مقالة منهجية

تصميم الأجهزة ميكروفلويديك لدراسة الردود الخليوي تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية / إجهاد القص المحفزات

DOI:

10.3791/54397

⸱

أغسطس 13, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Agricultural Chemistry, National Taiwan University, 2Department of Physics, Fu-Jen Catholic University, 3Research Center for Applied Sciences, Academia Sinica

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
توفر

الأجهزة الدقيقة المدمجة مع المكونات السائلة منصة في المختبر لدراسات الخلايا التي تحاكي البيئة الدقيقة في الجسم الحي. قمنا بتطوير رقائق الموائع الدقيقة القائمة على بولي ميثيل ميثاكريلات لدراسة الاستجابات الخلوية تحت محفزات الإجهاد الكيميائية / الكهربائية / القص المفردة أو المتعايشة.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أجهزة ميكروفلويديك قادرة على خلق الخلوية البيئة الصغيرة الدقيقة والسيطرة عليها من درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وتركيز الملح، وغيرها من المحفزات المادية أو الكيميائية. وقد تستخدم عادة لفي الدراسات المختبرية الخلية من خلال توفير في الجسم الحي مثل المناطق المحيطة بها. خصوصا، كيف إستجابة الخلايا لالتدرجات الكيميائية، المجالات الكهربائية، واجهادات القص وضعت العديد من المصالح حيث أن هذه الظواهر ليست مهمة في فهم خصائص ووظائف الخلوية. هذه الرقائق الموائع الدقيقة يمكن أن تكون مصنوعة من ركائز الزجاج، رقائق السليكون، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) البوليمرات، البولى (PMMA) ركائز، أو بولي إيثيلين تيرفثالات ركائز (PET). من هذه المواد، ركائز PMMA رخيصة ويمكن معالجتها بسهولة باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة. على الرغم من أن عدد قليل من أجهزة ميكروفلويديك وقد تم تصميم وملفقة لتوليد متعددة، تتعايش المحفزات الكيميائية والكهربائية، اعتبر أيا منهافعالة بما فيه الكفاية في الحد من تكرار التجربة، خاصة لأغراض الفحص. في هذا التقرير، وصفنا لدينا تصميم وتصنيع اثنين من رقائق ميكروفلويديك القائم على PMMA للتحقيق في الاستجابات الخلوية، في إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية والهجرة، تحت الكيميائية / الكهربائية محفزات الإجهاد / القص واحدة أو التعايش. الشريحة الأولى يولد خمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 في المناطق الثقافة، جنبا إلى جنب مع التدرج إجهاد القص التي تنتج داخل كل من هذه المجالات. الشريحة الثانية يولد نفس التركيزات النسبية، ولكن مع خمسة مختلفة شدة المجال الكهربائي التي تم إنشاؤها ضمن كل منطقة ثقافة. هذه الأجهزة لا توفر سوى الخلايا مع دقة، يمكن السيطرة عليها البيئة الصغيرة، ولكن أيضا زيادة كبيرة في الإنتاجية التجريبية.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

في محاصرون خلايا الجسم الحي من قبل مجموعة متنوعة من الجزيئات الحيوية بما في ذلك المصفوفة خارج الخلية (ECM)، والكربوهيدرات، والدهون، والخلايا الأخرى. أنها functionalize من خلال الاستجابة للمؤثرات البيئية الصغيرة مثل التفاعل مع ECM والردود على التدرجات الكيميائية من عوامل النمو المختلفة. تقليديا، يتم إجراء دراسات الخلايا في المختبر في أطباق زراعة الخلايا حيث استهلاك الخلايا والكواشف كبير وتنمو الخلايا في ثابت (غير المتداولة) البيئة. في الآونة الأخيرة، وقد وفرت الأجهزة ملفقة الصغيرة تتكامل مع مكونات الموائعية منصة بديلة للدراسات الخلية بطريقة أكثر يمكن السيطرة عليها. هذه الأجهزة قادرة على خلق بيئة صغيرة دقيقة من المحفزات الكيميائية والفيزيائية مع التقليل من استهلاك الخلايا والكواشف. ويمكن إجراء هذه الرقائق ميكروفلويديك من ركائز الزجاج، رقائق السليكون، ثنائي ميثيل بولي سيلوكسان (PDMS) البوليمرات، البولى (PMMA) ركائز، أو polyethylenetereالفثالات (PET) ركائز 1-3. الأجهزة القائمة PDMS-شفافة وحيويا، ومنفذة للغازات، مما يجعلها مناسبة لزراعة الخلايا على المدى الطويل والدراسات. PMMA وPET ركائز هي رخيصة وسهلة لتتم معالجتها باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة.

