فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في البروسيلا إصابة خلايا هيلا

Alain Casanova; Shyan H. Low; Mario Emmenlauer; Raquel Conde-Alvarez; Suzana P. Salcedo; Jean-Pierre Gorvel; Christoph Dehio

doi:10.3791/54263

مقالة منهجية

فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في البروسيلا إصابة خلايا هيلا

DOI:

10.3791/54263

⸱

أغسطس 5, 2016

Alain Casanova^*¹ , Shyan H. Low^*¹ , Mario Emmenlauer^*¹^,⁴ , Raquel Conde-Alvarez^*¹^,³ , Suzana P. Salcedo² , Jean-Pierre Gorvel² , Christoph Dehio¹

¹Focal Area Infection Biology, Biozentrum, University of Basel, ²Centre d’Immunologie de Marseille-Luminy, Université de la Méditérannée UM2, INSERM U1104 CNRS UM7280, ³Departmento de Microbiologìa and Instituto de Salud Tropical, Universidad de Navarra, ⁴BioDataAnalysis GmbH

^* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم وصف فحصين للفحص عالي الإنتاجية القائم على الفحص المجهري للعوامل المضيفة المشاركة في عدوى البروسيلا. يكتشف مقايسة الإدخال عوامل المضيف المطلوبة لإدخال Brucella ومقايسة نقطة النهاية تلك المطلوبة للنسخ المتماثل داخل الخلايا. على الرغم من تطبيقه على الأساليب البديلة ، يتم استخدام فحص siRNA في خلايا HeLa لتوضيح البروتوكولات.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنواع البروسيلا هي مسببات الأمراض داخل الخلايا الاختيارية التي تصيب الحيوانات مثل مضيفيهم الطبيعي. انتقال إلى البشر هو سبب الأكثر شيوعا عن طريق الاتصال المباشر مع الحيوانات المصابة أو عن طريق تناول الطعام الملوث، ويمكن أن تؤدي إلى التهابات مزمنة خطيرة.

البروسيلا يمكن أن تغزو الخلايا البلعمية المهنية وغير المهنية ونسخ متماثلة داخل الشبكة الإندوبلازمية (أوروبا) فجوات -derived. لا تزال العوامل المضيفة اللازمة لدخول البروسيلا في الخلايا المضيفة، وتجنب تدهور الليزوزومية، وتكرارها في حجرة مثل ER مجهولة إلى حد كبير. نحن هنا وصف تحليلين لتحديد العوامل المضيفة المعنية في دخول البروسيلا وتكرارها في خلايا هيلا. تصف البروتوكولات استخدام تدخل الحمض النووي الريبي، بينما يمكن تطبيق أساليب فحص بديلة. وتستند فحوصات للكشف عن البكتيريا fluorescently المسمى في الخلايا المضيفة fluorescently المسمى باستخدام الآليالمجهر واسعة المجال. ويتم تحليل الصور الفلورسنت باستخدام خط أنابيب تحليل صورة موحدة في CellProfiler الذي يسمح واحد خلية القاعدة عدوى التهديف.

في فحص نقطة النهاية، يتم قياس تكرار داخل الخلايا بعد يومين من الإصابة. وهذا يسمح للبكتيريا حركة المرور إلى مكانة تنسخي من حيث بدأ انتشار حوالي 12 ساعة بعد دخول البكتيريا. البروسيلا التي أنشأت بنجاح المتخصصة داخل الخلايا وبالتالي انتشرت بقوة داخل الخلايا المضيفة. منذ البكتيريا داخل الخلايا سوف يفوق عدد كبير الفردية البكتيريا غير تنسخي خارج الخلية أو الخلايا، مما يشكل ضغطا التعبير جوهري GFP يمكن استخدامها. ثم يتم استخدام إشارة GFP قوية لتحديد الخلايا المصابة.

في المقابل، لفحص دخول لا بد من التفريق بين داخل وخارج الخلية البكتيريا. هنا، يتم استخدام ترميز سلالة لGFP التتراسيكلين محرض. الحثمن GFP مع تعطيل وقت واحد من البكتيريا خارج الخلية التي كتبها جنتاميسين يمكن التفريق بين داخل وخارج الخلية البكتيريا بناء على إشارة GFP، مع البكتيريا داخل الخلايا الوحيدة أن تكون قادرة على التعبير عن GFP. وهذا يسمح للكشف قوية من البكتيريا داخل الخلايا واحدة قبل بدأ انتشار الخلايا.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أنواع البروسيلا هي سلبية الغرام، مسببات الأمراض داخل الخلايا الاختيارية التي تنتمي إلى فئة α-متقلبات. أنها تسبب الإجهاض والعقم في مضيفيهم الطبيعية مثل الأبقار والماعز والأغنام أو مما أدى إلى خسائر اقتصادية حادة في المناطق الموبوءة. الحمى المالطية هي واحدة من الأمراض الحيوانية المنشأ أهم مما تسبب في أكثر من نصف مليون إصابة بشرية جديدة سنويا ¹ في جميع أنحاء العالم. سبب انتقال العدوى إلى الإنسان الأكثر شيوعا عن طريق الاتصال المباشر مع الحيوانات المصابة أو عن طريق تناول طعام ملوث مثل الحليب غير المبستر. أعراض المرض الحمى غير محددة، مما يسبب صعوبات في تشخيص الحمى المالطية. وإذا لم يعالج، يمكن للمرضى تطوير عدوى مزمنة يعانون من أعراض أكثر شدة مثل التهاب المفاصل، التهاب الشغاف، والاعتلال العصبي ^2.

على المستوى الخلوي البروسيلا غير قادرة على غزو أكلة وغير أكلة الخلايا ويعيد داخل داخل الخلايامقصورة المعروفة باسم البروسيلا المحتوية فجوة (BCV). استيعاب البكتيريا يتطلب إعادة ترتيب الأكتين الهيكل الخلوي من قبل راك، رو، وتفعيل مباشر من Cdc42 ^3. داخل الخلية المضيفة حقيقية النواة، وBCV بالاتجار على طول الطريق التقامي وعلى الرغم من التفاعل مع الجسيمات الحالة والبكتيريا إدارة لتجنب تدهور ^4. مطلوب تحمض BCV من قبل حويصلي أتباز للحث على التعبير عن نوع البكتيريا نظام الرابع إفراز (T4SS) ^5. ويعتقد أن المستجيبات البكتيرية التي يفرزها T4SS ضرورية لالبروسيلا لتأسيس مكانته تنسخي، منذ حذف T4SS ⁶ أو تثبيط من الرصاص أتباز حويصلي إلى عيوب في تأسيس مكانة داخل الخلايا ^7. البكتيريا لا تكرار خلال المرحلة الاتجار حتى التوصل إلى مقصورة فجوي المستمدة ER ^8. بمجرد أن يحدث الانتشار داخل الخلايا، تم العثور على BCV في البنودجمعية بيئة نظام التشغيل مع علامات ER مثل calnexin والجلوكوز-6-الفوسفاتيز ^6.

