يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

الهندسة الوراثية من الخميرة غير تقليدية للالمتجددة الوقود الحيوي وإنتاج البيوكيميائية

14.4K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54371

⸱

سبتمبر 20, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2NUS Synthetic Biology for Clinical and Technological Innovation (SynCTI), Life Sciences Institute, National University of Singapore, 3Food Science and Chemical Engineering, Singapore Institute of Technology

في هذه المقالة

ملخص

نبلغ هنا عن طرق التلاعب الجيني الجزيئي لسلالة Yarrowia lipolytica Po1g لتحسين كفاءة حذف الجينات. سلالات Y. lipolytica الناتجة لها تطبيقات محتملة في إنتاج الوقود الحيوي والكيمياء الحيوية.

الملخص

Yarrowia lipolytica هو غير المسببة للأمراض، ديمبرافيك والهوائية بدقة أنواع من الخميرة. ونظرا لميزاته الفسيولوجية وخصائص التمثيل الغذائي، وهذا الخميرة غير تقليدية ليست سوى نموذج جيد لدراسة الطبيعة الأساسية للتمايز الفطرية ولكن هي أيضا منصة الميكروبية واعدة للإنتاج والكيمياء الحيوية ومختلف تطبيقات التكنولوجيا الحيوية، والتي تتطلب التلاعب الجيني واسعة النطاق. ومع ذلك، التلاعب الجيني من Y. وقد lipolytica محدود نظرا لعدم وجود نظام التحول الجيني فعال ومستقر وكذلك معدلات عالية جدا من إعادة التركيب غير المتجانس التي يمكن أن تعزى أساسا إلى الجين KU70. هنا، ونحن التقرير بروتوكول السهل والسريع للتحول الوراثي كفاءة وللحذف الجينات في Y. lipolytica Po1g. الأول، وهو بروتوكول للتحول كفاءة من الحمض النووي الخارجية إلى Y. تأسست lipolytica Po1g. سيكوالثانية، لتحقيق تعزيز المزدوج كروس معدل إعادة التركيب مثلي لمزيد من الحذف من الجينات المستهدفة، تم حذف هذا الجين KU70 عن طريق تحويل شريط كاسيت اختلال تحمل 1 الأسلحة كيلوبايت التماثل. ثالثا، للتدليل على تعزيز كفاءة الجينات الحذف بعد الحذف من الجينات KU70، حذفنا فردي 11 الجينات المستهدفة ترميز نازعة الكحول وأوكسيديز الكحول باستخدام نفس الإجراءات على سلالة KU70 خروج المغلوب منصة. ولوحظ أن معدل إعادة التركيب مثلي الدقيق ازداد كثيرا من أقل من 0.5٪ للحذف من الجين KU70 في Po1g إلى 33٪ -71٪ لحذف جين واحد من الجينات المستهدفة 11 في Po1g KU70 Δ. شيد البلازميد تنسخي تحمل علامة مقاومة هيغروميسين B ونظام لجنة المساواة العرقية / LoxP، والجين اختيار علامة في سلالات خروج المغلوب الخميرة أزيل في نهاية المطاف عن طريق التعبير عن لجنة المساواة العرقية recombinase لتسهيل جولات متعددة من المستهدفينالتلاعب الجيني تيد. ينتج عن ذلك من المسوخ الحذف جين واحد لها تطبيقات محتملة في الوقود الحيوي وإنتاج والكيمياء الحيوية.

المقدمة

وخلافا لخميرة الخباز، Yarrowia lipolytica، والخميرة غير تقليدية، يمكن أن تنمو في شكل الخميرة او mycelium في استجابة للتغيرات في الظروف 1،2 البيئي. وهكذا، وهذا الخميرة ديمبرافيك يمكن استخدامها كنموذج جيد لدراسة التمايز الفطري، التشكل و3،4،5 التصنيف. ويعتبر بشكل عام على أنها آمنة وأنواع من الخميرة (غرا)، والذي يستخدم على نطاق واسع لإنتاج مجموعة متنوعة من المضافات الغذائية مثل الأحماض العضوية، polyalcohols، مركبات رائحة، والمستحلبات والسطحي 6،7،8،9. وهو الميكروب الهوائي تلزم والخميرة الزيتية المعروفة قادرة على تراكم الدهون بشكل طبيعي في كميات عالية، أي ما يصل إلى 70٪ من الوزن الجاف خلية 10. ويمكن أيضا الاستفادة من مجموعة واسعة من مصادر الكربون للنمو، بما في ذلك أنواع مختلفة من المخلفات في الموارد النفايات والمواد الغذائية 11،12،13. كل هذه الميزات الفريدة جعل Y. lipolytica جذابة للغاية للالعديد من التطبيقات في مجال التكنولوجيا الأحيائية.