يجب أن أجهزة ميكروفلويديك توفر الخلايا مع الدقيقة بيئة مستقرة وتحت السيطرة حيث الخلايا تخضع للمؤثرات الفيزيائية الكيميائية المختلفة و. على سبيل المثال، تستخدم رقائق ميكروفلويديك لدراسة الكيميائي للخلايا. بدلا من الطرق التقليدية التي تستخدم بويدن غرفة والشعرية 4،5 هذه الأجهزة الموائعية المنمنمة يمكن أن تولد التدرجات الكيميائية الدقيقة لدراسة السلوكيات الخلايا 1،6،7. مثال آخر هو دراسة هجرة الخلايا الاتجاه تحت المجالات الكهربائية (EFS)، وهي ظاهرة اسمه انجذاب كهربي. تم الإبلاغ عن السلوكيات Electrotactic من الخلايا لتكون ذات صلة تجديد الأعصاب 8، 9 التطور الجنيني،والتئام الجروح 10،11. وأجريت العديد من الدراسات للتحقيق في انجذاب كهربي من مختلف أنواع الخلايا بما في ذلك خلايا سرطان 12،13، 14،15 الخلايا اللمفية، خلايا سرطان الدم 11، والخلايا الجذعية 16. تقليديا، يتم استخدام أطباق بتري ونظارات غطاء لبناء غرف electrotactic لتوليد التماثلية 17. هذه الاجهزة بسيطة تثير مشاكل التبخر المتوسطة والتماثلية غير دقيقة، ولكن يمكن التغلب عليها عن طريق أجهزة ميكروفلويديك قنوات الموائعية المغلقة، واضحة المعالم 12،18،19.

لدراسة منهجية الاستجابات الخلوية تحت مؤثرات الكيميائية والكهربائية الدقيقة، يمكن السيطرة عليها، فإنه سيكون ذا فائدة كبيرة لتطوير أجهزة ميكروفلويديك قادرة على توفير الخلايا مع مؤثرات متعددة في نفس الوقت. على سبيل المثال، لي وآخرون. ذكرت جهاز ميكروفلويديك القائم PDMS لخلق واحدة أو تتعايش التدرجات الكيميائية والتماثلية 20. كاو وآخرون. ديفهربت شريحة ميكروفلويديك مماثل لتعديل الكيميائي للخلايا سرطان الرئة بواسطة التماثلية 6. وعلاوة على ذلك، لزيادة الإنتاجية، هوى وآخرون. تصميم وملفقة شريحة متعددة المزدوج والكهربائية والميدانية القائمة على PMMA لتوفير الخلايا مع 8 مختلف المحفزات مجتمعة، (تركيز 2 نقاط القوة EF × 4 الكيميائية) يجري 21. لزيادة في جميع أنحاء وإضافة حافز إجهاد القص، وضعنا جهازين ميكروفلويديك القائم على PMMA لدراسة الاستجابات الخلوية تحت واحدة أو تتعايش الكيميائية / الكهربائية محفزات الإجهاد / القص.

رواه لو وآخرون 22،23، وهذه الأجهزة تحتوي على خمس قنوات الثقافة خلية مستقلة تخضع لالمستمر فلويديك التدفق، ومحاكاة في الجسم الحي الدورة الدموية. في الشريحة الأولى (المادة الكيميائية القص رقاقة الإجهاد أو رقاقة CSS)، وخمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 يتم إنشاؤها في المناطق الثقافة، والتدرج إجهاد القص هو الم Ùدائرة الهندسة المدنية داخل كل مجال من مجالات الثقافة الخمسة. في الشريحة الثانية (رقاقة الكيميائية الكهربائية الحقل أو رقاقة مركز دراسات الحدود)، وذلك باستخدام مجموعة واحدة واحدة من الأقطاب الكهربائية ومضخات 2 حقنة، يتم إنشاء خمسة نقاط القوة EF بالإضافة إلى خمسة التركيزات الكيميائية المختلفة داخل هذه المناطق الثقافة. يتم تنفيذ العمليات الحسابية العددية ومحاكاة لتصميم أفضل وتعمل هذه الرقائق، وخلايا سرطان الرئة مثقف داخل هذه الأجهزة تخضع للمؤثرات واحدة أو التعايش لرصد استجاباتها فيما يتعلق إنتاج أنواع الاكسجين التفاعلية (ROS)، معدل الهجرة، واتجاه الهجرة. وأثبتت هذه الرقائق لتكون، الإنتاجية العالية والأجهزة الموثوقة للتحقيق في كيفية استجابة الخلايا لمختلف المحفزات الدقيقة البيئية لتوفير الوقت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. تصميم رقاقة وتلفيق

