشري، توصلنا إلى عدد من predicteتعدد الأشكال د لعينات طعم أجنبي قبل وبعد MCD. كما كانت لا الأنسجة السليمة المتاحة للمقارنة، تم تعريف SNP كما فرق بين عينة متسلسلة والجينوم المرجعية (hg19). بعد يقرأ إزالة مكررة، وقد أجريت SNP وINDEL الدعوة 18 واقتصر على المناطق المستهدفة من قبل عدة أسر exome. 63 ± 10٪ من جميع تعدد الأشكال وتوقعت للم يعد الكشف عن عينات الورم السائبة بعد نضوب خلايا الفأر، كانت 18 ± 1٪ المحددة للخلايا السرطانية البشرية معزولة (A). بينما في السابق والناجمة أساسا عن طريق الماوس تعيينها خطأ يقرأ بدا هذا الأخير ليتم الكشف عن نتيجة لارتفاع تعداد القراءة وتغطية أعلى وفقا لذلك في عينات من الخلايا السرطانية البشرية معزولة. كان هذا التأثير لINDELs توقع (ب) واضحة أيضا. تعديل من 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الشكل.

figure-results-8
الرقم 8. MCD يحسن تنبؤ عالية التأثير تعدد الأشكال (15). (A) أثر MCD على التنبؤ SNP داخل اكسون تشفير البروتين من الجين POLA1 يتجلى 19. في حين الماوس تعيينها خطأ يقرأ تسبب في عدد من تعدد الأشكال وتوقع زورا في معظم طعم أجنبي سرطان الكلى، وهذه تعدد الأشكال في عداد المفقودين بعد MCD. وبالإضافة إلى ذلك، وتحسين MCD أيضا التنبؤ عالية التأثير تعدد الأشكال. على سبيل المثال، يقرأ الماوس تعيينها إلى الجينوم البشري مرجع في عينة الورم السائبة أسفر عن تدمير توقع خطأ من كودون بداية الجين GRIA3 (B). تعديل من 15. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الصورة = "jove_content" FO: المحافظة على together.within الصفحات = "1"> figure-results-9
يقرأ الرقم 9. في السيليكو استنفاد ماوس المشتقة لا يمكن استبدال تماما أنا ن المختبر MCD 15. ويقرأ يتوقع أن تكون من أصل الماوس أزيلت حسابيا من تسلسل البيانات، وتكررت SNP الاستدعاء. من خلال هذا النهج، وعدد من تعدد الأشكال وتوقع لعينات الورم السائبة انخفض بشكل كبير من 63٪ إلى 8.5٪ من العدد الإجمالي للتعدد الأشكال (قارن مع الشكل 8). ومع ذلك، هذا في نهج سيليكون لا يمكن أن تحل تماما محل في المختبر MCD، لا سيما إذا تعتبر تحسين نوعية العينة ويصاحب ذلك زيادة في التهم القراءة والتغطية. تعديل من 15."_blank"> اضغط هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

المناقشة

لقد قمنا بتطوير طريقة سريعة وسهلة لعزل تمس الخلايا السرطانية البشرية من أنسجة الورم xenografted. ويستند هذا الإجراء على استنزاف شامل لخلايا المنشأ الماوس عن طريق الجمع بين تفكك النسيج الآلي والفرز خلية المغناطيسي. إلى جانب استنزاف جميع خلايا فأر أيضا على كمية من الخلايا الميتة والحطام وانخفاض كبير في نسبة الخلايا المستهدفة. معا، وهذه الطريقة تحسن كبير تحليلات المصب الجزيئية وزراعة الخلايا السرطانية البشرية.

وعلى النقيض من الطرق البديلة، ليست هناك حاجة لمعرفة علامات معينة الخلايا السرطانية، والتكيف مع تركيبة خلايا فأر أو إنشاء خوارزميات مختلفة. الطريقة المعروضة مستقل من سلالة الماوس ونوع الورم. ولذلك، فإن التحيز من خلال عزل القطعان السرطانية البشرية على أساس علامات محددة بشرية واحدة والتي قد تختلف في التعبير، كما هو مبين لEpCAM 11، هو تجنبأد. وعلاوة على ذلك، فإنه لا يقتصر على المواد الورم ولكن يمكن استخدامها لأي نوع من الأنسجة xenotransplanted كما يتم استهداف خلايا فأر بدلا من القطعان محددة السرطانية البشرية (لا تظهر البيانات).