على الرغم من أن تسلسل الجينوم الكامل للY. وقد تم نشر lipolytica 14،15، والتلاعب الجيني لهذه الخميرة غير تقليدية هو أكثر تعقيدا من الأنواع الخميرة الأخرى. أولا، تحول هذا أنواع من الخميرة هو أقل كفاءة بكثير نظرا لعدم وجود نظام التحول الجيني 16،17 مستقرة وفعالة. ثانيا، يتم استخدام التكامل الجيني شاقة من أشرطة التعبير الخطية عادة للتعبير عن الجينات ذات الاهتمام كما تم العثور على أي نظام البلازميد episomal الطبيعي في هذه الخميرة 18. الثالث، وتوليد الوراثية تدق الرافضة واضعا الإضافية تقتصر لأن استهداف الجينات الكفاءة عبر إعادة التركيب مثلي دقيق في هذه الخميرة منخفضة وتحدث معظم أحداث التكامل من خلال نهاية غير المتجانسة الانضمام (NHEJ) 19.

في هذه الدراسة، ونحن الإبلاغ عن بروتوكول التحول الأمثل لY. lipolytica Po1g سلالة، والتي من السهل وسريعة وفعالة وقابلة للتكرار. لتعزيز وتيرة إعادة التركيب مثلي الدقيق، أن حذف هذا الجين KU70، الذي يشفر إنزيم أساسي في مسار NHEJ. باستخدام بروتوكول التحول الأمثل وتحويل شريط كاسيت خروج المغلوب الخطية التي تحتوي المرافقة المناطق تناظر من 1 كيلو بايت، الجين KU70 من Y. تم حذف lipolytica Po1g بنجاح. وبعد ذلك أثبتت متانة هذه المنهجية حذف الجينات من خلال استهداف نازعة الكحول والجينات الكحول أوكسيديز في سلالة Po1g KU70 Δ. ولوحظ أن حذف سلالة KU70 أظهرت كفاءة أعلى بكثير من مثلي الجينات بوساطة إعادة التركيب تستهدف من ذلك من البرية من نوع Po1g سلالة. وبالإضافة إلى ذلك، تم إنشاء لجنة المساواة العرقية التعبير البلازميد تنسخي تحمل علامة مقاومة هيغروميسين B في عملية إنقاذ علامة. إنقاذ علامة يسهل جولات متعددة من استهداف الجينات في اله الحصول على طفرات الحذف الجينات. وبالاضافة الى حذف الجينات، لدينا بروتوكول للتحول الوراثي والجينات الحذف الموصوفة هنا يمكن تطبيقها على إدراج الجينات إلى مواضع محددة، وإدخال طفرات في مواقع محددة في Y. lipolytica الجينوم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. الجيل من Y. lipolytica KU70 حذف الانفعال