  1. رسم أنماط أن يكون ذاب على ركائز PMMA والأشرطة ضعف الجانب باستخدام البرمجيات التجارية (24).
    1. لدراسة تأثيرات التركيزات الكيميائية والضغوط القص، رسم "شجرة عيد الميلاد" نمط بعرض متفاوتة في نهايته في كل مجال من مجالات الثقافة الخمس (الشكل 1A و 1B).
    2. لدراسة تأثيرات التركيزات الكيميائية والمجالات الكهربائية، رسم "شجرة عيد الميلاد" نمط مع اثنين من أكثر القنوات الموائعية للجسور الملح (الشكل 2A و 2B).
  2. الكاتب نمط الفردية على ورقة PMMA أو الشريط المزدوج الجانب عن طريق تحميل الملف المقابل إلى خطاط ليزر CO 2.
    1. بدوره على الناسخ الليزر، وتحقق من ارتباطه بجهاز الكمبيوتر. فتح نمط أن يكون ذاب باستخدام البرمجيات التجارية.
    2. وضع ورقة PMMA أو الوجهين الشريط سن أعلى مرحلة من الناسخ. ضبط بؤرة ليزر CO 2 إذا لزم الأمر باستخدام شريط المعايرة ومرئية ليزر وني.
    3. تحميل نمط إلى خطاط لالاجتثاث على ورقة PMMA أو الشريط.
    4. التقط ورقة منقوشة أو الشريط، وإزالة قطع غير المرغوب فيها، وتنظيف السطح مع تهب النيتروجين.
      ملاحظة: سمك ورقة PMMA هي 1 ملم، وذلك من وجهين الشريط هو 0.07 ملم أو 0.22 مم.

2. الجمعية رقاقة

  1. مع سوبر الغراء، ونعلق محولات الاكريليك (طول × عرض × الارتفاع = 10 مم × 10 مم × 5 مم، مع المواضيع المسمار في الوسط) إلى الأعلى الأكثر طبقة من شرائح عن طريق مواءمة المواضيع المسمار والثقوب على أعلى طبقة -most. هذه المحولات بمثابة المتوسطة مداخل / مخارج والروابط جسر الملح.
  2. تجميع رقاقة ميكروفلويديك داخل غطاء تدفق الصفحي.
  3. تجميع رقاقة ميكروفلويديك الإجهاد الكيميائية القص (CSS رقاقة).
    1. اttach 3 ورقة من أوراق PMMA مكتوب باستخدام 2 قطعة من مكتوب الشريط على الوجهين. (الشكل 1A و 1B).
    2. إضافة المزيد من قطعة واحدة من الشريط مزدوجة من جانب 0.07 مم إلى الجزء السفلي من رقاقة وإرفاق رقاقة إلى 10 سم القطر طبق بيتري.
    3. وضع رقاقة تجميع في فراغ الغرفة ليلة وضحاها.
  4. لتجميع شرائح الحقل الكيميائية الكهربائية (مركز دراسات الحدود رقاقة)، ​​ونعلق ورقة PMMA إلى الشريط على الوجهين من سمك = 0.22 مم (الشكل 2A و 2B).
    1. إرفاق ورقة PMMA مكتوب والشريط على الوجهين إلى 10 سم القطر طبق بيتري باستخدام هذا نفس قطعة من الشريط.
  5. ترك الشريحة تجميعها داخل غطاء محرك السيارة وتعرضها للأشعة فوق البنفسجية لمدة 30 دقيقة للتعقيم.
  6. ربط مداخل لاثنين من الحقن 3 مل عبر أنابيب بلاستيكية والمكسرات إصبع ضيق. قم بتوصيل منفذ لأنبوب النفايات عبر أنبوب بلاستيكي والجوز إصبع ضيق.
    ملاحظة: الأوتوكلافجميع الأنابيب والمكسرات في 121 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة قبل الاستخدام.
  7. خفض ببطء الغطاس على حقنة لرئيس الوزراء القنوات الموائعية مع برنامج تلفزيوني. دفع الحقن ذهابا وإيابا لإزالة الفقاعات.
  8. وضع رقائق داخل حاضنة ليلا 37 درجة مئوية تحت 5٪ CO 2.
    ملاحظة: وتهدف هذه خطوتين لغسل رقاقة وإزالة أي فقاعات المتبقية داخل رقاقة.
  9. تأخذ شريحة من الحاضنة.
  10. إعداد الجسور الملح أجار لتوليد المجالات الكهربائية في رقاقة مركز دراسات الحدود.
    1. حل 3٪ انصهار منخفضة الاغاروز نقطة في المخزن 1X الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام الميكروويف.
    2. حقن الاغاروز في القناة جسر الملح على مراحل الحل وإدراج الأقطاب قبل يتصلب حل.
    3. وضع أقطاب الفضة / الفضة كلوريد في المكسرات الأنبوبية.
  11. ربط المحاقن إلى مضخات الحقنة، وباستمرار تدفق مستنبت (Dulbecco لتعديل EagleR17؛ ق المتوسطة، DMEM) في قناة الموائعية لمدة 10 دقيقة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة ليحل محل برنامج تلفزيوني.