ومما يسهل إزالة شاملة من خلايا فأر من خلال استهداف الحواتم سطح أعرب حصرا على خلايا المنشأ الماوس. وبصرف النظر عن طريقة راسخة للتفكك الورم كما وردت في هذه الدراسة، أن هناك العديد من الإجراءات باستخدام أنواع مختلفة من الإنزيمات. الحفاظ على الحواتم سطح الخلية هو شرط مسبق لهذا الأسلوب الرواية، ولكن أيضا لإجراء تحليل دقيق للسكان الخلايا السرطانية البشرية. لذا، فمن الأهمية بمكان أن يتم استخدام الإنزيمات لطيف لهضم أنسجة الورم. وهكذا، واستنفاد الخلايا الماوس يمكن أن تستخدم إلا في تركيبة مع إجراءات عملية الهضم الأنزيمية التي من الواضح لا تؤثر الحواتم المستهدفة خلال إجراء نضوب خلايا الفأر. في حالة الشك هذه لا يمكن التحقق منها من قبل الشركة المصنعة منها.

هذا الأسلوب يعمل أيضا لتعميم الخلايا السرطانية البشرية (CTCs). لكن، وكما ترددات الخلايا المستهدفة هي عادة <0.1٪ من إزالة خلايا فأر يتطلب بالإضافة إلى أحمر تحلل خلايا الدم ودرجات نقاء أكثر من 50٪ لا يمكن أن يتوقع. في هذه الحالة، واستنفاد الخلايا الماوس يمكن أن تستخدم قبل إثراء CTCs تليها تخصيب باستخدام علامات إيجابية (لا تظهر البيانات).

إزالة خلايا فأر تحسن كبير في الثقافة من الخلايا السرطانية البشرية عن طريق تجنب اكتسى ثقافة الخلايا الليفية الماوس. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحسين تحليل xenografts ورم الإنسان من قبل الجيل القادم التسلسل بشكل كبير وموحدة. كما لوحظ هذا التأثير على الرغم من أن تستهدف الإنسان اختيار تسلسل معين نفذت خلال تخصيب exome، ومن المتوقع أن تكون أكثر بروزا وتأثيرا على الجينوم كله وكله Transcriptome على التسلسل.

وعلاوة على ذلك، فإن الطريقة المعروضة يسهل ACCURAالدراسات الجزيئية الشركة المصرية للاتصالات من القطعان ورم داخل الأورام الإنسان xenotransplanted. إزالة خلايا فأر من عينة منها في الخطوة الأولى، وبعد ذلك فرز الخلايا السرطانية البشرية في اثنين من القطعان مختلفة تمكن المقارنة الجزيئية مباشرة للحيوانية الورم التي تهم معظم البشري الخلايا السرطانية 20. التعبير الجيني الفرق بين أنواع فرعية الخلايا السرطانية يمكن تقييم أكثر موثوقية لا يتأثر بها عبر التهجين من الجزيئات المستمدة من الماوس.

الإفصاحات

ديفيد أغوركو، ستيفان توميوك، ستيفان وايلد، سيلفيا روبيرج، ليزا زتريب أندرياس بوسيو، أولاف هاردت هم أو كانوا موظفين في شركة Miltenyi Biotec GmbH في ألمانيا. كيرستين كلينجنر وجوليا شولر موظفان في شركة Oncotest GmbH ، ألمانيا.

شكر وتقدير

نحن ممتنون لجانينا كول ونادين تشيليوس وبترا كوسمان ولينا ويلنو ودوروثي لينهارد على المساعدة الفنية الممتازة.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجموعة تفكك الورم ،Miltenyi Biotecالبشرية 130-095-929يحتوي على إنزيمات H و R و A ؛ انظر ورقة البيانات للحصول على تعليمات إعادة التكوين
RPMI 1640BiowestL0501-500
gentleMACS C-TubesMiltenyi Biotec130-096-334
gentleMACS Octo Dissociator مع سخاناتMiltenyi Biotec130-096-427
MACS SmartStrainer (70 & micro; م)Miltenyi Biotec130-098-462
طبق بتري 100 مم
طقم استنفاد خلايا الفأر
PBSاستخدام مختلف1x PBS للمخزن المؤقت PEB
BSAMiltenyi Biotec130-091-376أو استخدم 5 مجم / لتر BSA في أعمدة PEB العازلة
MACS LSMiltenyi Biotec130-042-401
فاصل QuadroMACSMiltenyi Biotec130-090-976
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
PreSep (70 & micro; م)Miltenyi Biotec130-095-823
MACSmix أنبوب دوارMiltenyi Biotec130-090-753
CD326-FITC ،Miltenyi Biotecالبشري 130-080-301استخدام 1:40 لتلوين التألق المناعي   ؛
الأجسام المضادة للفيمنتينabcamab92547
الماعز المضادة للفأر IgG-Alexa488Life TechnologiesA11029
الماعز المضاد للأرانب IgG-Alexa594Life TechnologiesA11012
DAPISigma-AldrichD9542مخفف إلى تركيز نهائي يبلغ 0.1 وميكرو ؛ جم / مل في 0.1 م بيكربونات الصوديوم   ؛
يمكن استخدام مجموعة البقع الداخليةMiltenyi Biotec130-090-477InsideFix من هذه المجموعة لخطوة التثبيت أثناء تلطيخ التألق المناعي  
FBSمختلف
Triton X-100   ؛كاشف حجب Sigma-Aldrich93418
FcR ، ماوسMiltenyi Biotec130-092-575
الجيلاتينSigma-AldrichG2500-100g
مجموعة التخصيب السريع NexteraIlluminaFC-140-1000
MiSeq Reagent Kit v3IlluminaMS-102-3001
مشرط مختلف المختلفة Miltenyi Biotec 130-104-694 EDTA Sigma-Aldrich 3610 استخدام التركيز النهائي ل 2 ملي مولار في المخزن المؤقت PEB مرشحات