  1. بناء كاسيت انقطاع
    ملاحظة: انظر الجدول رقم 1 لجميع البادئات المستخدمة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) التكبير.
    1. الاشعال تصميم 20 إلى PCR تضخيم كاسيت التعبير LEU2 (انظر الجدول 1) من Y. lipolytica ناقلات التعبير وإدخال مواقع LoxP إلى 5 'و 3' تنتهي من الكاسيت LEU2 مع التمهيدي طويلة إلى الأمام (رقم 1، الجدول 1) والتمهيدي العكسي الطويل (رقم 2، الجدول 1)، على التوالي. لإدخال موقع تقييد إضافي لخطوات لاحقة من عملية الاستنساخ، إضافة موقع تقييد بام مرحبا في التمهيدي # 1.
    2. أداء PCR باستخدام عالية الدقة الحمض النووي بوليميريز كما هو موضح في الجدول رقم (2).
    3. تنقية المنتج PCR LoxP-المروج LEU2-فاصل-LoxP كاسيت باستخدام PCR purificatioن عدة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. إضافة يتدلى 3'-A للمنتج PCR المنقى وفقا لتعليمات الشركة الصانعة 21. استخدام T4 DNA يغاز لligate في الذيل منتج PCR في ناقلات الاستنساخ TA لانتاج البلازميد T-LEU2 حسب الجدول 3.
    4. PCR تضخيم 1 كيلوبايت 5 'تسلسل المنبع من الجين KU70 باستخدام بادئات # 3 / # 4 من Y. lipolytica Po1g الحمض النووي الجيني 22 كما في الجدول 2. تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      1. ضعف هضم كل من المنتج PCR المنقى وبلازميد تي LEU2 مع كيس الثاني وبام مرحبا الإنزيمات حسب الجدول 4. تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام يغاز T4 الحمض النووي لligate المطهرون وهضم المنتج PCR للكيس الثاني / مواقع بام مرحبا تي LEU2 لتحققبلازميد تي LEU2-5E حسب الجدول 3.
    5. PCR تضخيم 1 كيلوبايت 3 'تسلسل المصب من الجينات KU70 باستخدام بادئات # 5 / # 6 من Y. lipolytica Po1g الحمض النووي الجيني 22 كما في الجدول 2. تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ضعف هضم كل من المنتج PCR المنقى وبلازميد تي LEU2-5E مع ليس أنا وتجربة الاقتراب من الموت أنا الإنزيمات حسب الجدول 4.
      1. تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ثم، ligate المطهرون وهضم المنتج PCR ليست I / تجربة الاقتراب من الموت أنا مواقع T-LEU2-5E لانتاج البلازميد T-KO باستخدام يغاز T4 DNA كما في الجدول 3.
    6. هضم البلازميد T-KO مع كيس الثاني وتجربة الاقتراب من الموت أنا الإنزيمات حسب الجدول رقم 4 لانتاج الكاسيت تعطيل (الشكل 1 ). تنقية شظايا الحمض النووي يهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
  2. إعداد الخلايا المختصة والتحول من Y. سلالة lipolytica Po1g
    1. إعداد خلية مختصة
      1. تطعيم مستعمرة Y. lipolytica Po1g سلالة من لوحة الخميرة الطازجة استخراج-ببتون-سكر العنب (YPD) في 10 مل من YPD المتوسطة (1٪ خلاصة الخميرة، 2٪ ببتون، 2٪ سكر العنب و 50 ملي سيترات عازلة درجة الحموضة 4.0) في قارورة 100 مل. احتضان في 30 درجة مئوية تهز حاضنة في 225 دورة في الدقيقة لمدة 20 ساعة حتى تشبع (وهو OD 600 من حوالي 15، وتقاس باستخدام مقياس الطيف الضوئي).