إعداد 3. خلية وإعداد التجريبية

ملاحظة: قبل الدافئ برنامج تلفزيوني 1X، مستنبت (DMEM زائد FBS)، والتربسين في 37 ° C حمام الماء قبل الاستخدام.

  1. لوحة 2 × 10 سرطان الرئة 5 خلايا CL1-5 25،26 في طبق بتري 10 سم المتوفرة مع DMEM زائد 10٪ مصل بقري جنيني (FBS). احتضان الخلايا داخل حاضنة تحت 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية حتى 90٪ التقاء.
  2. نضح المتوسطة ويغسل خلايا مرة واحدة مع درجة حرارة ما قبل برنامج تلفزيوني 1X. إضافة 2 مل من العازلة التربسين 0.05٪ إلى الخلايا والانتظار لمدة 2 إلى 3 دقائق عند 37 درجة مئوية لفصل الخلايا.
  3. نقل الخلايا إلى 15 مل أنبوب الطرد المركزي معقمة وإضافة 6 مل من مستنبت في أنبوب. عكس بلطف أنبوب لخلط وإخراج 5 ميكرولتر من المتوسطة التي تحتوي على خلية لإحصاء عدد الخلايا في hemocytometeص.
  4. أنبوب الطرد المركزي في 300 × ز لمدة 5 دقائق. تعليق 10 6 الخلايا في 1 مل من مستنبت ووضع المتوسطة التي تحتوي على خلية في حقنة 1 مل.
  5. لبث المتوسطة التي تحتوي على الخلايا في رقاقة ميكروفلويديك من مأخذ وتأكد من أن الحل يوزع كل ذلك من خلال مجالات الثقافة الخمسة. احتضان شريحة داخل حاضنة تحت 5٪ CO 2 عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.

4. إعداد التجريبية

  1. تأخذ شريحة من الحاضنة ووضعه على رأس سخان الزجاج الشفاف أكسيد الإنديوم القصدير (ايتو).
    ملاحظة: يتم توصيل زجاج ايتو إلى وحدة تحكم يتناسب-لا يتجزأ المشتقة (PID) للحفاظ على درجة حرارة 37 ± 0.5 درجة مئوية عن طريق التغذية المرتدة من مقرنة الحراري فرضت بإحكام بين سخان ايتو ورقاقة.
  2. وضع التجميع رقاقة سخان على رأس مرحلة XY بمحركات من مجهر مقلوب لتتبع هجرة الخلايا أو مرحلة XY ثابتالمجهر الفلورسنت المقلوب لقياس إنتاج ريوس.
  3. لتوليد التركيزات الكيميائية المختلفة، وملء اثنين من المحاقن مع 5 مل من المحاليل الكيميائية تركيزات النسبية 0 و 1 (المنحلة في مستنبت) ويضخ منها إلى رقاقة في معدلات تدفق المطلوب: في الشريحة المغلق، بمعدل تدفق 0.3 مل / دقيقة لمدة 1 ساعة. في رقاقة مركز دراسات الحدود، بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة لدقيقة 20 الأولى ومعدل التدفق من 20 ميكرولتر / ساعة لمدة 120 دقيقة (مجموع الوقت = 2 ساعة) آخر.
  4. في رقاقة مركز دراسات الحدود، لتتبع هجرة الخلايا، برنامج المرحلة XY من المجهر لتكرار التقاط الصور، عبر الرقمية أحادية العدسة العاكسة (DSLR) وكاميرا، من مجال معين في وجهات النظر (FOVs) داخل مناطق ثقافة كل 15 دقيقة لمدة 2 ساعة.
  5. لقياس إنتاج ريوس، استخدم المؤشر القائم على مضان 2'-7'-dichlorodihydrofluoresce ثنائي الأسيتات (2'-7'-DCFDA).
    1. إعداد مخزون 2'-7'-DCFDA في 10 ملم في البيولوجيا الجزيئية الصف ديسلفوكسيد ميثيل ([دمس]). تمييع DCFDA في DMEM فقط دون مصل (5 ميكرومتر في DMEM). وdeacetylase المحتملة يمكن أن يزيد من الإشارات الخلفية ويقلل من الإشارات في الخلايا.
    2. بعد 1 ساعة من التحفيز إجهاد القص في رقاقة CSS أو بعد 2 ساعة من التحفيز EF في رقاقة مركز دراسات الحدود، ضخ 2'-7'-DCFDA (5 ميكرومتر في DMEM) في رقاقة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / دقيقة ل أول دقيقة 20 ومعدل التدفق من 20 ميكرولتر / ساعة لمدة 20 دقيقة أخرى. للغسيل، ضخ DMEM في رقاقة بمعدل تدفق 20 ميكرولتر / ساعة لمدة 20 دقيقة.
    3. التقاط الصور عن طريق كاميرا الجهاز المسؤول عن جانب (CCD)، من يقين FOVs داخل المناطق الثقافة لتحليل شدة الفلورسنت.

