توجه التغليف البروتين داخل الخارجي غشاء الحويصلات من كولاي: تصميم وإنتاج وتنقية

Summary

< p class = 'jove_content'> يتم تقديم بروتوكول لإنتاج وتنقية واستخدام حويصلات الغشاء الخارجي المعبأة بالإنزيم (OMV) مما يوفر ثباتا معززا للإنزيم للتنفيذ عبر تطبيقات متنوعة.

Abstract

اهتمام متزايد في تطبيق تقنيات البيولوجيا الاصطناعية لبرنامج حويصلات الغشاء الخارجي (OMV) تؤدي إلى بعض التطبيقات مثيرة جدا للاهتمام وفريدة من نوعها لOMV حيث النانوية التقليدية تثبت من الصعب جدا لتجميع. حتى الآن، وقد ثبت عن البكتيريا سالبة الجرام لانتاج أو.ام.في التظاهر التعبئة والتغليف من مجموعة متنوعة من البضائع التي تتضمن جزيئات صغيرة، والببتيدات والبروتينات والمادة الوراثية. وبناء على حمولتها متنوعة، وتورط OMV في العديد من العمليات البيولوجية التي تتراوح بين الاتصالات خلية خلية لنقل الجينات وتسليم عوامل الفوعة اعتمادا عليها البكتيريا تنتج أو.ام.في. إلا في الآونة الأخيرة البكتيرية OMV تكون ميسرة للاستخدام عبر مجموعة واسعة من التطبيقات من خلال تطوير تقنيات لمراقبة والتعبئة والتغليف مباشرة من البروتينات المؤتلف في OMV. يصف هذا البروتوكول وسيلة لإنتاج وتنقية، واستخدام انزيم تعبئتها OMV توفير لتحسين overaإنتاج ليرة لبنانية من انزيم المؤتلف، وزيادة البثور، وتعزيز الاستقرار الانزيم. واستخدام الناجح لهذا البروتوكول يؤدي إلى خلق السلالة البكتيرية التي تنتج في وقت واحد بروتين المؤتلف، وتوجهها لOMV التغليف من خلال استحداث رابط الاصطناعية بين البروتين المؤتلف والخارجي البروتين غشاء مرساة. تفاصيل هذا البروتوكول أيضا طرق لعزل OMV من الثقافات البكتيرية وكذلك التقنيات السليمة للتعامل معها والأشياء في الاعتبار عند التكيف مع هذا البروتوكول للاستخدام في تطبيقات أخرى فريدة من نوعها مثل: تسليم الصيدلانية المخدرات والتشخيص الطبي، وإصلاح البيئة.

Introduction

المقدمة هنا هي طريقة لتصميم وإنتاج وتنقية البكتيرية حويصلات الغشاء الخارجي محملة انزيم (OMV). OMV صغيرة، unilamellar في المقام الأول، proteoliposomes التي تتراوح في حجمها 30-200 نانومتر ^1،2. وقد أثبتت جميع البكتيريا سالبة الجرام وموجبة الجرام التي تم دراستها لتاريخ الافراج عنه إما OMV أو الحويصلات خارج الخلية (EV) من سطحها ^3،4. آلية دقيقة التي يتم إنتاجها OMV لم يتم بعد توضح تماما بسبب التجمعات البكتيرية المتنوعة التي تفرز لهم، وكذلك الوظائف المختلفة التي تخدمها. وقد ثبت OMV لنقل مجموعة واسعة من البضائع من الجزيئات الصغيرة، والببتيدات والبروتينات والمادة الوراثية تقدم مجموعة متنوعة من الإشارات المعقدة، النبات الجينات، والفوعة تقوم بعملها ^5،6.