الآليات الجزيئية التي البروسيلا يدخل خلايا، ويتجنب تدهور الليزوزومية، وأخيرا يكرر في حجرة مثل ER لا تزال مجهولة إلى حد كبير. وأساسا تم تحديد العوامل المضيفة المعنية في مختلف مراحل العدوى عن طريق نهج المستهدفة أو صغيرة بالتدخل RNA (سيرنا) شاشة صغيرة الحجم التي أجريت في خلايا ذبابة الفاكهة ^9. وتسلط هذه الضوء على مساهمة العوامل المضيفة الفردية خلال العدوى البروسيلا لكننا لا نزال بعيدين عن فهم شامل للعملية برمتها.

هنا، يتم عرض البروتوكولات التي تسمح بتحديد العوامل المضيفة الإنسان باستخدام تدخل الحمض النووي الريبي (رني) فحص واسعة النطاق في تركيبة مع الآلية المجهر مضان واسعة المجال وتحليل الصور الآلي. يتم تنفيذ عكسي ترنسفكأيشن سيرنا من خلايا هيلا كما describإد في وقت سابق ^10،11 مع تعديلات طفيفة. ويشمل فحص نقطة النهاية جزءا كبيرا من دورة حياة الخلايا البروسيلا باستثناء الخروج وإصابة الخلايا المجاورة. لمزيد من تميز الضربات المحددة في فحص نقطة النهاية، يتم استخدام البروتوكول المعدل لتحديد العوامل التي تدخل في الخطوات الأولى من الإصابة.

ويستخدم المجهضة سلالة البروسيلا الذي يعبر بشكل جوهري GFP لفحص نقطة النهاية حيث يسمح للبكتيريا تصيب الخلايا لمدة يومين. خلال هذا الوقت، والبكتيريا تدخل الخلايا، حركة المرور إلى مكانة تنسخي المستمدة ER، وتكرار في مساحة شبه النووي. ويمكن بعد ذلك مستويات عالية من إشارة GFP أن تستخدم لكشف موثوق الخلايا الفردية التي تحتوي على البكتيريا تكرار.

لدراسة دخول البروسيلا في مقايسة الإنتاجية العالية، فمن المهم أن تكون قادرا على التمييز بين البكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية. طريقة عرض هنا circumvالوالدان التفاضلية تلوين الأجسام المضادة للبكتيريا داخل الخلايا وخارج الخلية. لأنه يقوم على سلالة البروسيلا تعبر عن GFP التتراسيكلين محرض بالاشتراك مع التعبير التأسيسي عن dsRed. وجود علامة عن dsRed التأسيسية يسمح بتحديد جميع البكتيريا الموجودة في العينة. هو فعل التعبير GFP بإضافة غير سامة anhydrotetracycline التتراسيكلين التناظرية (ATC) في وقت واحد مع تثبيط البكتيريا خارج الخلية التي كتبها جنتاميسين (جم). في حين أن المضادات الحيوية جم خلايا كتيمة يقتل البكتيريا خارج الخلية، يمكن ATC دخول الخلية المضيفة وحمل التعبير GFP انتقائي في البكتيريا داخل الخلايا. يسمح هذا المراسل المزدوج فصل قوي من البكتيريا داخل الخلايا واحدة (GFP وإشارة عن dsRed) من البكتيريا خارج الخلية (إلا إشارة عن dsRed) باستخدام المجهر واسعة المجال. من أجل الوصول إلى التعبير GFP كشفها بواسطة الخلايا البروسيلا وجدنا أن 4 ساعات من تحريض من قبل ATC النتائج في RELIإشارة قادرة. وقد استخدمت مخططات تحريض مماثلة للتعبير بشكل انتقائي GFP في البكتيريا داخل الخلايا سابقا لدراسة الشغيلة داخل الخلايا ^12.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ملاحظة: يجب أن يؤديها كل عمل مع الحية سلالات المجهضة البروسيلا داخل مختبر مستوى السلامة الحيوية 3 (BSL3) النظر في جميع اللوائح اللازمة واحتياطات السلامة.