5. حسابات التركيزات الكيميائية، تؤكد القص، والحقول الكهربائية

  1. في كل رقاقة CSS ورقاقة مركز دراسات الحدود، وحساب تركيزات المواد الكيميائية في مجالات الثقافة الخمسة. على سبيل المثال، عن طريق حقن H 2 O 2 من concentrبالجمع 0 و 200 ميكرومتر من مداخل اثنين، وتركيزات 0، 25، يتم إنشاء 100، 175، و 200 ميكرومتر.
    ملاحظة: بافتراض أن جميع السوائل تقسيم تدفق بسلاسة وعلى قدم المساواة في جميع أنحاء مفترق الطرق، وتركيزات النسبية في المناطق الثقافة الخمسة هي 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 على التوالي.
  2. في الشريحة المغلق، وحساب إجهاد القص (τ) في كل مجال من مجالات الثقافة باستخدام figure-protocol-1 27، حيث س هو معدل حجم التدفق، η هو اللزوجة الموائعية، ح هو ارتفاع للقناة، وث هو عرض القناة.
    ملاحظة: من خلال وضع س = 0.3 مل / دقيقة في كل مدخل (Q = 0.12 مل / دقيقة في كل مجال من مجالات الثقافة)، η = 0.0008 با · الصورة لمستنبت، ح = 1 ملم، وث = 1 ~ 4 ملم، و يتم احتساب إجهاد القص تتراوح بين 0.0048 باسكال (4 ملم منطقة واسعة) إلى 0.0192 باسكال (1 ملم منطقة واسعة).
  3. فيرقاقة مركز دراسات الحدود، وحساب قوة EF في كل مجال من مجالات الثقافة باستخدام E = I / (الزراعة العضوية EFF) (قانون أوم)، حيث الأول هو التيار الكهربائي التي تتدفق عبر القناة الموائعية، σ هو الموصلية الكهربائية للمستنبت، ووممثل المؤسسة هي منطقة فعالة مستعرضة للقناة.
    ملاحظة: استخدام σ = 1.38 Ω -1 م -1 لمستنبت و A ممثل المؤسسة = 0.22 مم 2 (العرض = 1 ملم والارتفاع = 0.22 ملم)، ويتم احتساب قوة EF لتكون E (السيارات / مم) = أنا ( أ) × 3.3 × 10 6.
    1. كما هو مبين في الشكل 2D، علاج الدائرة المكافئة كما خمس دوائر قيصرية مع أربعة (8 + 35 + 8) قطاعات واحد (5 + 35 + 5) قطعة.
      ملاحظة: من خلال تحليل هذه الدوائر المتوازية وفقا للقانون الجهد كيرشوف وقانون أوم، التيارات المتدفقة عبر خمسة الثقافة هيكما، وأنا من 1 إلى I 5 من أسفل إلى أعلى، وتحسب أن يكون حوالي 0.49 الأول (منطقة 1)، 0.25 الأول (المنطقة 2)، 0.13 الأول (منطقة 3)، 0.08 الأول (مساحتها 4)، و 0.05 الأول (المنطقة 5) على التوالي، حيث أنا هو مجموع المباشرة الحالية (العاصمة). مع العاصمة تطبيقها من 0.157 مللي أمبير، التماثلية من 254، 130، 67، 41، و 26 فولت / مم يتم إنشاؤها داخل المناطق الثقافة الخمسة.
      ملاحظة: للاطلاع على تحليل الكهربائي مبسط للشبكة ميكروفلويديك، تعتبر جميع قطاعات الموائعية كما المقاومات مع المقاومة يتناسب مع أطوالها.

تحليل 6. البيانات

ملاحظة: يتم إجراء تحليل البيانات باستخدام برنامج يماغيج.