الآليات الدقيقة لOMV نشوء حيوي لا تتميز بشكل جيد، ويبدو أن تختلف بين الأنواع البكتيرية. وعلى الرغم من ثيالصورة الحقيقة، قمنا بتطوير طريقة لتعزيز كفاءة التعبئة والتغليف من البروتين المؤتلف في OMV عن طريق إنشاء الربط الاصطناعية بين بروتين من الفائدة والبروتين الذاتية وفيرة للغاية لالغشاء الخارجي للبكتيريا ولاحق OMV. في حالة عدم وجود الربط الاصطناعية، أو تقارب إدراجها بشكل مصطنع، بين البروتين المعبر عنه recombinantly وOMV كفاءة التعبئة والتغليف المرصودة منخفضة جدا ^(7). هذه النتيجة هي التي يمكن توقعها على تضمين البروتينات داخل OMV يحدث إما عن طريق تغليف فرصة عشوائي في نفس اللحظة من تشكيل OMV على سطح البكتيريا أو من خلال التعبئة والتغليف إخراج الآليات التي ليست مفهومة جيدا. وقد لوحظ بعض النجاح في التعبئة والتغليف البروتينات ببساطة من خلال أكثر من التعبير في الفضاء محيط بالجبلة التي تعتمد على تغليف فرصة عشوائي ولكن التعبئة الفعالة هي عالية البروتين تعتمد مع بعض البروتينات التعبئة والتغليف في كفاءة عالية بالمقارنة مع الآخرين عشرفي لا حزمة في كل ^8-10. من خلال استخدام تقنيات البيولوجيا التركيبية المشتركة سعينا لهندسة الإشريكية القولونية (إي كولاي) لإنتاج واحد، حزمة وتفرز انزيم نشط من الاهتمام الى OMV أن تلتف القيود المعرفة الحالية بشأن كيف تتشكل OMV وكيف يتم تحديد البضائع عن طريق البكتيريا ل التعبئة والتغليف.

لأغراض هذا التطبيق تم اختيار نظام البروتين bioconjugation الانقسام كما الربط الاصطناعية من خيار لتسهيل التعبئة والتغليف الاتجاه إلى OMV. وكما يوحي اسمها يتكون نظام البروتين bioconjugation تقسيم اثنين من المجالات فرعية التكميلية التي تتفاعل مع بعضها البعض. ويشار إلى المجالات البروتين الانقسام التي تم اختيارها لأغراض هذا البروتوكول باسم SpyCatcher (SC) وSpyTag (ST) المجال و هي مستمدة من المكورات العقدية المقيحة ملزمة فبرونيكتين البروتين (FbaB) ^11. هذا النظام بروتين الانقسام هو غير عادي في أن ثالدجاجة مفارز هما على مقربة سندات isopeptide تشكل بشكل عفوي بين الداني الأسبارتيك بقايا حمض أميني ويسين خلق صلة التساهمية. لا يتطلب تشكيل السندات Isopeptide إضافة البروتينات كوصي، والإنزيمات المحفزة، أو العوامل المساعدة ويمكن أن يحدث بسهولة في درجة حرارة الغرفة (RT) وأكثر من مجموعة واسعة من الشروط ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية ^12.

كدليل على المفهوم، وقد تم اختيار phosphotriesterase (PTE) (EC 3.1.8.1) من Brevundimonas الضئيلة ليتم تعبئتها في كولاي المستمدة OMV ^13. يحتوي PTE على ثنائي النواة الموقع الزنك / الزنك نشط ولديه القدرة على تحطيم الفوسفات العضوية من خلال رد فعل التحلل تحويل aryldialkylphosphates إلى dialkylphosphates والكحول أريل ^14. التعرض لالفوسفات العضوية يضعف وظيفة النواقل العصبية السليمة من خلال تثبيط المائي للأستيل كولين قبل أستيل عند التقاطعات العصبية والعضلية ماكينز الفوسفات العضوي المركبات المشتقة خطيرة للغاية ^(15). لفترات طويلة أو التعرض الكبير لالفوسفات العضوية ينتج عادة في التشنجات لا يمكن السيطرة عليها، وعادة ما يسبب الموت عن طريق الاختناق. في حين PTE يسلك أعلى نشاط الحفاز نحو الباراأكسيون، مبيد حشري قوية جدا، بل هو أيضا قادرة على hydrolyzing مجموعة واسعة من المبيدات الأخرى وV / G نوع غاز الأعصاب الكيميائي ^16. لتسهيل OMV التعبئة والتغليف، وقد تم تصميم البلازميد البكتيري أن يشفر بناء الجين الذي يحتوي على المروج محرض، سلسلة توطين محيط بالجبلة، ويبعد مسافة قصيرة متعددة موقع استنساخ المنبع من سلسلة SC الجينات. غرز الجينات PTE بين القائد وتسلسل SC يسمح لخلق التحول الجيني الذي يستهدف تدريب المدرسين-SC الانصهار البروتين إلى الفضاء محيط بالجبلة لOMV التعبئة والتغليف. في حين أن جهود وصفها هنا تركز على تدريب المدرسين، وجين الإنزيم قابلة للتبديل، ويمكن بسهولة أن يتم استبدال مع تسلسل الجينات آخر لبناء واجهاتالتعبئة والتغليف ilitate إنزيم بديل أو البروتين.