المراجع

  1. Daniel, V. C., et al. A primary xenograft model of small-cell lung cancer reveals irreversible changes in gene expression imposed by culture in vitro. Cancer Res. 69 (8), 3364-3373 (2009).
  2. Tentler, J. J., et al. Patient-derived tumour xenografts as models for oncology drug development. Nat Rev Clin Oncol. 9 (6), 338-350 (2012).
  3. DeRose, Y. S., et al. Tumor grafts derived from women with breast cancer authentically reflect tumor pathology, growth, metastasis and disease outcomes. Nat Med. 17 (11), 1514-1520 (2011).
  4. Siolas, D., Hannon, G. J. Patient-derived tumor xenografts: transforming clinical samples into mouse models. Cancer Res. 73 (17), 5315-5319 (2013).
  5. Wong, S. Q., et al. Targeted-capture massively-parallel sequencing enables robust detection of clinically informative mutations from formalin-fixed tumours. Sci Rep. 3, 3494(2013).
  6. Sausville, E. A., Burger, A. M. Contributions of human tumor xenografts to anticancer drug development. Cancer Res. 66 (7), 3351-3354 (2006).
  7. Rubio-Viqueira, B., Hidalgo, M. Direct in vivo xenograft tumor model for predicting chemotherapeutic drug response in cancer patients. Clin Pharmacol Ther. 85 (2), 217-221 (2009).
  8. Reubinoff, B. E., Pera, M. F., Fong, C. Y., Trounson, A., Bongso, A. Embryonic stem cell lines from human blastocysts: somatic differentiation in vitro. Nat Biotechnol. 18 (4), 399-404 (2000).
  9. Merk, J., Rolff, J., Becker, M., Leschber, G., Fichtner, I. Patient-derived xenografts of non-small-cell lung cancer: a pre-clinical model to evaluate adjuvant chemotherapy. Eur J Cardiothorac Surg. 36 (3), 454-459 (2009).
  10. Baiocchi, M., Biffoni, M., Ricci-Vitiani, L., Pilozzi, E., De Maria, R. New models for cancer research: human cancer stem cell xenografts. Curr Opin Pharmacol. 10 (4), 380-384 (2010).
  11. Gires, O., Stoecklein, N. H. Dynamic EpCAM expression on circulating and disseminating tumor cells: causes and consequences. Cell Mol Life Sci. 71 (22), 4393-4402 (2014).
  12. Zhang, C. C., et al. Synergistic effect of the gamma-secretase inhibitor PF-03084014 and docetaxel in breast cancer models. Stem Cells Transl Med. 2 (3), 233-242 (2013).
  13. Boven, E., et al. Phase II preclinical drug screening in human tumor xenografts: a first European multicenter collaborative study. Cancer Res. 52 (21), 5940-5947 (1992).
  14. Agorku, D., Hardt, O., Bosio, A. Depletion of mouse cells from human tumor xenografts significantly reduces bias in molecular analysis and improves culture of target cells. Abstract 95. , AACR. (2014).
  15. Agorku, D., et al. Next-generation sequencing of human tumor xenografts is significantly improved by prior depletion of mouse cells. Abstract 1455. , AACR. (2015).
  16. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  17. Li, H., Durbin, R. Fast and accurate short read alignment with Burrows-Wheeler transform. Bioinformatics. 25 (14), 1754-1760 (2009).
  18. Koboldt, D. C., Larson, D. E., Wilson, R. K. Using VarScan 2 for Germline Variant Calling and Somatic Mutation Detection. Curr Protoc Bioinformatics. 44, (2013).
  19. Robinson, J. T., et al. Integrative genomics viewer. Nat Biotechnol. 29 (1), 24-26 (2011).
  20. Aloia, A., et al. The sialyl-glycolipid stage-specific embryonic antigen 4 marks a subpopulation of chemotherapy-resistant breast cancer cells with mesenchymal features. Breast Cancer Res. 17 (1), 146(2015).

إعادة الطباعة والأذونات

استكشف المزيد من المقالات

خلايا الورم البشريةاستنزاف خلايا الفأرفرز الخلايا مغناطيسياًتفكيك الأنسجةعزل الخلاياقياس التدفق الخلويجهاز تفكيك الأنسجة المكتبيمحلول PB المنظم
نضوب خلايا الفأر من Xenografts ورم الإنسان يحسن بشكل ملحوظ تحليل المصب من الخلايا المستهدفة
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.