  1. تحليل الإنتاج ريوس.
    1. تشغيل برنامج ImageJ. انتقل إلى "ملف" → فتح لتحميل صورة الفلورسنت ليتم تحليلها.
    2. انتقل إلى "صورة" → "النوع" → "16 بت" لتغيير ايمالعمر إلى اللون الرمادي.
    3. رسم مضلع أن أرفق خلية. انتقل إلى "تحليل" → "القياس" لقياس كثافة الفلورسنت يعني من الخلية.
    4. كرر 6.1.3 لجمع شدة من 50 خلايا على الاقل من ثلاث تجارب مستقلة، وحساب كثافة متوسط ​​مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
    5. كرر 6.1.1-6.1.4 لكل حالة تجريبية.
  2. تحليل الهجرة الخلية.
    1. تشغيل برنامج ImageJ. انتقل إلى "ملف" → فتح لتحميل صورة أخذت في الوقت = 0 لتحليلها.
    2. رسم مضلع أن أرفق خلية. انتقل إلى "تحليل" → "القياس" لقياس مركز كتلة الخلية كما (س 1، ص 1).
    3. كرر 6.2.1- 6.2.2 لقياس مركز الكتلة من نفس الزنزانة (س 2، ص 2) من صورة أخرى تأخذ في الوقت = ر.
    4. حساب معدل الهجرة (في ميكرون / ساعة) منهذه الخلية كما figure-protocol-2 .
    5. كرر 6.2.1-6.2.4 لجمع معدلات الهجرة من 50 خلايا على الاقل من ثلاث تجارب مستقلة، وحساب معدل الهجرة متوسط ​​مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
    6. من 6.2.2 و6.2.3، وحساب توجيه الأعضاء الهجرة من هذه الخلية كما θ جيب التمام أو figure-protocol-3 حيث θ هي الزاوية بين متجه من EF التطبيقية (من الموجب إلى السالب) والمتجه من البداية إلى نهاية الموقف من الخلية (الشكل 2G).
    7. كرر 6.2.6 لجمع توجيه الأعضاء الهجرة من 50 خلايا على الاقل من ثلاث تجارب مستقلة، وحساب توجيه الأعضاء الهجرة متوسط ​​مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
    8. حساب معدل الهجرة متوسط ​​مع وزارة شؤون المرأة وتوجيه الأعضاء الهجرة متوسط ​​مع SEM لكل حالة تجريبية.
      ملاحظة: توجيه الأعضاء+1 يشير إلى أن جميع الخلايا تهاجر نحو الكاثود، وقيمة -1 إلى أن جميع الخلايا ترحيل نحو القطب الموجب. وتوجيه الأعضاء من مجموعة من الخلايا تتحرك عشوائيا بالقرب 0.
  3. تحليل محاذاة الخلية.
    1. تشغيل برنامج ImageJ. انتقل إلى "ملف" → "فتح" لتحميل صورة ليتم تحليلها.
    2. علاج الخلايا باعتبارها القطع الناقص ورسم خط للإشارة إلى المحور الطويل للخلية. انتقل إلى "تحليل" → "القياس" لقياس زاوية β بين خط واتجاه EF الأفقي.
    3. كرر 6.3.2 لجمع β من 50 خلايا على الاقل من ثلاث تجارب مستقلة، وحساب متوسط ​​جيب التمام β مع الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM).
    4. كرر 6.3.1-6.3.3 لكل حالة تجريبية.
      ملاحظة: كوس β من +1 إلى أن جميع الخلايا محاذاة بالتوازي مع EF التطبيقية، وقيمة 0 يشير إلى أن جميع الخلايا محاذاة perpendicularlذ إلى EF التطبيقية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الإجهاد الكيميائية القص (CSS) رقاقة