وبما أن الجزء الثاني من الربط الاصطناعية، يتم اختيار وفيرة الخارجي بروتين الغشاء (OmpA) لتقديم تسلسل الببتيد ST. في حين أن اختيار البروتين مرساة يمكن أن تختلف، فمن الضروري أن البروتين يحتوي على نطاق المتساهل الذي يطرح داخل الفضاء محيط بالجبلة، تسامح بناء الانصهار دون إحداث السمية الخلوية، ومن المعروف أن تكون موجودة في OMV، ولا تجميع عندما يكون recombinantly أنتجت. OmpA هو 37.2 كيلو دالتون بروتين الغشاء PORIN أن يعرف أن يتم التعبير عنها بشكل كبير في الغشاء الخارجي للبكتيريا ولاحق OMV ^17. هو متورط في نقل الجزيئات الصغيرة، <2 نانومتر في الحجم، عبر غشاء البكتيريا ^(18). مواطن OmpA اثنين من المجالات فريدة من نوعها من الناحية الهيكلية، والغشاء بيتا برميل عزر وجزء للذوبان periplasmically C-محطة معروفة للتفاعل مع ببتيدوغليكان ^19. في متحولة OmpA-ST الانصهار المصممد هنا تم حذف الجزء C-محطة من OmpA وتنصهر في ST إلى N- التي تواجه periplasmically أو C-ترميني. حذف جزء محيط بالجبلة من OmpA يقلل من عدد من التفاعلات بين الغشاء الخارجي وببتيدوغليكان مما أدى إلى زعزعة استقرار الغشاء مما يؤدي إلى فرط تحوصل ^7. واستمر الجينوم OmpA بالإضافة إلى بناء OmpA-ST أعرب recombinantly للتخفيف الإجمالي زعزعة استقرار الغشاء.

Protocol

1. إعداد البلازميدات

1. إعداد البلازميد (على سبيل المثال، pET22) التي تحتوي على البروتين مرساة (OmpA) تنصهر إلى مجال الربط biorthogonal (المشار إليها في هذا البروتوكول كما مرساة-ST)، والعلامة حاتمة (مثل 6xHis، MYC أو FLAG العلامات لتنقية وتحديد الهوية)، العلامة محيط بالجبلة التعريب، المقاومة للمضادات الحيوية، والأصل المناسب من النسخ المتماثل تعتمد على سلالة بكتيرية اختيار ^7.
   1. استخراج DNA البلازميد من ثقافات بين عشية وضحاها باستخدام المتاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
2. إعداد البلازميد (على سبيل المثال، pACYC184) التي تحتوي على انزيم / بروتين (PTE) ليتم تعبئتها داخل OMV تنصهر إلى المجال الربط bioorthogonal مكملة لتلك التي من البروتين مرساة (المشار إليها في هذا البروتوكول كما انزيم-SC)، والعلامة حاتمة، العلامة محيط بالجبلة التعريب، المقاومة للمضادات الحيوية التي تختلف من البروتين البلازميد مرساة، والاصليه المناسبفي النسخ المتماثل على أساس السلالة البكتيرية اختيار ^7.
   1. استخراج DNA البلازميد من ثقافات بين عشية وضحاها باستخدام المتاحة تجاريا عدة عزل الحمض النووي بعد بروتوكول الشركة المصنعة ^7.

