تم وصف فحصين للفحص عالي الإنتاجية القائم على الفحص المجهري للعوامل المضيفة المشاركة في عدوى البروسيلا. يكتشف مقايسة الإدخال عوامل المضيف المطلوبة لإدخال Brucella ومقايسة نقطة النهاية تلك المطلوبة للنسخ المتماثل داخل الخلايا. على الرغم من تطبيقه على الأساليب البديلة ، يتم استخدام فحص siRNA في خلايا HeLa لتوضيح البروتوكولات.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
أنواع البروسيلا هي مسببات الأمراض داخل الخلايا الاختيارية التي تصيب الحيوانات مثل مضيفيهم الطبيعي. انتقال إلى البشر هو سبب الأكثر شيوعا عن طريق الاتصال المباشر مع الحيوانات المصابة أو عن طريق تناول الطعام الملوث، ويمكن أن تؤدي إلى التهابات مزمنة خطيرة.
البروسيلا يمكن أن تغزو الخلايا البلعمية المهنية وغير المهنية ونسخ متماثلة داخل الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) فجوات -derived. لا تزال العوامل المضيفة اللازمة لدخول البروسيلا في الخلايا المضيفة، وتجنب تدهور الليزوزومية، وتكرارها في حجرة مثل ER مجهولة إلى حد كبير. نحن هنا وصف تحليلين لتحديد العوامل المضيفة المعنية في دخول البروسيلا وتكرارها في خلايا هيلا. تصف البروتوكولات استخدام تدخل الحمض النووي الريبي، بينما يمكن تطبيق أساليب فحص بديلة. وتستند فحوصات للكشف عن البكتيريا fluorescently المسمى في الخلايا المضيفة fluorescently المسمى باستخدام الآليالمجهر واسعة المجال. ويتم تحليل الصور الفلورسنت باستخدام خط أنابيب تحليل صورة موحدة في CellProfiler الذي يسمح واحد خلية القاعدة عدوى التهديف.
في فحص نقطة النهاية، يتم قياس تكرار داخل الخلايا بعد يومين من الإصابة. وهذا يسمح للبكتيريا حركة المرور إلى مكانة تنسخي من حيث بدأ انتشار حوالي 12 ساعة بعد دخول البكتيريا. البروسيلا التي أنشأت بنجاح المتخصصة داخل الخلايا وبالتالي انتشرت بقوة داخل الخلايا المضيفة. منذ البكتيريا داخل الخلايا سوف يفوق عدد كبير الفردية البكتيريا غير تنسخي خارج الخلية أو الخلايا، مما يشكل ضغطا التعبير جوهري GFP يمكن استخدامها. ثم يتم استخدام إشارة GFP قوية لتحديد الخلايا المصابة.
في المقابل، لفحص دخول لا بد من التفريق بين داخل وخارج الخلية البكتيريا. هنا، يتم استخدام ترميز سلالة لGFP التتراسيكلين محرض. الحثمن GFP مع تعطيل وقت واحد من البكتيريا خارج الخلية التي كتبها جنتاميسين يمكن التفريق بين داخل وخارج الخلية البكتيريا بناء على إشارة GFP، مع البكتيريا داخل الخلايا الوحيدة أن تكون قادرة على التعبير عن GFP. وهذا يسمح للكشف قوية من البكتيريا داخل الخلايا واحدة قبل بدأ انتشار الخلايا.
المقدمة
أنواع البروسيلا هي سلبية الغرام، مسببات الأمراض داخل الخلايا الاختيارية التي تنتمي إلى فئة α-متقلبات. أنها تسبب الإجهاض والعقم في مضيفيهم الطبيعية مثل الأبقار والماعز والأغنام أو مما أدى إلى خسائر اقتصادية حادة في المناطق الموبوءة. الحمى المالطية هي واحدة من الأمراض الحيوانية المنشأ أهم مما تسبب في أكثر من نصف مليون إصابة بشرية جديدة سنويا 1 في جميع أنحاء العالم. سبب انتقال العدوى إلى الإنسان الأكثر شيوعا عن طريق الاتصال المباشر مع الحيوانات المصابة أو عن طريق تناول طعام ملوث مثل الحليب غير المبستر. أعراض المرض الحمى غير محددة، مما يسبب صعوبات في تشخيص الحمى المالطية. وإذا لم يعالج، يمكن للمرضى تطوير عدوى مز....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
ملاحظة: يجب أن يؤديها كل عمل مع الحية سلالات المجهضة البروسيلا داخل مختبر مستوى السلامة الحيوية 3 (BSL3) النظر في جميع اللوائح اللازمة واحتياطات السلامة.