      2. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 5000 x ج في درجة حرارة الغرفة. غسل الخلايا مع 20 مل تريس، EDTA (TE) العازلة (10 ملي تريس، 1 ملم EDTA، ودرجة الحموضة 7.5)، وبيليه الخلايا كما هو موضح في الخطوة 1.2.1.2. Resuspend الخلايا في 1 مل من 0.1 M خلات الليثيوم (6.0 درجة الحموضة، معدلة مع حمض الخليك)، واحتضان لمدة 10 دقيقة في تيمبي الغرفةrature.
      3. قسامة الخلايا المختصة (100 ميكرولتر) إلى العقيمة 1.5 مل أنابيب. الشروع في خطوات التحول أدناه مباشرة، أو إضافة الجلسرين إلى تركيز النهائي من 25٪ (ت / ت) ومخزن في -80 درجة مئوية لمدة التخزين على المدى الطويل.
    2. تحويل
      1. المزيج بلطف 10 ميكرولتر من التشويه والتحريف الحمض النووي السلمون الحيوانات المنوية (10 ملغ / مل) و1-5 ميكروغرام من الكاسيت اضطراب النقي مع 100 ميكرولتر من الخلايا المختصة، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
      2. إضافة 700 ميكرولتر من 40٪ البولي ايثيلين جلايكول (PEG) -4000 (المنحلة في 0.1 M الليثيوم خلات درجة الحموضة 6.0)، تخلط جيدا واحتضان في 30 درجة مئوية تهز حاضنة في 225 دورة في الدقيقة لمدة 60 دقيقة.
        ملاحظة: من المهم استخدام الربط مع متوسط ​​الوزن الجزيئي 4000، بدلا من PEG-3350 (التي تستخدم عادة في التحول من الخميرة التقليدية).
      3. الحرارة صدمة الخليط التحول عن طريق وضع أنبوب في 39 ° C حمام الماء لمدة 60 دقيقة.
      4. إضافة 1 مل المتوسطة YPD واستعادة لمدة 2 ساعة عند 30 درجة مئوية و 225 دورة في الدقيقة. أجهزة الطرد المركزي في 9000 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وإزالة طاف و resuspend بيليه في 1 مل من العازلة TE.
      5. Repellet الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 9000 x ج لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، وتجاهل طاف. Resuspend وبيليه في 100 ميكرولتر من العازلة TE ولوحة على لوحات مختارة (على سبيل المثال، لوحات، ليسين ناقص)، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
      6. اختيار 4-10 المستعمرات واحد وتطعيم بشكل منفصل إلى 2 مل من YPD المتوسطة. احتضان بين عشية وضحاها في هز حاضنة 30 درجة مئوية في 225 دورة في الدقيقة. تحديد المستعمرات الإيجابية عن طريق تحليل PCR من الحمض النووي الجيني من transformants 22 كما في الجدول رقم 5 باستخدام مجموعتين من الاشعال # 55 / # 56 و # 56 / # 57 على التوالي.
        ملاحظة: ليس أنا خطي يتم تحويل pYLEX1 متجه إلى Y. lipolytica Po1g الخلايا المختصة من أجل تحديد كفاءة التحول عن طريق حساب عددمن مستعمرة (كفو) في البلازميد ميكروغرام الحمض النووي المستخدمة 23.