ويتكون رقاقة CSS من ثلاث ورقات PMMA، كل من سمك 1 ملم، وتعلق معا عن طريق اثنين من الأشرطة على الوجهين، كل من سمك 0.07 مم (الشكل 1A و 1B). "شجرة عيد الميلاد" هيكل يولد خمسة تركيزات النسبية من 0، 1/8، 1/2، 7/8، و 1 في مجالات الثقافة الخمسة. من خلال تصميم منطقة الثقافة باعتبارها مثلث...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هي ملفقة رقائق القائم على PMMA باستخدام الاستئصال بالليزر والكتابة التي هي طرق أرخص وأسهل بالمقارنة مع رقائق مقرها PDMS والتي تتطلب الطباعة الحجرية الناعمة أكثر تعقيدا. بعد تصميم رقاقة ميكروفلويديك، تصنيع وتجميع ويمكن أن يتم ضمن مسافة 5 دقائق. هناك بعض الخطوات الحاسمة التي ينبغي أن تدفع الانتباه إلى في أداء التجربة. الأول هو "تجميع" القضية. يجب أن يكون لاصق المحولات بشكل صحيح إلى الأعلى الأكثر طبقة من شرائح. الغراء قد تسرب إلى قنوات الموائعية إذا تم تطبيق أكثر من اللازم،...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل ماليا من قبل وزارة العلوم والتكنولوجيا في تايوان بموجب العقد رقم. MOST 104-2311-B-002-026 (K. Y. Lo) ، لا. MOST 104-2112-M-030-002 (YS Sun) ، ومشروع التطوير الوظيفي لجامعة تايوان الوطنية (103R7888) (KY Lo). يشكر المؤلفون أيضا مركز المواد الناشئة والأجهزة المتقدمة ، جامعة تايوان الوطنية ، على استخدام غرفة زراعة الخلايا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
وسط النسر المعدل من Dulbecco (DMEM)Gibco11965-092وسط زراعة الخلايا
TrypsinGibco25300-054فصل الخلية عن الطبق
مصل الأبقار الجنيني (FBS)Gibco10082147وسط زراعة الخلايا
10 سم زراعة الخلايا طبق بتريNunc150350ثقافة الخلية
Bright-Line   ؛ مقياس الدمSigmaZ359629معدات عد الخلايا
PMMAمخصصرقاقة Microfluidic
محولمخصصرقاقة Microfluidic
0.07 / 0.22 مم شريط على الوجهين   ؛3M8018/9088رقاقة الموائع الدقيقة
انصهار منخفضة agaroseSigmaA9414جسر الملح
2'-7'-ثنائي كلورو ثنائي هيدروفلوريسي ثنائي الأسيتاتSigmaD6883قياس ROS داخل الخلايا
أكسيد القصدير الإنديوم (ITO) زجاجMerck300739
سخان تحكم مشتق نسبي متكامل  شركة جيتك للإلكترونياتTTM-J4-R-ABجهاز التحكم في درجة الحرارة
المقرنة الحراريةTECPELTPK-02Aجهاز التحكم في درجة الحرارة
CO2< / sub> ليزر كاتبأدوات الليزر & شركة تكنيكس.ILS2رقاقة
ميكروفلويديك مضخات حقنة عصرجديدNE-300ضخ الوسط والمواد الكيميائية في رقاقة
امدادات الطاقةالعلوم الرئيسية MP-300Vتوريد التيارات المباشرة المجهر
المقلوبأوليمبوسCKX41مراقبة هجرة الخلايا
مجهر الفلورسنت المقلوبنيكونTS-100مراقبة خلية الترحيل والإشارات الفلورية
DSLRكاميرا Canon60Dتسجيل صور المجال الساطع 
كاميرا CCDنيكونDS-Qi1تسجيل صور الفلورسنت 
الغراء الفائق3M سكوتش7004إرفاق المحولات بركائز PMMA
AutoCADAutodesk Inc.تصميم رقائق الموائع الدقيقة
DMSOSigmaD8418إذابة DCFDA
ImageJالمعاهد الوطنية للصحةالقياس الكمي لشدة الفلورسنت وهجرة الخلايا
مخصص مخصصة نقطة تصنيع كاميرا