2. الجيل من OMV التغليف E. ثقافة القولونية

1. البلازميد عزل
   1. تنقية البلازميدات ترميز الانزيم-SC بناء ومرساة-ST يبني من خطوط الخلايا صيانة منفصلة باستخدام طقم البلازميد العزلة التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة ^7. تحديد تركيز الحمض النووي والنقاء من خلال قياس الامتصاصية في 260 نانومتر و 280 نانومتر.
2. شارك في التحول
   1. تحديد سلالة كولاي ما هو متاح تجاريا لتسهيل التعبير البروتين.
      ملاحظة: BL21 استخدمت (DE3) خلايا هنا. مطلوب مستذيب T7 للتعبير عن بناء مرساة-ST، الذي يعتمد على المروج T7 وT7 RNA البلمرة لبروتعين التعبير. استخدام سلالات بكتيرية أخرى يتطلب إما وجود الجين مستذيب T7 أو استخدام البلازميد غير pET22 ^7.
   2. تمييع DNA البلازميد المنقى إلى تركيز المولي تعادل ثم تحويلها إلى خلايا بكتيرية المختصة إما عن طريق الحرارة صدمة التحول أو Electroporation للالتالية بروتوكول الشركة المصنعة للخلايا المختصة المختار.
   3. لوحة تتحول الخلايا على لوريا، Bertani (LB) أجار لوحات مع كل من الأمبيسلين (pET22) والكلورامفينيكول (pACYC184) التي تحتوي على المضادات الحيوية. سواء في الحاضر بتركيزات النهائية من 25 ميكروغرام / مل.
   4. مكان الطبق الثقافة عند 37 درجة مئوية خلال الليل لعزل الحيوانات المستنسخة الوحيدة التي تحتوي على كل من البلازميدات.
      ملاحظة: المستعمرات التي تعيش اختيار المضادات الحيوية سوف تستخدم لكافة الاستعدادات OMV في المستقبل. سيتم إضافة المضادات الحيوية (الأمبيسلين والكلورامفينيكول) لجميع الثقافات السائل للحفاظ على ضغط انتقائي، وضمان وجود كل من البلازميدات.

3. OMV الإنتاج

1. توسيع المستوطنات
   1. تطعيم 5 مل من وسائل الإعلام ثقافة (عادة مرق رائع (السل) أو LB) التي تحتوي على المضادات الحيوية في تركيزات المذكورة أعلاه (الخطوة 2.2.3) مع مستعمرة واحدة من لوحات مختارة وصفها في 2.2.4.
   2. إجراء التخفيف 1: أضعاف من الثقافة بداية ليلة وضحاها 100 في قوارير ثقافة حيرة.
      ملاحظة: استخدام حجم وسائل الاعلام بين 250-500 مل.
   3. الحفاظ على الثقافة عند 37 درجة مئوية تهتز في 250 دورة في الدقيقة لضمان تحقيق ذلك تهوية كافية من الثقافة.
2. تحريض كل البلازميد
   1. السماح للثقافة البكتيرية لتنمو إلى OD ₆₀₀ من 0،6-0،8، ما يقرب من 3 ساعات من النمو بعد التلقيح من القارورة النمو الأولية.
   2. لتحسين العائد النهائي من PTE-SC الحويصلات تحميل، الطرد المركزي ثقافة كاملة في 7000 x ج لمدة 15 دقيقة. resuspend الكرية خلية في قبل تحسنت، وسائل الإعلام ثقافة جديدة.
      ملاحظة: هذا التقيدIONAL الخطوة تساعد على إزالة أي OMV فارغة موجودة في وسائل الإعلام ثقافة قبل PTE-SC الاستقراء.
   3. جعل 20٪ محلول المخزون من L-أرابينوز في مجال المياه وتصفية العقيمة باستخدام فلتر 0.22 ميكرون. مخزن حل L-أرابينوز في 4 درجة مئوية لمدة 2-4 أسابيع.
   4. إضافة الحل L-أرابينوز إلى قارورة الثقافة إلى التركيز النهائي 0.2٪ لبدء إنتاج بي تي إي-SC.
      ملاحظة: هذا يساعد على تهيئة تحميلها على مساحة محيط بالجبلة مع بي تي إي-SC قبل تشجيع زيادة تحوصل من خلال تحريض متحولة OmpA-ST.
   5. جعل حل 1 م الآيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) في المياه وتصفية العقيمة باستخدام فلتر 0.22 ميكرون.
      ملاحظة: IPTG يجب أن تستخدم فورا بمجرد رطب. aliquots من IPTG يمكن تخزين المجمدة لمدة 3-6 أشهر، ويمكن إذابة فورا قبل الاستخدام.
   6. إضافة IPTG بعد فترة حضانة 3 ساعة إضافية لتركيز النهائي من 0.5 ملم إلى بدء إنتاج OmpA-ST.
   7. السماح لطريق مسدودتلح في النمو لمدة 8-14 ساعة إضافية عند 37 درجة مئوية في حين تهتز.