2. علامة الإنقاذ

  1. بناء التعبير البلازميد لجنة المساواة العرقية
    1. بناء pYLEX1-لجنة المساواة العرقية وpYLEX1-الحلمة
      1. الاشعال تصميم 20 إلى PCR تضخيم إطارات القراءة المفتوحة لجنة المساواة العرقية والحلمة. إضافة الأدينين النوكليوتيدات إضافية المنبع من الكودونات بداية في الاشعال إلى الأمام رقم 82 ورقم 84، وإدراج مواقع تقييد كبن أنا المصب من كودونات توقف في الاشعال عكس # 83 و # 85. PCR تضخيم إطارات القراءة المفتوحة لجنة المساواة العرقية و الحلمة من pSH69 (عدد الانضمام HQ412578) 24 كما في الجدول 2.
      2. تنقية كل من لجنة المساواة العرقية وشظايا الحلمة باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ملخص كل من تنقيته لجنة المساواة العرقية والحلمة شظايا مع كبن أنا انزيم حسب طبله 4. مضاعفة هضم البلازميد pYLEX1 مع حزب الرابطة الاسلامية الأولى وكبن أنا الإنزيمات حسب الجدول 4. تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      3. استخدام يغاز T4 DNA كما في الجدول 3 إلى ligate لجنة المساواة العرقية والحلمة شظايا النقاء وهضمها لمواقع حزب الرابطة الاسلامية I / كبن الأول من Y. ناقلات التعبير lipolytica، مما أسفر عن pYLEX1-لجنة المساواة العرقية وpYLEX1-الحلمة، على التوالي.
    2. بناء pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة
      1. PCR تضخيم كاسيت المروج الجينات فاصل من لجنة المساواة العرقية من pYLEX1-لجنة المساواة العرقية باستخدام بادئات # 86 / # 87 المرافقة سال I / الباسيفيكي أنا تقييد مواقع حسب الجدول 2. تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة .
        1. ضعف هضم كل من المنتج PCR تنقية وpSL16-CEN1-1 (227) البلازميد 25 مع سال الأول والباسيفيكي أنا الإنزيمات حسب الجدول 4. تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ثم، ligate المنتج المنقى وهضمها PCR إلى pSL16-CEN1-1 (227) في المواقع المقابلة لخلق pSL16-لجنة المساواة العرقية باستخدام يغاز T4 DNA كما في الجدول 3.
      2. PCR تضخيم كاسيت المروج الجينات فاصل من الحلمة من pYLEX1-الحلمة باستخدام بادئات # 88 / # 89 المرافقة تقييد مواقع Xho I / BGL الثاني كما في الجدول 2. تنقية المنتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة .
        1. ضعف هضم كل من المنتج PCR المنقى وpSL16-لجنة المساواة العرقية البلازميد مع إنزيمات Xho الأول والثاني BGL كما في الجدول (4). تنقية خليط الهضم باستخدام طقم تنقية PCR وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. ثم، ligate المنتج المنقى وهضمها PCR إلى pSL16-لجنة المساواة العرقية في المقابلةمواقع لتوليد pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة باستخدام يغاز T4 DNA كما في الجدول 3.
          ملاحظة: أدى لجنة المساواة العرقية التعبير البلازميد، pSL16-لجنة المساواة العرقية، الحلمة، يؤوي اختيار علامة هيغروميسين B و هو متجه القسيم المركزي وتكرار episomally (الشكل 2).
      3. التحقق من جميع بنيات عن طريق الهضم مع الانزيمات تقييد المناسبة (على سبيل المثال، سال I / الباسيفيكي الأول، لاستئصال إدراج من ناقلات) كما في الجدول (4).
  2. لجنة المساواة العرقية بوساطة recombinase الإنقاذ علامة
    1. تحويل pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة إلى داخل الخلايا المختصة من سلالة خروج المغلوب KU70 بعد بروتوكول التحول هو موضح في القسم 1.2 أعلاه. لوحة تتحول الخلايا على YPD بالإضافة إلى هيغروميسين ب (YPDH) لوحات (التي تحتوي على 400 ميكروغرام / مل هيغروميسين B)، واحتضان عند 30 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام.
    2. أداء مستعمرة PCR كما في الجدول رقم 5 باستخدام بادئات # 84 / # 85 لتحديد إيجابيالمستعمرات التي تحتوي على pSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة البلازميد بعد التحول.
      ملاحظة: إلى الأمام التمهيدي 84 # و 85 عكس التمهيدي # تقع داخل المنطقة الترميز من الحلمة الجين (الجدول 1). إلا استنساخ الإيجابية تولد منتج PCR محددة في رد فعل PCR.
    3. اختيار استنساخ إيجابي وتطعيم إلى 2 مل من YPDH المتوسطة، واحتضان في 30 درجة مئوية تهز حاضنة في 225 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها إلى التشبع. قياس OD خلية 600 مع معمل. حصاد الخلايا في أحد OD 600 من ~ 15. أجهزة الطرد المركزي في 5000 x ج لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ويغسل مرة واحدة مع 2 مل من الماء المعقم.
    4. إعادة تلقيح الخلايا في 2 مل من YPD المتوسطة مع OD الأولي 600 من 0.1 وتسمح للخلايا أن تنمو في 30 ° C هز حاضنة في 225 دورة في الدقيقة ليلة وضحاها. خط لزراعة الخلايا بين عشية وضحاها على لوحات YPD لعزل المستعمرات واحد 23. المستعمرات لوحة طبق على YPD، YPDH، واللوحات، ليسين ناقص 23 .
      ملاحظة: المستعمرات التي فقدت كلا علامة LEU2 وpSL16-لجنة المساواة العرقية-الحلمة البلازميد يمكن أن تنمو فقط على لوحات YPD (الشكل 3).