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cheng, J. Y., Yen, M. H., Kuo, C. T., Young, T. H. A transparent cell-culture microchamber with a variably controlled concentration gradient generator and flow field rectifier. Biomicrofluidics. 2, (2008).
  2. Terry, S. C., Jerman, J. H., Angell, J. B. Gas-Chromatographic Air Analyzer Fabricated on a Silicon-Wafer. Ieee T Electron Dev. 26, 1880-1886 (1979).
  3. Whitesides, G. M., Ostuni, E., Takayama, S., Jiang, X., Ingber, D. E. Soft lithography in biology and biochemistry. Annu Rev Biomed Eng. 3, 335-373 (2001).
  4. Adler, J. Chemoreceptors in bacteria. Science. 166, 1588-1597 (1969).
  5. Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. J Exp Med. 115, 453-466 (1962).
  6. Kao, Y. C., et al. Modulating chemotaxis of lung cancer cells by using electric fields in a microfluidic device. Biomicrofluidics. 8, 024107(2014).
  7. Walker, G. M., et al. Effects of flow and diffusion on chemotaxis studies in a microfabricated gradient generator. Lab Chip. 5, 611-618 (2005).
  8. Al-Majed, A. A., Neumann, C. M., Brushart, T. M., Gordon, T. Brief electrical stimulation promotes the speed and accuracy of motor axonal regeneration. J Neurosci. 20, 2602-2608 (2000).
  9. Nuccitelli, R. Endogenous electric fields in embryos during development, regeneration and wound healing. Radiat Prot Dosim. 106, 375-383 (2003).
  10. McCaig, C. D., Rajnicek, A. M., Song, B., Zhao, M. Controlling cell behavior electrically: Current views and future potential. Physiol Rev. 85, 943-978 (2005).
  11. Tai, G., Reid, B., Cao, L., Zhao, M. Electrotaxis and wound healing: experimental methods to study electric fields as a directional signal for cell migration. Methods Mol Biol. 571, 77-97 (2009).
  12. Huang, C. W., Cheng, J. Y., Yen, M. H., Young, T. H. Electrotaxis of lung cancer cells in a multiple-electric-field chip. Biosens Bioelectron. 24, 3510-3516 (2009).
  13. Yan, X. L., et al. Lung Cancer A549 Cells Migrate Directionally in DC Electric Fields With Polarized and Activated EGFRs. Bioelectromagnetics. 30, 29-35 (2009).
  14. Li, J., et al. Activated T lymphocytes migrate toward the cathode of DC electric fields in microfluidic devices. Lab Chip. 11, 1298-1304 (2011).
  15. Lin, F., et al. Lymphocyte electrotaxis in vitro and in vivo. J Immunol. 181, 2465-2471 (2008).
  16. Zhang, J., et al. Electrically Guiding Migration of Human Induced Pluripotent Stem Cells. Stem Cell Rev. , (2011).
  17. Song, B., et al. Application of direct current electric fields to cells and tissues in vitro and modulation of wound electric field in vivo. Nat Protoc. 2, 1479-1489 (2007).
  18. Sun, Y. S., Peng, S. W., Cheng, J. Y. In vitro electrical-stimulated wound-healing chip for studying electric field-assisted wound-healing process. Biomicrofluidics. 6, 34117(2012).
  19. Sun, Y. S., Peng, S. W., Lin, K. H., Cheng, J. Y. Electrotaxis of lung cancer cells in ordered three-dimensional scaffolds. Biomicrofluidics. 6, (2012).
  20. Li, J., Zhu, L., Zhang, M., Lin, F. Microfluidic device for studying cell migration in single or co-existing chemical gradients and electric fields. Biomicrofluidics. 6, 24121-2412113 (2012).
  21. Hou, H. S., Tsai, H. F., Chiu, H. T., Cheng, J. Y. Simultaneous chemical and electrical stimulation on lung cancer cells using a multichannel-dual-electric-field chip. Biomicrofluidics. 8, 052007(2014).
  22. Lo, K. Y., Wu, S. Y., Sun, Y. S. A microfluidic device for studying the production of reactive oxygen species and the migration in lung cancer cells under single or coexisting chemical/electrical stimulation. Microfluid Nanofluidics. 20, 15(2016).
  23. Lo, K. Y., Zhu, Y., Tsai, H. F., Sun, Y. S. Effects of shear stresses and antioxidant concentrations on the production of reactive oxygen species in lung cancer cells. Biomicrofluidics. 7, 64108(2013).
  24. Cheng, J. Y., Wei, C. W., Hsu, K. H., Young, T. H. Direct-write laser micromachining and universal surface modification of PMMA for device development. Sensor Actuat B-Chem. 99, 186-196 (2004).
  25. Chen, J. J. W., et al. Global analysis of gene expression in invasion by a lung cancer model. Cancer Res. 61, 5223-5230 (2001).
  26. Shih, J. Y., et al. Collapsin response mediator protein-1 and the invasion and metastasis of cancer cells. J Natl Cancer I. 93, 1392-1400 (2001).
  27. Lu, H., et al. Microfluidic shear devices for quantitative analysis of cell adhesion. Anal Chem. 76, 5257-5264 (2004).
  28. Fried, L. E., Arbiser, J. L. Honokiol, a Multifunctional Antiangiogenic and Antitumor Agent. Antioxid Redox Sign. 11, 1139-1148 (2009).
  29. Chisti, Y. Hydrodynamic damage to animal cells. Crit Rev Biotechnol. 21, 67-110 (2001).
  30. Davies, P. F., Remuzzi, A., Gordon, E. J., Dewey, C. F., Gimbrone, M. A. Turbulent fluid shear stress induces vascular endothelial cell turnover in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 2114-2117 (1986).
  31. Zoro, B. J., Owen, S., Drake, R. A., Hoare, M. The impact of process stress on suspended anchorage-dependent mammalian cells as an indicator of likely challenges for regenerative medicines. Biotechnol Bioeng. 99, 468-474 (2008).
  32. Chin, L. K., et al. Production of reactive oxygen species in endothelial cells under different pulsatile shear stresses and glucose concentrations. Lab Chip. 11, 1856-1863 (2011).
  33. Tsai, H. F., Peng, S. W., Wu, C. Y., Chang, H. F., Cheng, J. Y. Electrotaxis of oral squamous cell carcinoma cells in a multiple-electric-field chip with uniform flow field. Biomicrofluidics. 6, 34116(2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PMMA SubstratesLaser AblationChemical GradientsElectrical FieldsReactive Oxygen SpeciesCell MigrationExperimental Throughput

مقالات ذات صلة