1. إعداد لوحات الفحص والتثقيف من البكتيريا والخلايا

التحضير للثقافات كاتب البروسيلا المجهضة
1. خط البروسيلا المجهضة 2308 (B. المجهضة) من -80 ° C الأسهم الحليب على لوحة زيتية الصويا آجار (TSA) يحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (TSA / كم). احتضان لوحة لمدة 3-4 أيام عند 37 درجة مئوية. استخدام سلالة البروسيلا المجهضة 2308 pJC43 (apHT :: GFP) ⁽¹³⁾ لفحص نقطة النهاية وسلالة البروسيلا المجهضة pAC042.08 (apht :: عن dsRed، تيتو :: tetR-GFP) لفحص دخول.
  ملاحظة: lipopolysaccharide في سلسة (LPS) من البروسيلا المجهضة هو من العوامل الفوعة مهم ولكن يمكن أن تحدث طفرات الخام على ترددات عالية نسبيا ^(14). Wهكذا ه يوصي اختبار حالة إجهاد ثقافة قبل أن تبدأ مع هذه التجربة.
2. البكتيريا Restreak على أربع لوحات TSA / كم تغطي لوحة كاملة واحتضان لمدة 2-3 أيام عند 37 درجة مئوية.
3. باستخدام حلقة من البلاستيك القابل للتصرف، ونقل والبكتيريا و resuspend من لوحات TSA / كم في 10 مل 10٪ الحليب الخالي من الدسم تعقيمها. تأكد من أن البكتيريا ومعلق بشكل جيد لضمان تركيز البكتيرية متسقة في جميع الثقافات بداية.
4. قسامة 250 ميكرولتر من تعليق البكتيرية إلى 2 مل المسمار الأنابيب الغطاء وتجميد في -80 درجة مئوية.
5. ذوبان الجليد قسامة من ثقافة المبتدئين ونقل 25 ميكرولتر، 50 ميكرولتر، و 100 ميكرولتر من ثقافة بداية البكتيرية لفصل 250 مل المسمار زجاجات سقف مع 50 مل زيتية الصويا مرق (TSB) التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل الكانامايسين (TSB / كم) . ختم الزجاجات مع بارافيلم.
6. احتضان الزجاجات بين عشية وضحاها على شاكر المداري في 100 دورة في الدقيقة و 37 درجة مئوية.
7. قياس الكثافة البصرية في 600 نم (OD ₆₀₀₎ لتحديد حجم ثقافة المبتدئين اللازمة للتوصل الى OD ₆₀₀ = 0،8-1،1 بعد الثقافة بين عشية وضحاها.
إعداد خلايا هيلا
1. تنمو خلايا هيلا في Dulbecco التعديل النسر متوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل العجل الجنين (FCS) (DMEM / 10٪ FCS) في حاضنة الرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO _2. تنمو خلايا إلى 80٪ confluency.
إعداد لوحات الفحص مع الرناوات siRNAs.
1. تمييع الرناوات siRNAs في ريبونوكلياز خالية من المياه إلى تركيز النهائي من 0.32 ميكرومتر. نقل 5 ميكرولتر / جيد لسوداء واضحة جيدا القاع شقة 384 لوحات جيدا.
  1. استخدام الأعمدة 1، 2، 23، و 24 لعناصر التحكم القياسية. لضوابط السلبية، استخدم عدم استهداف سيرنا (مشفر) وهمية الآبار دون الرناوات siRNAs (كاشف ترنسفكأيشن فقط). لضوابط ترنسفكأيشن، استخدام سيرنا أن يدفع موت الخلايا (KIF11)، وكذلك الضوابط الإيجابية من العوامل المضيفة معروفة تشارك في عدوى البروسيلا (على سبيل المثال، ARPC3،وهو مكون من مجمع Arp2 / 3 المشاركة في بلمرة الأكتين). نقل المتاحة تجاريا المكتبات سيرنا أو الرناوات siRNAs مخصصة إلى الآبار المتبقية.
  2. لوحات الختم مع رقائق الألومنيوم peelable. متجر لوحات في -20 درجة مئوية.
    ملاحظة: يمكن تخزين لوحات في -20 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 6 أشهر وحتى سنوات اعتمادا على توصيات الشركة الصانعة.

2. عكسي سيرنا ترنسفكأيشن

ذوبان الجليد أسود 384 لوحة جيدا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: ستكون هذه اسقاط كل السوائل التي قد تنضم إلى غطاء أو الجانب من الآبار.
إعداد المتوسطة ترنسفكأيشن عن طريق تمييع ترنسفكأيشن الكاشف 1: 200 في DMEM دون FCS في درجة حرارة الغرفة. إعداد المتوسطة ترنسفكأيشن أي أطول من 20 دقيقة قبل الاستخدام. بعناية مزيج الحل قبل الاستخدام.
إضافة 25 ميكرولتر المتوسطة ترنسفكأيشن إلى كل بئر باستخدام موزع كاشفوخلط الحلول عن طريق تحريك لوحة ذهابا وإيابا.
احتضان لوحة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة للسماح سيرنا / ترنسفكأيشن تشكيل معقد كاشف.
في غضون ذلك، وإعداد خلايا هيلا عن طريق غسل الخلايا شبه متموجة من دورق 75 سم ² مرة واحدة مع 2.5 مل 0.05٪ التربسين-EDTA في برنامج تلفزيوني (التربسين).
إضافة 1.5 مل التربسين الطازجة ونقل القارورة إلى 37 درجة مئوية لمدة 2-3 دقائق حتى تعتقل الخلايا يصل.
resuspend الخلايا في 10 مل قبل تحسنت DMEM / 16٪ FCS.
عد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي وإعداد تعليق خلية من 10000 خلية / مل في DMEM / 16٪ FCS.
إضافة تعليق خلية 50 ميكرولتر من كل بئر باستخدام موزع كاشف مما أسفر عن 500 خلية / جيد.
نقل لوحة ذهابا وإيابا إلى تحقيق التوزيع المتساوي للخلايا. ترك لوحة في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقيقة للسماح للخلايا ليستقر.
ختم لوحة مع parafilm واحتضان لمدة 72 ساعة على الألومنيوم قبل تحسنتلوحة في الحاضنة 37 درجة مئوية الرطبة مع 5٪ CO _2.
ملاحظة: لوحة الألومنيوم قبل تحسنت تسمح توزيع درجة الحرارة على قدم المساواة في جميع أنحاء كامل لوحة 384 جيدا.

3. العدوى والتثبيت

قبل يوم واحد للإصابة، تطعيم المبلغ المحدد في 1.1.7 من B. المجهضة الثقافة بداية في 50 مل TSB / كم المتوسطة في 250 مل المسمار غطاء زجاجة. ختم زجاجة مع بارافيلم وتنمو البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية و 100 دورة في الدقيقة على شاكر المداري إلى OD ₆₀₀ = 0،8-1،1.
قياس OD ₆₀₀ من ثقافة البكتيرية وإعداد المتوسطة العدوى عن طريق تمييع ثقافة البكتيرية في DMEM / 10٪ FCS لتحقيق تعدد المطلوب من العدوى (وزارة الداخلية).
ملاحظة: للحصول على معدل إصابة 5-10٪ في خلايا هيلا، ويستخدم وزارة الداخلية من 10،000. يجب أن يتم تنفيذ منحنى المعايرة وزارة الداخلية لكل نوع من الخلايا للحصول على معدلات الإصابة المثلى.
تبادل المتوسطة ترنسفكأيشن من 384 لوحة جيدامع 50 ميكرولتر من المتوسطة العدوى باستخدام لوحة الغسالة الآلية.
أجهزة الطرد المركزي لوحة 384 جيدا في 400 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: هذا يساعد على مزامنة عملية العدوى.
ختم لوحة مع parafilm واحتضان على لوحة الألومنيوم قبل تحسنت في حاضنة الرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة 4 ساعة.
غسل الخلايا مع DMEM / 10٪ FCS تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جم لتعطيل البكتيريا خارج الخلية باستخدام لوحة غسالة الآلي (استخدام 200 ميكرولتر / غسل فيضي أيضا).
ملاحظة: أثناء غسل تجاوز، لوحة الغسالة الآلية يوزع في وقت واحد وaspirates المتوسطة.
لفحص دخول، وغسل الخلايا مرة ثانية مع DMEM / 10٪ FCS تحتوي على 100 ميكروغرام / مل جم و 100 نانوغرام / مل ATC باستخدام لوحة غسالة الآلي (استخدام 200 ميكرولتر / غسل فيضي أيضا).
ختم لوحة مع بارافيلم وإعادته إلى لوحة الألومنيوم قبل تحسنت في حاضنة الرطبة 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لآخر40 ساعة أو 4 ساعات، لفحص نقطة النهاية وفحص الدخول، على التوالي.
لتثبيت، وغسل الآبار مع برنامج تلفزيوني باستخدام غسالة لوحة الآلي (استخدام 200 ميكرولتر / غسل فيضي أيضا).
صرف برنامج تلفزيوني مع 50 ميكرولتر 3.7٪ امتصاص العرق في 0.2 M HEPES في درجة الحموضة 7.4 (PFA) باستخدام لوحة الغسالة الآلية.
ملاحظة: تنبيه: PFA سامة عن طريق الإستنشاق وملامسة الجلد وإن بلع.
احتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
تبادل المتوسطة التثبيت مع 50 ميكرولتر PBS باستخدام لوحة الغسالة الآلية. ملاحظة: هذه العينات هي الآن مستعدة لاتخاذها للخروج من BSL3 إذا لزم الأمر.
تحذير: إزالة أي عينة من منشأة BSL3 تخضع لتقييم المخاطر والتحقق من صحة الإجراءات وتعتمد على اللوائح المعمول بها للسلامة الأحيائية.