3. حذف الكحول هيدروجيناز والكحول أوكسيديز الجينات

  1. إجراء بحث على Y. قاعدة بيانات الجينوم البشري lipolytica باستخدام المحلية محاذاة البحث أداة الأساسية (انفجار) للتعرف على المرشحين الجيني للحذف 26. إدخال تسلسل البروتين من S. خميرة الكحول نازعة أنا إلى أداة البحث انفجار (http://www.genome.jp/tools-bin/search_sequence؟prog=blast&db=yli&seqid=aa).
    ملاحظة: أداة البحث انفجار ترجع تسلسل البروتين الأكثر مماثلة في Y. قاعدة بيانات الجينوم البشري lipolytica.
  2. بناء أشرطة الحذف بواسطة PCR مع الاشعال رقم 7 إلى رقم 56 (الجدول 1)، وأداء تقييد انزيم الهضم وردود الفعل ربط باستخدام نفس الأساليب كما هو موضح في القسم 1.1 أعلاه.
  3. الإعداديةهي خلايا المختصة من سلالة خروج المغلوب KU70، إجراء تحولات وأداء PCR لتحديد المستعمرات الإيجابية مع الاشعال # 55، # 58 إلى رقم 81 (الجدول 1) باتباع البروتوكول هو موضح في القسم 1.2 أعلاه.
    ملاحظة: وكمثال على ذلك، وصفت الإجراء لحذف الجينات YALI0E17787g في أرقام 4 و 5. يتم الإبلاغ عن آثار 1 كيلو بايت والمنطقة المتجانسة 2 كيلوبايت طويلة على معدل إعادة التركيب مثلي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

وY. خطي تم إدراج ناقلات التعبير lipolytica إلى منصة لرسو السفن ببر في الجينوم من Y. lipolytica Po1g سلالة طريق إجراء كروس إعادة التركيب واحد (27). باستخدام الإجراء التحول الكيميائي السريع التي أنشئت في هذه الدراسة، وY. خطي تم تحويل ناقلات التعبير lipolytica بنجاح في البرية من نوع Po1g سلالة في كفاءة تحويل> 100 وت / ميكروغرام الحمض النووي. تم تحويل شريط كاسيت خروج المغلوب يحيط بها 1 كيلو باي...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

وهدفنا في هذه الدراسة هو تمكين جيل سريع وفعال بالضربة القاضية جين المستهدفة في Y. lipolytica Po1g سلالة وتحتاج العديد من الاعتبارات التي يتعين معالجتها لتحقيق هذا. أولا، لا بد من كفاءة تحويل عالية. وهكذا، فإن بروتوكول التحول الكيميائي فعالة ومريحة للY. وقد وصفت lipolytica Po1g سلالة في هذه الدراسة. استخدام PEG-4000 هو عامل حاسم للتحول الناجح لهذه السلالة. لم يتم الحصول على transformants للتحول بلازميد عند استخدام PEG-3350 (للتحول من البيرة س...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