4. OMV تنقية

1. إزالة البكتيريا سليمة
   1. أجهزة الطرد المركزي في وسائل الإعلام ثقافة البكتيريا لمدة 15 دقيقة في 7000 x ج في 4 درجات مئوية لتكوير البكتيريا سليمة.
   2. صب، وحفظ، وسائل الإعلام من على قمة الخلية بيليه آخر الطرد المركزي الحرص على عدم تعكير صفو بيليه الخلية.
   3. كرر الخطوات من 4.1.1 و 4.1.2 للدورة الطرد المركزي إضافية واحدة لضمان تتم إزالة جميع البكتيريا سليمة من وسائل الإعلام الثقافة ويجري التأكد من صب ووفر وسائل الإعلام.
2. إزالة الركام البروتين
   1. المزيد من تنقية وسائل الإعلام ثقافة البكتيريا باستخدام فلتر 0.45 ميكرون غشاء لإزالة البكتيريا المتبقية وغير مرغوب فيها المواد الخلوية الكبيرة.
      ملاحظة: استخدام مادة غشاء متوافقة بيولوجيا لاسترداد ارتفاع وانخفاض امتصاص البروتين مثل خلات السليلوز (CA) أو difluoride البولي فينيل (PVDF). أحجام مرشح حقنة أقل من 100 مل وأحجام مرشح فراغ أكبر من 100 مل.
      1. لتصفية حقنة، رسم مستنبت إلى معقمة حقنة 10-50 مل. إرفاق 0.45 ميكرون فلتر لنهاية لور حقنة. خفض الغطاس وجمع التدفق من خلال في سفينة جديدة.
      2. لفراغ مرشح، ونقل مستنبت لجهاز الترشيح العقيمة. إرفاق وحدة لفراغ مضخة أو تغرق الشافطة لتوليد الشفط. نقل متوسطة تصفيتها لسفينة جديدة.
3. عزل OMV عبر تنبيذ فائق
   1. إضافة وسائل الإعلام الثقافة التي تمت تصفيتها في أنابيب الطرد المركزي الحرص على تحقيق التوازن بين أنابيب معارضة في أجهزة الطرد المركزي.
   2. بيليه في ~ 150000 x ج لمدة 3 ساعات في 4 درجات مئوية في نابذة فائقة السرعة باستخدام الدوار المقابلة مطابقة كل من الصك وأنابيب يجري الاستفادة منها.
   3. صب OMV سائل الإعلام والثقافة المنضب من بيليه OMV، والحرص على عدم تعكير صفو بيليه OMV، وعلى الفور عند الانتهاء سالطرد المركزي و كما يسمح بيليه OMV أن تبقى في وسائل الإعلام سوف تخفف بيليه الحد من الانتعاش OMV.
      ملاحظة: هذا بيليه يكون البني قليلا وهذا يتوقف على مقدار بدءا من ثقافة البكتيرية قد أو قد لا تكون مرئية بالعين. الشفط وسائل الإعلام مباشرة من الجزء العلوي من أنبوب الطرد المركزي هو أيضا خيار مع الأخذ في الاعتبار أن أكثر إزالتها من OMV سائل الإعلام بيليه أكثر نقاء وعينة OMV النهائية ستكون.
   4. حفظ طاف طرد لديناميكية في وقت لاحق اختبار تشتت الضوء (DLS) للتحقق من أن جزيئات OMV تم استنفاد كامل من وسائل الإعلام.
   5. إضافة 0.5-1 مل من تصفيتها الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) ودرجة الحموضة 7.4 أو 100 ملي N عازلة العقيمة -Cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic حمض (الشطرنج) في الرقم الهيدروجيني 8.0 إلى بيليه OMV والسماح لها لاحتضان لمدة 30 دقيقة في RT. تأكد من أن بيليه لا تجف.
      ملاحظة: المتطرفة في حل القوة الأيونية، ودرجة الحموضة، ودرجة الحرارة قد يؤدي إلى انخفاض الذوبان OMV وتعزيز aggregation.
   6. بعناية الماصة الحل OMV تنقيته من أنبوب الطرد المركزي، خلط بلطف لضمان تم بالفاعلات بيليه بأكمله.