4. تلطيخ

غسل الخلايا مرتين مع 50 ميكرولتر برنامج تلفزيوني.
Permeabilize الخلايا في 50 ميكرولتر 0.1٪ تريتون-X-100 في برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقيقة.
Wخلايا الرماد ثلاث مرات مع برنامج تلفزيوني. إضافة 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني تحتوي على دابي 1 ميكروغرام / مل (4، 6 diamidino-2-phenylindole)، واحتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
غسل الخلايا ثلاث مرات في برنامج تلفزيوني وحماية تلطيخ من الضوء مع رقائق الألومنيوم.

5. التصوير

إعداد الآلية المجهر واسعة المجال لاكتساب صورة.
ملاحظة: يتم وصف إعدادات المجهر ImageXpress جهاز الجزيئي باستخدام برنامج MetaXpress أدناه. بديلة 2D أجهزة المجهر واسعة المجال مع مواصفات الأجهزة المناسبة وبرامج التصوير يمكن استخدام (انظر جدول المواد / المعدات لمزيد من التفاصيل).
1. حدد الهدف 10X، كاميرا binning = 1، كسب = 1.
2. حدد تنسيق لوحة المقابلة لوحة 384 بشكل جيد.
3. الحصول على 9 مواقع لكل بئر.
4. استخدام "تمكين تركيز الليزر على أساس" و "التركيز على لوحة وأسفل جيدا".
5. تعيين "أولا بشكل جيد" كما البئر الأولي لالعثور على عينة و"جميع المواقع" لضبط تلقائي للصورة الموقع.
6. استخدام قناة دابي لمجموعة لالتركيز إزاحة Z يدويا.
7. اختر يدويا من دابي لجميع القنوات الأخرى إزاحة Z.
8. يدويا تصحيح الوقت التعرض لجميع القنوات لضمان مجموعة واسعة ديناميكية مع التعرض المفرط منخفضة.
  1. الحصول على صورة من موقع تمثيلي باستخدام وظيفة لصناعة السيارات في التعرض. استخدام هذا الوقت التعرض لصورة 3-5 المواقع في جميع أنحاء لوحة وضبط وقت التعرض يدويا حتى تصل ألمع بكسل ~ 80٪ من سطوع القصوى على جميع المواقع.
9. صورة لوحة كاملة باستخدام قنوات دابي وGFP لفحص نقطة النهاية. لفحص دخول حدد القناة طلب تقديم العروض بالإضافة.

6. الآلي تحليل الصور

ملاحظة: CellProfiler 2 ¹⁵ كخادمة برمجيات تحليل الصور لقطاع الخلوي والكائنات البكتيرية وأداء الآلي قياس آثافةبيانات أدلى داخل الكائنات التي تم تحديدها. يوفر البرنامج خوارزميات تحليل الصور في الوحدات الفردية، والتي يمكن دمجها في خط الأنابيب الذي سيتم تنفيذ وحدات على التوالي في جميع الصور، لأداء تلقائيا مهمة تحليل صورة معينة. لمتابعة بروتوكول، تثبيت CellProfiler 2.1.1 أو إصدار أحدث. ثم، تحميل خط أنابيب المقدمة واتباع التعليمات التالية لضبط المعلمات المطلوبة في وحدات. وصف الوحدات الفردية لجميع خطوط الأنابيب يمكن العثور عليها في ملفات التكميلية.

ملاحظة: يتم استخدام اثنين من خطوط أنابيب منفصلة لكل فحص. اول خط انابيب بحساب نموذج التظليل، والذي يستخدم من قبل خط أنابيب ثان لتصحيح الصور قبل التحليل. يتم تطبيق تصحيح التظليل على صور للحد من الآثار المترتبة على مسار الضوء غير متجانس من المجهر. حساب نموذج التظليل في خط أنابيب الأول هو عملية طويلة، ولكن سوف تكون النتائج من أعلى قدر من الدقة.