نحن الامتنان الدعم بتمويل من وكالة البيئة الوطنية في سنغافورة (برنامج التعليم والتدريب 1201102)، وبرنامج البحوث التنافسية للمؤسسة القومي للبحوث في سنغافورة (جبهة الخلاص الوطني، CRP5-2009-03)، وكالة للعلوم والتكنولوجيا والبحوث في سنغافورة ( 1324004108)، العالمية R & D برنامج مشروع، وزارة اقتصاد المعرفة، وجمهورية كوريا (N0000677)، وكالة خفض التهديد الدفاعي (اثناء اجتماع السلطة، HDTRA1-13-1-0037) وعلم الأحياء الاصطناعية مبادرة من الجامعة الوطنية في سنغافورة ( DPRT / 943/09/14).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
<قوي > كاشف / مادة < / قوي >
أوليغونوكليوتيد بادئاتمتكاملة تقنياتالمتكاملة 25 nmole DNA oligos
Y. lipolytica < em > سلالة Po1gYeast Biotechleucine auxotrophic مشتق من سلالة النوع البري W29 (ATCC 20460)
ناقلات pYLEX1Yeast BiotechFYY203-5MGY. lipolytica< / em> ناقل التعبير
الإشريكية القولونية < / em> TOP10Invitrogenلاستنساخ ونشر البلازميدات
pGEM-T vector  PromegaA3600TA استنساخ ناقلات
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106لمعالج عزل البلازميد
SV Gel و
PCR Clean-Up System		PromegaA9282استخرج شظايا الحمض النووي من المواد الهلامية الاغاروز
وتنقية منتجات PCR من تفاعل تضخيم
iProof عالية الدقة
DNA polymerase		Bio-Rad172-5302بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة
BamHI & nbsp ؛نيو إنجلاند بيولابسR0136Sإنزيم التقييد
BglII  إنزيم تقييد نيو إنجلاندبيولابس R0144L
KpnIنيو إنجلاند بيولابزR0142Sإنزيم التقييد
NdeI إنزيم التقييدNew EnglandBiolabs R0111S
NotINew England BiolabsR0189Lإنزيم التقييد
PmlINew England BiolabsR0532Sإنزيم التقييد
PstI إنزيم تقييد نيو إنجلاندبيولابز R0140S
SacIIنيو إنجلاند بيولابزR0157Sإنزيم التقييد
Saliنيو إنجلاند بيولابزR0138Sإنزيم التقييد
XhoIنيو إنجلاند بيولابزR0146Lإنزيم التقييد
T4 DNA ligaseنيو إنجلاند بيولابزM0202L
Taq DNA polymerase & نب سب.Bio-RadM0267L
AmpicillinGibco-Life Technologies11593-027المضادات الحيوية
Hygromycin BPAAP21-014المضادات الحيوية
GeneRuler 1 كيلو بايت سلم الحمض النوويThermo ScientificSM03121 كيلو بايت سلم الحمض النووي
PEG4000Sigma95904-F
TrisPromegaH5135
EDTABio-Rad161-0729
السلمون المنوية الحمض النوويInvitrogen15-632-011
ليثيوم أسيتاتسيجما
حمض الخليكسيجما
حبات زجاجية (425-600 & micro; م)SigmaG8772
RNAse AThermo ScientificEN0531
DNA تحميل صبغةحراري علميR0611
باكتو مستخلص الخميرةBD212750
باكتو الببتونBD211677
D-Glucose1st BaseBIO-1101
YNB بدون أحماض أمينيةSigmaY0626
DO مكمل غذائي - ليوكلونتك630414
جلسرينسيجماG5516
ديفكو LB مرقديناربحريني 244620
ديفكو إل بي أجارديناربحريني 244520
باكتو أجارديناربحريني 214010
<قوي>معدات< قوي>
آلة PCRBioradT100 Thermal Cycler
حمام مائيMemmertWNB 14
حاضنة ثابتة / اهتزازYihderLM-570RD
شاكر حراريAllshengMS-100
أجهزة طرد مركزي صغيرةEppendorf5424R
طردEppendorf5810R
مقياس الطيفالضوئي Eppendorf مقياس الضوء الحيوي بالإضافة إلى
تصوير جلGEAmersham Imager 600
الحمض النووي أجهزة مركزي