1. إعداد لوحات الفحص والتثقيف من البكتيريا والخلايا
- التحضير للثقافات كاتب البروسيلا المجهضة
- خط البروسيلا المجهضة 2308 (B. المجهضة) من -80 ° C الأسهم الحليب على لوحة زيتية الصويا آجار (TSA) يحتوي ع....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
ويبين الشكل 1A مثال على تحليل الصور المستخدمة لتحديد الخلايا المصابة تلقائيا في فحص نقطة النهاية. وقد تم تحديد نوى خلايا هيلا ملطخة دابي، حسبت على النواة المحيطة من عرض 8 بكسل المحيطة النواة، وخلايا الجسم Voronoi بالتبعية للنواة بنسبة 25 بكسل. منذ البكتيريا تتكاثر بشكل رئيسي في الفضاء شبه النووي، وشدة GFP في هذا المجال من الخلية هي قياس أقوى للتمييز بين الخلايا المصابة وغير المصابة. في بعض الحالات، تم العثور على البكتيريا على التكا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
طورت مسببات الأمراض البكتيرية العديد من الاستراتيجيات لمعالجة الخلايا المضيفة حقيقية النواة لصالحها. غالبا ما تظهر مسببات الأمراض المسببة للالتهابات الحادة تكثرا سريعا مصحوبا بقلق كبير لجهاز المناعة وفقدان صلاحية الخلايا المصابة للحياة. في المقابل ، تمكنت البروسيلا ومسببات الأمراض الأخرى التي تسبب الالتهابات المزمنة من إنشاء تفاعلات طويلة الأمد داخل الخلايا المضيفة. لذلك ، تحتاج البكتيريا إلى ضبط وظائف الخلايا المضيفة لصالحها دون تعطيل التوازن الخلوي. تتمثل الإستراتيجية الشائعة لتحديد عوامل الخلية المضيفة المشار.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
تم دعم هذا العمل من خلال المنح 51RT 0_126008 و 51RTP0_151029 لمشروع البحث وتطوير التكنولوجيا (RTD) InfectX و TargetInfectX ، على التوالي ، في إطار SystemsX.ch ، المبادرة السويسرية لبيولوجيا الأنظمة. نحن نقدر 310030B_149886 المنح من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF). تم دعم عمل S.H.L و A.C. من قبل برنامج الدكتوراه الدولي "زمالات التميز" في Biozentrum. تم الاعتراف ب Simone Muntwiler للمساعدة الفنية. نود أن نشكر ديرك بومان على توفير pNF106 وجان سيلي ل pJC43 و pJC44.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| تريبتيك فول الصويا أجار (TSA) | دينار | بحريني 236950 | |
| مرق الصويا الترابتي (TSB) | فلوكا | 22092 | |
| كبريتات كاناميسين | سيجما ألدريتش | 60615 | |
| حليب | |||
| 250 مل زجاجة غطاء لولبي | كورنينج | 8396 | |
| DMEM | سيجما ألدريتش | D5796 | |
| الجنين مصل ربلة الساق (FCS) | Gibco | 10270 | |
| Trypsin-EDTA معطل بالحرارة (0.5٪) | Gibco | 15400-054 | محلول مخزون 10x ، مخفف 1:10 في PBS |
| Scepte 2.0 Cell Counter | Merck Milipore | PHCC20060 | يمكن استخدام أجهزة عد الخلايا البديلة |
| Greiner CELLSTAR 384-well لوحة | Sigma-Aldrich | M2062 | |
| رقائق الألومنيوم القابلة للنزع | Costar | 6570 | |
| موزع الكاشف: "موزع كاشف Multidrop 384" يمكن | استخدام موزع الكاشف | البديل 5840150 Thermo Scientic | |
| كاشف التعداد: "Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | |
| غسالة الألواح الآلية: "غسالة الألواح ELx50-16" | BioTek | ELX5016 | تحتوي غسالة الألواح هذه على مشعب من 16 قناة مناسب لألواح 384 بئرا. تتناسب مع خزانة السلامة الحيوية ولها غطاء يغطي اللوحة أثناء الغسيل مما يقلل من خطر إنتاج الهباء الجوي. يمكن استخدام غسالات الألواح البديلة ذات الميزات المماثلة. |