حساب نموذج التظليل
1. انتقل إلى القائمة "ملف"، اختر "استيراد" → "خط أنابيب من ملف ..."، وحدد قدمت خط أنابيب "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". وعندما سئل عما إذا كان لتحويل خط أنابيب إرث، والإجابة "لا تحويل".
2. الذهاب إلى "إخراج" → "عرض إعدادات إخراج" وحدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج لنماذج التظليل الناتجة عن ذلك.
3. في وحدة نمطية (1) "LoadImages"، وضبط اسم "نص على أن هذه الصور لها من القواسم المشتركة" لمطابقة أسماء الصورة.
4. تأكد من أن أيا من وحدات تظهر العرض الخاصة بها قبل تشغيل تحليل كامل عن طريق إلغاء كل حرف العين إلى جانب وحدات. ملاحظة: هذا بشكل ملحوظ يقلل الحاجة إلى موارد الحاسوبية أثناء معالجة خط الأنابيب.
5. اضغط على "تحليل الصور" لبدء حساب نموذج التظليل. لى>
تشغيل تحليل الصور
1. انتقل إلى القائمة "ملف"، اختر "استيراد" → "خط أنابيب من ملف ..."، وحدد قدمت خط أنابيب "BrucellaEndpointWithShadingCorrectionPart2-Ver007". وعندما سئل عما إذا كان لتحويل خط أنابيب إرث، والإجابة "لا تحويل".
2. الذهاب إلى "إخراج" → "عرض إعدادات إخراج" وحدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج لجدول البيانات الناتجة.
3. في وحدة (1) "LoadImages"، وضبط اسم "نص على أن هذه الصور لها من القواسم المشتركة" لمطابقة أسماء الصورة.
4. في وحدة (2) "LoadSingleImage"، تحميل نماذج التظليل المحسوب وفقا 6.1.1 عن طريق اختيار الموقع وأسماء من نماذج التظليل اثنين.
5. في وحدات (4) - (5) "ImageMath"، وضبط المعلمة "اضرب الصورة الأولى" مطابقة عمق بت من الكاميرا المجهر. لمدة 8 و 16 بتصور تعيين المعلمة إلى "1.0"، ل12 بت الصور مجموعة المعلمة إلى "16.0".
6. في وحدة (9) "ImageMath" ضبط المعلمة "مضاعفة الصورة الثانية" إلى قيمة (تبدأ مع 0.25) من شأنها أن قمع إشارة البروسيلا في تلطيخ دابي دون قمع النوى.
  1. انقر على زر "ابدأ اختبار الوضع"، ثم تفعيل رمز وقفة وظيفة عرض لنموذج (9) من خلال النقر على الرموز المقابلة من الوحدة.
    ملاحظة: سيظهر رمز وقفة باللون الأصفر، في حين أن رمز العين سوف تظهر العين مفتوحة إذا تفعيلها.
  2. انقر على زر "تشغيل" لتشغيل تحليل ما يصل إلى الوحدة (9) مع رمز وقفة النشط. لاختبار قيم وحدة، اضغط على "الخطوة".
  3. انقر بزر الماوس الأيمن على صورة افتتح حديثا وضبط "على النقيض من صورة" إلى "تسجيل تطبيع". مرارا وتكرارا التراجع إلى وحدة (9)، وضبط المعلمة "اضرب الصورة الثانية"، وخطوة على ركان الوحدة النمطية مرة أخرى، حتى يتم قمع إشارة البروسيلا بالكامل في حين يتم الحد في نفس المناطق السوداء الوقت التي تشير إلى الإفراط في الطرح في الصورة نتيجة.
7. في وحدة (10) "IdentifyPrimaryObjects"، تعيين المعلمة "السفلى ملزمة على عتبة" عالية بما فيه الكفاية (بداية مع صفر) بحيث تتم تجزئة النوى ويتم تجاهل الخلفية.
  1. لتحديد قيمة جيدة مقابل وحدة (10)، خطوة على حدة وعرض الصورة المدخلة كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2.
  2. بزر الماوس الأيمن فوق الصورة المدخلة وعرض الرسم البياني.
    ملاحظة: ذروة الرسم البياني يشير عادة الخلفية.
  3. بدءا من شدة خلفية زيادة المعلمة حتى يتم التوصل إلى تجزئة جيدة من نوى كما هو معروض في الصورة الانتاج.
    ملاحظة: تحديد عتبة أعلى من كثافة الخلفية أهمية خاصة لمواقع فارغة.
8. في وحدة (15)4؛ FilterObjects "، وضبط المعلمة" قيمة الحد الأدنى "بحيث يتم الاحتفاظ الخلايا مع البروسيلا واضحة للعيان في النواة، وجميع الآخرين تصفيتها بعيدا في هذه الخطوة، وتجاهل البروسيلا خارج النواة.
  1. لتحديد قيمة جيدة، خطوة على حدة وعرض الصورة الانتاج كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2. نبدأ من الصفر، والذي يعرف كل الخلايا كما المصابة، وزيادة القيمة من خلال خطوات صغيرة حتى الخلايا فقط مع البروسيلا واضحة للعيان في نواة يتم الاحتفاظ.
9. في وحدة (16) "FilterObjects"، وضبط المعلمة "قيمة الحد الأدنى" بحيث يتم الاحتفاظ الخلايا مع البروسيلا واضحة للعيان في perinucleus، ويتم تصفية كل الخلايا الأخرى بعيدا. استخدام نهج مماثل كما هو الحال في وحدة السابقة.
10. في وحدة (17) "FilterObjects"، وضبط المعلمة "قيمة الحد الأدنى" بحيث الخلايا مع البروسيلا واضحة للعيان في VORيتم الاحتفاظ خلايا الجسم onoi، ويتم تصفية كل الخلايا الأخرى بعيدا. استخدام نهج مماثل كما هو الحال في وحدة السابقة.
  ملاحظة: جسم الخلية Voronoi هو امتداد شعاعي للنواة بنسبة 25 بكسل مع أي تداخل مع أجسام الخلايا Voronoi المجاورة.
11. الخروج من وضع الاختبار والتأكد من أن أيا من وحدات تظهر العرض الخاصة بها قبل تشغيل تحليل كامل عن طريق إلغاء كل حرف العين إلى جانب وحدات.
  ملاحظة: هذا بشكل ملحوظ يقلل الحاجة إلى موارد الحاسوبية أثناء معالجة خط الأنابيب.
12. اضغط على "تحليل الصور" لبدء تحليل.
13. عند الانتهاء من تحليل وفحص ينتج عن ذلك من صور PNG، فضلا عن ورقة CSV للتأكد من أن تحليل عمل موثوق بها في جميع أنحاء لوحة.