5. OMV توصيف

1. استخدام أي متاحة تجاريا DLS أو تتبع جسيمات متناهية الصغر البرامج التالية بروتوكولات وقدمت الشركة المصنعة فريدة من نوعها لكل أداة لتحديد OMV توزيع حجم وتركيز الجسيمات.
   ملاحظة: هنا، تم تحديد OMV توزيع حجم وتركيز الاستفادة NanoSight LM10 تتبع جسيمات متناهية الصغر والهيئة الوطنية للمواصلات 2.3 برنامج تحليل.
   1. فتح البرنامج.
   2. تشغيل المجهر وتنظيف جميع الأسطح على وحدة المجهر وتتبع جسيمات متناهية الصغر.
   3. إضافة ~ 0.5 مل من عينة OMV مباشرة إلى نافذة عرض للجهاز تتبع الجسيمات من خلال بالتركيبة مع 1 مل محقنة معقمة ويجري التأكد من تغطية نافذة عرض كامل دون ضخ أي فقاعات الهواء في النظام.
   4. مكان رانه جسيمات متناهية الصغر تتبع وحدة على المسرح المجهر وتشغيل الليزر.
   5. انقر على "التقاط" في البرنامج.
   6. ضبط التركيز المجهر وتنظيم لتصور الجسيمات على الحاضر شاشة العرض في إطار البرنامج.
   7. ضبط "مصراع الكاميرا" و "كسب كاميرا" حتى يتم تصور جزيئات مضيئة بشكل واضح على خلفية داكنة.
   8. ضبط مدة القبض على 60 ثانية.
   9. انقر على "سجل".
   10. عند المطالبة، إدخال العينة في درجة الحرارة / الجهاز، تسمية العينة، وحفظ البيانات والفيديو عند الانتهاء من كل تشغيل إلى مجلد مستخدم معين.
   11. منع جميع المعلمات تحليل (كشف عتبة، والضبابية، ومين طول المسار، مين المتوقعة حجم الجسيمات) على السيارات وضع كشف وانقر فوق "تسلسل عملية."
       ملاحظة: راجع دليل لكيفية لكل معلمة يمكن تعديلها بشكل مستقل إلى نتائج تحليل غرامة تصل قيمتها.
   12. سجل توزيع حجم الجسيمات والجسيمات / متركيز لتر على النحو الذي يحدده البرنامج.
       ملاحظة: OMV الهيدروديناميكية مدى محدد حجم ما بين 30-200 نانومتر مع تركيز الجسيمات / مل من ~ 10 × 10 ^8.
2. تحديد OMV محتوى البروتين
   1. استخدام معيار SDS-PAGE والبروتوكولات الغربية وصمة عار لتقييم OMV النقاء، وإنتاج الإنزيم، وكفاءة يشابك SC-ST ^7.
      ملاحظة: سوف يشابك الكفاءة لا تكون 100٪ ^7.