| جنتاميسين | سيجما ألدريتش | G1397 | |
| أنهيدروتتراسيكلين هيدروكلوريد | سيجما ألدريتش | 37919 | 100 &# 956 ؛ يتم الاحتفاظ بمحلول جم / مل في الإيثانول بنسبة 100٪ عند -20 درجة ؛ C محمي من الضوء في رقائق الألومنيوم |
| PBS | Gibco | 20012 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | يذوب في عازلة HEPES 0.2 M ، درجة الحموضة 7.4. يخزن في -20 درجة ؛ C ويذوب طازجا في اليوم السابق للاستخدام. تحذير ، PFA سام عن طريق الاستنشاق ، عند ملامسة الجلد وفي حالة ابتلاعها. |
| هيبس | سيجما ألدريتش | H3375 | |
| تريتون X-100 | سيجما ألدريتش | T9284 | |
| دابي | روش | 10236276001 | |
| مخفوق siRNA | Dharmacon | D-001810-10 | |
| Kif11 siRNA | Dharmacon | L-003317-00 | |
| ARPC3 siRNA | Dharmacon | L-005284-00 | |
| Brucella abortus 2308< / em> | |||
| pJC43 (apHT:: GFP< / em>) | Celli et al.< / em>12< / sup> | ||
| pAC042.08 (apht: :d sRed ، tetO :: tetR-GFP< / em>) | البناء: pJC44 4< / sup> تم هضمه باستخدام EcoRI متبوعا بتوليد نهايات حادة مع إنزيم Klenov والهضم اللاحق مع SalI. تم تضخيم TetR-GFP من pNF106 باستخدام التمهيدي prAC090 و prAC092. بعد الهضم باستخدام SalI ، تم ربط منتج TetR-GFP بناقل pJC44 المهضوم. | ||
| برايمر prAC090 | سيجما ألدريتش | ، TTT ، TTG ، AAT ، TCT ، GGC ، AAT ، TCC ، GC ، TAA ، GAA ، ACC | |
| ، Primer prAC092 | ، Sigma-Aldrich | ، TTT TTG ، TCG ، ACT TTG ، TCC ، TCA ، TCA ، GGA GAG ، CGT TC | |
| ، HeLa CCL-2 | ATCC | ، CCL-2 | |
| ، ImageXpress | الجزيئية الدقيقة ؛ | IXM IMAGING MSCOPE | مجهر تصوير خلوي آلي مجهز بمرحلة Z بمحرك دقيق. يمكن استخدام أنظمة بديلة للفحص المجهري الآلي والمكونات البديلة للبرامج الصلبة والبرامج المحددة أدناه. |
| السرعة بالليزر التلقائي | للتركيز التلقائي | 1-2300-1037 | |
| CFI Super Fluor 10X الهدف | نيكون | MRF00100 | NA 0.50 ، WD 1.20 مم ، DIC Prism: 10X ، القياسات الضوئية المحملة بنابض |
| CoolSNAP HQ أحادية اللون CCD الكاميرا | الأجهزة الجزيئية ؛ | 1-2300-1060 | 1,392 × 1,040 بكسل تصوير ، 6.45 × 6.45 وميكرو ؛ م بكسل ، 12 بت رقمنة |
| برنامج MetaXpress | الأجهزة الجزيئية ؛ | 9500-0100 | |
| محرك LUI-Spectra-X-7 | Lumencor | SPECTRA X V-XXX-YZ | الخفيف. يتم استخدام مصادر الضوء التالية: البنفسجي (DAPI) ، السماوي (GFP) ، الأخضر / الأصفر (RFP) المثير |
| أحادي النطاق ل DAPI | Semrock | FF01-377 / 50-25 | |
| أحادي النطاق ل DAPI | Semrock | FF02-447 / 60-25 | |
| أحادي النطاق ل DAPI | Semrock | FF409-Di03-25x36 | |
| أحادي النطاق ل GFP | Semrock | FF02-472 / 30-25 | |
| باعث النطاق الفردي ل GFP | Semrock | FF01-520 / 35-25 | |
| اللون أحادي النطاق ل GFP | Semrock | FF495-Di03-25x36 | |
| أحادي النطاق ل RFP | Semrock | FF01-562 / 40-25 | |
| أحادي النطاق ل RFP | Semrock | FF01-624 / 40-25 | |
| اللون أحادي النطاق ل RFP | Semrock | FF593-Di03-25x36 |
المراجع
- Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
- Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
استكشف المزيد من المقالات