الفحص دخول
1. حساب نموذج التظليل
  1. انتقل إلى القائمة "ملف"، اختر "استيراد" → "خط أنابيب من ملف ..."، وحدد توفيرد خط أنابيب "BrucellaShadingCorrectionPart1-Ver007". وعندما سئل عما إذا كان لتحويل خط أنابيب إرث، والإجابة "لا تحويل".
  2. الذهاب إلى "إخراج" → "عرض إعدادات إخراج" وحدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج لنماذج التظليل الناتجة عن ذلك.
  3. في وحدة (1) "LoadImages"، وضبط اسم "نص على أن هذه الصور لها من القواسم المشتركة" لمطابقة أسماء الصورة.
  4. تأكد من أن أيا من وحدات تظهر العرض الخاصة بها قبل تشغيل تحليل كامل عن طريق إلغاء كل حرف العين إلى جانب وحدات.
    ملاحظة: هذا بشكل ملحوظ يقلل الحاجة إلى موارد الحاسوبية أثناء معالجة خط الأنابيب.
  5. اضغط على "تحليل الصور" لبدء حساب نموذج التظليل.
2. تشغيل تحليل الصور
  1. انتقل إلى القائمة "ملف"، اختر "استيراد" → "خط أنابيب من ملف ..."، وحدد بتقديمإد خط أنابيب "BrucellaEntryWithShadingCorrectionPart2-Ver007". وعندما سئل عما إذا كان لتحويل خط أنابيب إرث، والإجابة "لا تحويل".
  2. الذهاب إلى "إخراج" → "عرض إعدادات إخراج" وحدد مجلد الإدخال مع الصور ومجلد الإخراج لجدول البيانات الناتجة.
  3. في وحدة (1) "LoadImages"، وضبط اسم "نص على أن هذه الصور لها من القواسم المشتركة" لمطابقة أسماء الصورة.
  4. في وحدة (2) "LoadSingleImage"، تحميل نماذج التظليل المحسوب وفقا 6.2.1 عن طريق اختيار الموقع وأسماء من نماذج التظليل اثنين.
  5. في وحدات (4) - (5) "ImageMath"، وضبط المعلمة "اضرب الصورة الأولى" مطابقة عمق بت من الكاميرا المجهر. لمدة 8 و 16 بت الصور تعيين المعلمة إلى "1.0"، لمدة 12 بت الصور تعيين المعلمة إلى "16.0".
  6. في وحدة (6) "IdentifyPrimaryObjects"، تعيين المعلمة "لوور ملزمة على عتبة "مرتفعة بما يكفي أن نوى الوحيدة هي مجزأة ويتم تجاهل الخلفية.
    1. لتحديد قيمة جيدة مقابل وحدة (6)، خطوة على حدة وعرض الصورة المدخلة كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2.
    2. بزر الماوس الأيمن فوق الصورة المدخلة وعرض الرسم البياني.
      ملاحظة: ذروة الرسم البياني يشير عادة الخلفية.
    3. بدءا من شدة خلفية زيادة المعلمة حتى يتم التوصل إلى تجزئة جيدة من نوى كما هو معروض في الصورة الانتاج.
      ملاحظة: تحديد عتبة فوق خلفية من المهم بالنسبة للمواقع فارغة.
  7. في وحدة (8) "IdentifyPrimaryObjects"، تعيين المعلمة "السفلى ملزمة على عتبة" عالية بما فيه الكفاية أن البروسيلا ومجزأة فقط ويتم تجاهل الخلفية.
    1. لتحديد قيمة جيدة مقابل وحدة (8)، خطوة على حدة وعرض الصورة المدخلة كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2.
    2. بزر الماوس الأيمن فوق الصورة المدخلة وعرض الرسم البياني.
      ملاحظة: ذروة الرسم البياني يشير عادة الخلفية.
    3. بدءا من شدة خلفية زيادة المعلمة حتى يتم تحقيق تجزئة جيدة من البروسيلا كما هو معروض في الصورة الانتاج.
      ملاحظة: تحديد عتبة فوق خلفية من المهم بالنسبة للمواقع فارغة.
  8. في وحدة (11) "FilterObjects"، وضبط المعلمة "قيمة الحد الأدنى" حتى يتم تصفية هذه الخلفية والمصنوعات اليدوية بعيدا، ويتم الاحتفاظ فقط المستعمرات البروسيلا.
    1. لتحديد قيمة جيدة، خطوة على حدة وعرض الصورة الانتاج كما هو موضح في الخطوات 6.1.2.6.1 و6.1.2.6.2. نبدأ مع القيمة المحددة في 6.2.2.7 ومتدرج زيادته حتى يتم الاحتفاظ الأشياء البروسيلا فقط.
  9. الخروج من وضع الاختبار والتأكد من أن أيا من وحدات تظهر العرض الخاصة بها قبل تشغيل تحليل كامل عن طريق uncheCKING كل حرف العين إلى جانب وحدات.
    ملاحظة: هذا بشكل ملحوظ يقلل الحاجة إلى موارد الحاسوبية أثناء معالجة خط الأنابيب.
  10. اضغط على "تحليل الصور" لبدء تحليل.
  11. عند الانتهاء من تحليل وفحص ينتج عن ذلك من صور PNG، فضلا عن ورقة CSV للتأكد من أن تحليل عملت بشكل جيد في جميع أنحاء لوحة.

7. العدوى التهديف

ملاحظة: الرناوات siRNAs التي يكون لها تأثير كبير على بقاء الخلية يتعين النظر بحذر، لأن هذا يمكن أن تعزز الاكتشافات إيجابية كاذبة. يؤثر على عدد الخلايا غيرت وزارة الداخلية الفعلية ويمكن استهداف الجينات الأساسية لديها آثار عديد المظاهر على إصابة الممرض. في حين استنزاف غير مكتمل من قبل الرناوات siRNAs يسمح لدراسة الجينات الأساسية، ويمكن التحقق من صحة هذه الأهداف عن طريق وسائل بديلة (على سبيل المثال، تدخل الصيدلانية) لتأكيد دورها العوامل المضيفةخلال العدوى.