6. التأكيد من أنزيم التعبئة والتغليف

1. PTE آخر الفحص
   1. أداء جميع المقايسات الأنزيمية في منطقة عازلة مناسبة مثل 100 مم الشطرنج عازلة (درجة الحموضة 8) عند 25 درجة مئوية في أي كفيت أو المضاعفة في لوحة جيدا 96/384.
   2. إضافة 5 ميكرولتر من 1: 1000 تخفيف من الباراأكسيون العازلة في الشطرنج إلى 90 ميكرولتر من الشطرنج و 5 ميكرولتر من OMV تنقيته (~ 36 أضعاف تتركز بالمقارنة مع تركيز OMV الحالي في وسائل الإعلام والثقافة).
      تحذير: الباراأكسيون هو المبيدات الحشرية السامةويجب أن يتم التعامل معها في تصنيع والمبادئ التوجيهية المؤسسية.
   3. أخذ قراءات الامتصاصية في فترات منتظمة (كل 20 ثانية ل~ 2 ساعة إجمالي وقت رد الفعل) في 405 نانومتر (ε = 18.1 مم ^-1 سم ^-1) وفي 348 نانومتر (isosbestic ε نقطة = 5.4 مم ^-1 سم ^-1) ل مراقبة تطور رد فعل مولد اللون الباراأكسيون نواتج تحلل، ص -nitrophenol.
      ملاحظة: في قيم الرقم الهيدروجيني فوق 8 شكل deprotonated المهيمن ص -nitrophenol موجودا يسمح لرصد دقيق في 405 نانومتر. في جميع الحلول المعقدة أو أقل درجة الحموضة أخرى لا بد من الاستفادة من نقطة isosbestic من 348 نانومتر كما أشكالا متعددة من -nitrophenol ص سيكون حاضرا.
   4. حساب السرعات رد الفعل الأولية من خلال تحديد المنحدر من جزء خطية من منحنيات تقدم من الخطوة 6.1.3 لمقارنة كمية النسبية لتدريب المدرسين في كل عينة، والكفاءة التعبئة والتغليف، وإجمالي إنتاج PTE.
   5. أداء الأنزيمية القياسيةبروتوكولات الفحص لتحديد K _M، V _ماكس وك _القط لOMV مغلفة تدريب المدرسين.
      ملاحظة: يمكن استخدام تحليل خطيطة لبورك لتحديد هذه الثوابت الحركية حيث التقاطع y = 1 / V _ماكس والمنحدر = K _M / V _ماكس ^20.
2. الغشاء الركيزة / انتشار المنتج.
   1. تنفيذ نفس تحليل الفحص الحركي كما هو موضح في الخطوة 6.1 استخدام تركيزات متزايدة من تريتون X-100 العازلة في الشطرنج 0-3٪ من حيث الحجم.
      ملاحظة: إضافة تريتون X-100 على وظائف OMV بالفاعلات لتعطيل طبقة ثنائية المادة الدهنية مما يسمح لمحتويات OMV لتكون في متناول بحرية إلى محلول التفاعل.
   2. حساب ومقارنة سرعات الأولية في كل مستوى تريتون X-100 للتحقق من مرور عبر الغشاء الركيزة / المنتج المشار إليها بواسطة تغيير طفيف في نشاط إنزيم (السرعات الأولية) مقارنة على نشاط انزيم طن غياب تريتون X-100. إذا لوحظ زيادة كبيرة في نشاط انزيم في وجود تريتون X-100 فمن المرجح أن الركيزة لا تنتشر بحرية في OMV.
   3. لا تحول دون فحص نشاط انزيم الحرة (كما هو موضح أعلاه في القسم 6.1) في وجود تريتون X-100 للتحقق من نشاط انزيم من قبل السطحي نفسه.
      ملاحظة: إذا كان يتأثر النشاط إلى حد كبير من قبل تريتون X-100، والمضافات البديلة، مثل السابونين أو بوليسوربات مختلف / قد تكون السطحي توين أكثر ملاءمة للتمزق الغشاء OMV.

7. OMV التخزين

1. تجميد
   1. قسامات مكان ~ 100 ميكرولتر من OMV تنقية مباشرة في النيتروجين السائل لالتقاط تجميد وقسامات يجري التأكد أن لا يغرق تماما قارورة أو الاتصال بأي النيتروجين السائل مع العينة نفسها.
      ملاحظة: تنقية OMV يمكن المفاجئة المجمدة مباشرة في المخزن المؤقت الذي تم تحديده لالانحلال بيليه OMV خلال purificatعملية أيون مع أي cryoprotectants الإضافية الضرورية ^7.
   2. تخزين قسامات مبكرة في المجمد -80 درجة مئوية.
   3. ذوبان الجليد قسامات المجمدة من الخطوة 7.1.1 عن طريق وضعها في RT يجري التأكد من عدم تسخين العينات.
   4. قبل إعداد جميع العينات للتخزين في هذه الطريقة إجراء فحص انزيم هو موضح في الخطوة 6.1 مقارنة السرعات الأولية قبل وبعد تجميد للتحقق من عدم وجود خسائر كبيرة في انزيم آخر نشاط تجميد أذاب.
      ملاحظة: مخزن تنقية OMV في 4 درجات مئوية إذا لوحظ انخفاض في نشاط انزيم بسبب التجميد.
2. تجفيد
   1. يجفد المفاجئة المجمدة قسامات OMV النقاء باستخدام المعدات تجفيد المتاحة تجاريا ^21.
   2. متجر مجفف بالتجميد aliquots في RT لمدة أسابيع أو في -80 درجة مئوية لمدة عدة أشهر.
   3. إضافة نفس الحجم من الماء النقي إلى OMV مجفف بالتجميد كما قبل تجفيد واسمحوا الوقوف على RT لمدة 30 دقيقة لترطيب رإنه عينة. المزيج بلطف عند الضرورة يجري التأكد من عدم دوامة أو يصوتن OMV.
   4. إضافة مسحوق مجفف بالتجميد OMV مباشرة إلى نقطة من الرعاية للتطبيقات حيث مسبق تخفيف / الإذابة وليس من الضروري.