المراجع

  1. Jiménez-Bremont, J. F., Rodrìguez-Hernández, A. A., Rodrìguez-Kessler, M. Development and dimorphism of the yeast Yarrowia lipolytica. Dimorphic fungi: Their importance as models for differentiation and fungal pathogenesis. J, R. uiz-H. errera , 58-66 (2012).
  2. Coelho, M., Amaral, P., Belo, I. Yarrowia lipolytica: an industrial workhorse. Current research, technology and education topics in applied microbiology and microbial biotechnology. Méndez-Vilas, A. , 930-940 (2010).
  3. Martinez-Vazquez, A., et al. Identification of the transcription factor Znc1p, which regulates the yeast-to-hypha transition in the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Plos One. 8 (6), e66790(2013).
  4. Richard, M., Quijano, R. R., Bezzate, S., Bordon-Pallier, F., Gaillardin, C. Tagging morphogenetic genes by insertional mutagenesis in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Bacteriol. 183 (10), 3098-3107 (2001).
  5. Flores, C. L., Martìnez-Costa, O. H., Sánchez, V., Gancedo, C., Aragòn, J. J. The dimorphic yeast Yarrowia lipolytica possesses an atypical phosphofructokinase: characterization of the enzyme and its encoding gene. Microbiology. 151 (5), 1465-1474 (2005).
  6. Domìnguez, Á, et al. Non-conventional yeasts as hosts for heterologous protein production. Int. Microbiol. 1 (2), 131-142 (1998).
  7. Zinjarde, S. S. Food-related applications of Yarrowia lipolytica. Food Chem. 152, 1-10 (2014).
  8. Finogenova, T., Morgunov, I., Kamzolova, S., Chernyavskaya, O. Organic acid production by the yeast Yarrowia lipolytica: a review of prospects. Appl. Biochem. Micro+. 41 (5), 418-425 (2005).
  9. Groguenin, A., et al. Genetic engineering of the β-oxidation pathway in the yeast Yarrowia lipolytica to increase the production of aroma compounds. J. Mol. Catal. B-Enzym. 28 (2), 75-79 (2004).
  10. Meng, X., et al. Biodiesel production from oleaginous microorganisms. Renew. Energ. 34 (1), 1-5 (2009).
  11. Papanikolaou, S., Aggelis, G. Lipid production by Yarrowia lipolytica growing on industrial glycerol in a single-stage continuous culture. Bioresource Technol. 82 (1), 43-49 (2002).
  12. Tai, M., Stephanopoulos, G. Engineering the push and pull of lipid biosynthesis in oleaginous yeast Yarrowia lipolytica for biofuel production. Metab. Eng. 15, 1-9 (2013).
  13. Liu, H. H., Ji, X. J., Huang, H. Biotechnological applications of Yarrowia lipolytica: Past, present and future. Biotechnol. Adv. 33 (8), 1522-1546 (2015).
  14. Liu, L., Alper, H. S. Draft genome sequence of the oleaginous yeast Yarrowia lipolytica PO1f, a commonly used metabolic engineering host. Genome Announc. 2 (4), e00652-e00614 (2014).
  15. Dujon, B., et al. Genome evolution in yeasts. Nature. 430 (6995), 35-44 (2004).
  16. Chen, D. C., Beckerich, J. M., Gaillardin, C. One-step transformation of the dimorphic yeast Yarrowia lipolytica. Appl. Microbial. Biotechnol. 48 (2), 232-235 (1997).
  17. Wang, J. H., Hung, W., Tsai, S. H. High efficiency transformation by electroporation of Yarrowia lipolytica. J. Microbiol. 49 (3), 469-472 (2011).
  18. Matsuoka, M., et al. Analysis of regions essential for the function of chromosomal replicator sequences from Yarrowia lipolytica. Mol. Gen. Genet. 237 (3), 327-333 (1993).
  19. Kretzschmar, A., et al. Increased homologous integration frequency in Yarrowia lipolytica strains defective in non-homologous end-joining. Curr. Genet. 59 (1-2), 63-72 (2013).
  20. Lorenz, T. C. Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies. J. Vis. Exp. (63), e3998(2012).
  21. Kobs, G. Cloning blunt-end DNA fragments into the pGEM-T Vector Systems. Promega Notes. 62, 15-18 (1997).
  22. JoVE Science Education Database. Isolating Nucleic Acids from Yeast. Essentials of Biology 1: yeast, Drosophila and C. elegans. , JoVE. Cambridge, MA. Available from: http://www.jove.com/science-education/5096/isolating-nucleic-acids-from-yeast (2016).
  23. Sanders, E. R. Aseptic laboratory techniques: plating methods. J. Vis. Exp. (63), e3064(2012).
  24. Hegemann, J. H., Heick, S. B. Delete and repeat: a comprehensive toolkit for sequential gene knockout in the budding yeast Saccharomyces cerevisiae. Methods Mol. Biol. 765, 189-206 (2011).
  25. Yamane, T., Sakai, H., Nagahama, K., Ogawa, T., Matsuoka, M. Dissection of centromeric DNA from yeast Yarrowia lipolytica and identification of protein-binding site required for plasmid transmission. J. Biosci. Bioeng. 105 (6), 571-578 (2008).
  26. McGinnis, S., Madden, T. L. BLAST: at the core of a powerful and diverse set of sequence analysis tools. Nucleic Acids Res. 32 ((Web Server issue)), W20-W25 (2004).
  27. Madzak, C., Tréton, B., Blanchin-Roland, S. Strong hybrid promoters and integrative expression/secretion vectors for quasi-constitutive expression of heterologous proteins in the yeast Yarrowia lipolytica. J. Mol. Microbiol. Biotechnol. 2 (2), 207-216 (2000).
  28. Nicaud, J. M., Le Clainche, A., Le Dall, M. T., Wang, H., Gaillardin, C. Yarrowia lipolytica, a yeast model for the genetic studies of hydroxy fatty acids biotransformation into lactones. J. Mol. Catal. B-Enzym. 5 (1), 175-181 (1998).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

Yarrowia Lipolytica KU70 Cre LoxP
الهندسة الوراثية من الخميرة غير تقليدية للالمتجددة الوقود الحيوي وإنتاج البيوكيميائية
اتصل بنا
أوصِ بها للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

2026 © حقوق الطبع والنشر MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.