نقطة النهاية الفحص
1. افتح صفحة CSV إنشاؤها في الخطوة 6.1.2.12 وحساب في معدل الإصابة بشكل جيد عن طريق قسمة عدد من الخلايا المصابة (CellProfiler قراءات: "Count_InfectedCells") على العدد الكلي للخلايا (CellProfiler قراءات: "CountNuclei"). إذا كان قد تم تصوير مواقع متعددة لكل بئر، وتلخيص لأول مرة جميع المواقع لكل بئر، لبناء عدد لكل بئر من الخلايا المصابة وعدد الإجمالي لكل جيدا من الخلايا.
2. أداء Z التهديف تطبيع لمراعاة الاختلافات لوحة إلى لوحة إذا كان يحتوي على لوحات كافية غير ضرب الرناوات siRNAs. نفترض وجود عدد كاف من الرناوات siRNAs غير الكر في لوحة إذا تم فحص مكتبات كاملة.
الفحص دخول
1. افتح صفحة CSV إنشاؤها في الخطوة 6.2.2.10 وحساب في معدل الإصابة بشكل جيد عن طريق قسمة عدد من الخلايا المصابة (CellProfiler قراءات: "Count_InfectedCeLLS ") على العدد الكلي للخلايا (CellProfiler قراءات:" CountNuclei ") إذا كان قد تم تصوير مواقع متعددة لكل بئر، تلخص أولا جميع المواقع لكل بئر، لبناء عدد لكل بئر من الخلايا المصابة ولكل جيدا العدد الكلي للخلايا.
2. لتحديد الحمولة الجرثومية من الخلايا المصابة، وتقدير متوسط مساحة من البكتيريا داخل الخلايا في الخلية المصابة المحتلة. تحقيقا لهذه الغاية، تقسيم منطقة متكاملة بجميع البكتيريا داخل الخلايا متداخلة مع الخلايا (CellProfiler قراءات: "AreaOccupied_AreaOccupied_TrueIntPathogenInCells") من قبل عدد من الخلايا المصابة في هذا الموقع. لحساب القطع الأثرية، استخدم المتوسط من جميع المواقع من هذا قراءات كما قراءات جيدا.
  ملاحظة: إذا تم استخدام هذا الاختبار بمثابة متابعة فحص تحتوي على عدد كبير من الجينات المسؤولة عن الإصابة البروسيلا، لا تنطبق Z درجة التطبيع. بدلا من ذلك، نفذ التطبيع باستخدام الآبار وهمية كمرجع لحساب التباين لوحة إلى لوحة.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويبين الشكل 1A مثال على تحليل الصور المستخدمة لتحديد الخلايا المصابة تلقائيا في فحص نقطة النهاية. وقد تم تحديد نوى خلايا هيلا ملطخة دابي، حسبت على النواة المحيطة من عرض 8 بكسل المحيطة النواة، وخلايا الجسم Voronoi بالتبعية للنواة بنسبة 25 بكسل. منذ البكتيريا تتكاثر بشكل رئيسي في الفضاء شبه النووي، وشدة GFP في هذا المجال من الخلية هي قياس أقوى للتمييز بين الخلايا المصابة وغير المصابة. في بعض الحالات، تم العثور على البكتيريا على التكا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

طورت مسببات الأمراض البكتيرية العديد من الاستراتيجيات لمعالجة الخلايا المضيفة حقيقية النواة لصالحها. غالبا ما تظهر مسببات الأمراض المسببة للالتهابات الحادة تكثرا سريعا مصحوبا بقلق كبير لجهاز المناعة وفقدان صلاحية الخلايا المصابة للحياة. في المقابل ، تمكنت البروسيلا ومسببات الأمراض الأخرى التي تسبب الالتهابات المزمنة من إنشاء تفاعلات طويلة الأمد داخل الخلايا المضيفة. لذلك ، تحتاج البكتيريا إلى ضبط وظائف الخلايا المضيفة لصالحها دون تعطيل التوازن الخلوي. تتمثل الإستراتيجية الشائعة لتحديد عوامل الخلية المضيفة المشار...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يعلن المؤلفون عدم وجود تضارب في المصالح.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال المنح 51RT 0_126008 و 51RTP0_151029 لمشروع البحث وتطوير التكنولوجيا (RTD) InfectX و TargetInfectX ، على التوالي ، في إطار SystemsX.ch ، المبادرة السويسرية لبيولوجيا الأنظمة. نحن نقدر 310030B_149886 المنح من المؤسسة الوطنية السويسرية للعلوم (SNSF). تم دعم عمل S.H.L و A.C. من قبل برنامج الدكتوراه الدولي "زمالات التميز" في Biozentrum. تم الاعتراف ب Simone Muntwiler للمساعدة الفنية. نود أن نشكر ديرك بومان على توفير pNF106 وجان سيلي ل pJC43 و pJC44.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسم	الشركة	رقم فهرسي	التعليقات
تريبتيك فول الصويا أجار (TSA)	دينار	بحريني 236950
مرق الصويا الترابتي (TSB)	فلوكا	22092
كبريتات كاناميسين	سيجما ألدريتش	60615
حليب
250 مل زجاجة غطاء لولبي	كورنينج	8396
DMEM	سيجما ألدريتش	D5796
الجنين مصل ربلة الساق (FCS)	Gibco	10270
Trypsin-EDTA معطل بالحرارة (0.5٪)	Gibco	15400-054	محلول مخزون 10x ، مخفف 1:10 في PBS
Scepte 2.0 Cell Counter	Merck Milipore	PHCC20060	يمكن استخدام أجهزة عد الخلايا البديلة
Greiner CELLSTAR 384-well لوحة	Sigma-Aldrich	M2062
رقائق الألومنيوم القابلة للنزع	Costar	6570
موزع الكاشف: "موزع كاشف Multidrop 384" يمكن		استخدام موزع الكاشف	البديل 5840150 Thermo Scientic
كاشف التعداد: "Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen	13778-150
غسالة الألواح الآلية: "غسالة الألواح ELx50-16"	BioTek	ELX5016	تحتوي غسالة الألواح هذه على مشعب من 16 قناة مناسب لألواح 384 بئرا. تتناسب مع خزانة السلامة الحيوية ولها غطاء يغطي اللوحة أثناء الغسيل مما يقلل من خطر إنتاج الهباء الجوي. يمكن استخدام غسالات الألواح البديلة ذات الميزات المماثلة.
جنتاميسين	سيجما ألدريتش	G1397
أنهيدروتتراسيكلين هيدروكلوريد	سيجما ألدريتش	37919	100 &# 956 ؛ يتم الاحتفاظ بمحلول جم / مل في الإيثانول بنسبة 100٪ عند -20 درجة ؛ C محمي من الضوء في رقائق الألومنيوم
PBS	Gibco	20012
Paraformaldehyde	Sigma-Aldrich	P6148	يذوب في عازلة HEPES 0.2 M ، درجة الحموضة 7.4. يخزن في -20 درجة ؛ C ويذوب طازجا في اليوم السابق للاستخدام. تحذير ، PFA سام عن طريق الاستنشاق ، عند ملامسة الجلد وفي حالة ابتلاعها.
هيبس	سيجما ألدريتش	H3375
تريتون X-100	سيجما ألدريتش	T9284
دابي	روش	10236276001
مخفوق siRNA	Dharmacon	D-001810-10
Kif11 siRNA	Dharmacon	L-003317-00
ARPC3 siRNA	Dharmacon	L-005284-00
Brucella abortus 2308< / em>
pJC43 (apHT:: GFP< / em>)			Celli et al.< / em>^{12< / sup>}
pAC042.08 (apht: :d sRed ، tetO :: tetR-GFP< / em>)			البناء: pJC44 ^{4< / sup> تم هضمه باستخدام EcoRI متبوعا بتوليد نهايات حادة مع إنزيم Klenov والهضم اللاحق مع SalI. تم تضخيم TetR-GFP من pNF106 باستخدام التمهيدي prAC090 و prAC092. بعد الهضم باستخدام SalI ، تم ربط منتج TetR-GFP بناقل pJC44 المهضوم.}
برايمر prAC090	سيجما ألدريتش		، TTT ، TTG ، AAT ، TCT ، GGC ، AAT ، TCC ، GC ، TAA ، GAA ، ACC
، Primer prAC092	، Sigma-Aldrich		، TTT TTG ، TCG ، ACT TTG ، TCC ، TCA ، TCA ، GGA GAG ، CGT TC
، HeLa CCL-2	ATCC	، CCL-2
، ImageXpress	الجزيئية الدقيقة ؛	IXM IMAGING MSCOPE	مجهر تصوير خلوي آلي مجهز بمرحلة Z بمحرك دقيق. يمكن استخدام أنظمة بديلة للفحص المجهري الآلي والمكونات البديلة للبرامج الصلبة والبرامج المحددة أدناه.
السرعة بالليزر التلقائي	للتركيز التلقائي	1-2300-1037
CFI Super Fluor 10X الهدف	نيكون	MRF00100	NA 0.50 ، WD 1.20 مم ، DIC Prism: 10X ، القياسات الضوئية المحملة بنابض
CoolSNAP HQ أحادية اللون CCD الكاميرا	الأجهزة الجزيئية ؛	1-2300-1060	1,392 × 1,040 بكسل تصوير ، 6.45 × 6.45 وميكرو ؛ م بكسل ، 12 بت رقمنة
برنامج MetaXpress	الأجهزة الجزيئية ؛	9500-0100
محرك LUI-Spectra-X-7	Lumencor	SPECTRA X V-XXX-YZ	الخفيف. يتم استخدام مصادر الضوء التالية: البنفسجي (DAPI) ، السماوي (GFP) ، الأخضر / الأصفر (RFP) المثير
أحادي النطاق ل DAPI	Semrock	FF01-377 / 50-25
أحادي النطاق ل DAPI	Semrock	FF02-447 / 60-25
أحادي النطاق ل DAPI	Semrock	FF409-Di03-25x36
أحادي النطاق ل GFP	Semrock	FF02-472 / 30-25
باعث النطاق الفردي ل GFP	Semrock	FF01-520 / 35-25
اللون أحادي النطاق ل GFP	Semrock	FF495-Di03-25x36
أحادي النطاق ل RFP	Semrock	FF01-562 / 40-25
أحادي النطاق ل RFP	Semrock	FF01-624 / 40-25
اللون أحادي النطاق ل RFP	Semrock	FF593-Di03-25x36

خالي الدسم. ، الأجهزة الأجهزة الجزيئية عالية باعث ثنائي اللون مثير ثنائي مثير باعث ثنائي

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pappas, G., Papadimitriou, P., Akritidis, N., Christou, L., Tsianos, E. V. The new global map of human brucellosis. Lancet Infect Dis. 6, 91-99 (2006).
Atluri, V. L., Xavier, M. N., de Jong, M. F., den Hartigh, A. B., Tsolis, R. E. Interactions of the human pathogenic Brucella species with their hosts. Annu Rev Microbiol. 65, 523-541 (2011).
Guzman-Verri, C., et al. GTPases of the Rho subfamily are required for Brucella abortus internalization in nonprofessional phagocytes: direct activation of Cdc42. J Biol Chem. 276, 44435-44443 (2001).
Starr, T., Ng, T. W., Wehrly, T. D., Knodler, L. A., Celli, J. Brucella intracellular replication requires trafficking through the late endosomal/lysosomal compartment. Traffic. 9, 678-694 (2008).
Boschiroli, M. L., et al. The Brucella suis virB operon is induced intracellularly in macrophages. Proc Natl Acad Sci U S A. 99, 1544-1549 (2002).
Celli, J., et al. Brucella evades macrophage killing via VirB-dependent sustained interactions with the endoplasmic reticulum. J Exp Med. 198, 545-556 (2003).
Porte, F., Liautard, J. P., Kohler, S. Early acidification of phagosomes containing Brucella suis is essential for intracellular survival in murine macrophages. Infect Immun. 67, 4041-4047 (1999).
Anderson, T. D., Cheville, N. F. Ultrastructural morphometric analysis of Brucella abortus-infected trophoblasts in experimental placentitis. Bacterial replication occurs in rough endoplasmic reticulum. Am J Pathol. 124, 226-237 (1986).
Qin, Q. M., et al. RNAi screen of endoplasmic reticulum-associated host factors reveals a role for IRE1alpha in supporting Brucella replication. PLoS Pathog. 4, e1000110(2008).
Ramo, P., et al. Simultaneous analysis of large-scale RNAi screens for pathogen entry. BMC genomics. 15, 1162(2014).
Kuhbacher, A., Gouin, E., Cossart, P., Pizarro-Cerda, J. Imaging InlC secretion to investigate cellular infection by the bacterial pathogen Listeria monocytogenes. J Vis Exp. , e51043(2013).
Kentner, D., et al. Shigella reroutes host cell central metabolism to obtain high-flux nutrient supply for vigorous intracellular growth. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 9929-9934 (2014).
Celli, J., Salcedo, S. P., Gorvel, J. P. Brucella coopts the small GTPase Sar1 for intracellular replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 1673-1678 (2005).
von Bargen, K., Gorvel, J. P., Salcedo, S. P. Internal affairs: investigating the Brucella intracellular lifestyle. FEMS microbiology reviews. 36, 533-562 (2012).
Kamentsky, L., et al. Improved structure, function and compatibility for CellProfiler: modular high-throughput image analysis software. Bioinformatics. 27, 1179-1180 (2011).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

RNA Interference Automated Microscopy Image Analysis CellProfiler Endpoint Assay Entry Assay

فحوصات القائم على الفحص المجهري لفحص عالية الإنتاجية من العوامل المضيفة المعنية في البروسيلا إصابة خلايا هيلا

في هذه المقالة

ملخص

الملخص

المقدمة

البروتوكول

النتائج

المناقشة

الإفصاحات

شكر وتقدير

المواد

المراجع

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

مقالات ذات صلة