Results

التعبير في وقت واحد من اثنين من البروتينات المؤتلف، كما هو مطلوب لاستراتيجية التعبئة والتغليف OMV بالتفصيل في هذا البروتوكول، ويمكن تحقيق ذلك من خلال عدد من السبل المختلفة. هنا، تم استخدام نظام اثنين من ناقلات مع أصول المتوافقة مع النسخ المتماثل وأشرطة الكاسيت الجينات محرض منفصلة. للتعبير عن PTE-SC بناء العمود الفقري البلازميد التجاري (pACY184) تم هندستها لتشمل الارابينوز كاسيت الجينات محرض والتوأم أرجينين محيط بالجبلة تسلسل زعيم توطين تليها سلسلة ...

Discussion

يعمل هذا البروتوكول على إثبات وجود ممثل الموجهة تقنية التعبئة والتغليف التي تنتج انزيم من الفائدة وتعبئتها في OMV من قبل كولاي. كما هو الحال مع العديد من التقنيات المعقدة هناك مناطق متعددة في أي بروتوكول يمكن تعديلها لاستيعاب لاستخدامها في تطبيقات فريدة من نوعها مختلفة، بعضها موضح أدناه. في حين أن آلية OMV التعبئة والتغليف والتغليف الإنزيم يمكن تكييفها لتلائم الاحتياجات الخاصة هناك العديد من الخطوات في هذا البروتوكول، الذي تعتبر بالغة الأهمية لنجاحها. إزالة الأولية للبكتي...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
IPTG	أي		تحضير دائما طازجة أو aliquot وتجميد.
L-arabinose	تحضيره		مسبقا وتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
أمبيسلين	أي		إضافة مباشرة قبل الاستخدام بعد أن تبرد الوسائط بدرجة كافية من التعقيم.
كلورامفينيكول	أي		إضافة مباشرة قبل الاستخدام بعد أن تبرد الوسائط بشكل كاف من التعقيم.
/ LB Culture Media	أن تعمل أي		وسائط نمو أخرى بالمثل.
Triton X-100	أي		واحد من العديد من المواد الخافضة للتوتر السطحي المناسبة المحتملة.
قوارير الثقافة المحيرة	أي		الحواجز تعزز مستويات أعلى من التهوية.
	الكواشف الحيوية CHES Fisher	BP318-100	المخزن المؤقت الأمثل المستخدم لتحلل الباراكسون (الرقم الهيدروجيني > 8).
Paraoxon	Chem Service	N-12816	مادة شديدة السمية يجب التعامل معها بعناية والتخلص منها بشكل صحيح.
فلتر الحقنة 0.45 & م	Thermo Scientific	60183-221 (30 مم)	يعتمد قطر المرشح على حجم العينة. غشاء ربط البروتين المنخفض أمر بالغ الأهمية.
حاضنة شاكر	نيو برونزويك	إكسيلا E24	درجة الحرارة الدقيقة والخلط ضروريان لنمو البكتيريا القابل للتكاثر.
جهاز طرد مركزي Sorvall Culture	Thermo Scientific	RC 5B PLUS	طرد مركزي ثقافة كبير الحجم (500 مل) قادر على 7,000 × جم.
Sorvall Ultra Centrifuge	Thermo Scientific	WX Ultra 90	قادر على قوى الطرد المركزي & ge ؛ 150,000 × جم.
جهاز طرد مركزي فائق الدوار	الحراري العلمي	AH-629	تأكد من استخدام الدوار والأنابيب المناسبة وأن كل شيء متوازن بشكل صحيح.
أنابيب الطرد المركزي فائقة الوضوح (25 × 89 مم)	344058 بيكمان كولتر		تأكد من عدم وجود كسور إجهاد قبل الاستخدام وأن الأنابيب متوازنة بشكل جيد.
مقياس الطيف الضوئي	Tecan	Infinite M1000	ضروري لفحوصات حركية الإنزيم.
DLS / تتبع الجسيمات	NanoSight   ؛	LM10	ضروري لتوزيع حجم OMV وتحديد التركيز.
BL21 (DE3)	NEB		سلالة تعبير بكتيرية مناسبة.
pET22	EMD Millipore	69744-3	يمكن استخدام البلازميدات الأخرى بدلا من هذه.
pACYC184	NEB		يمكن استخدام البلازميدات الأخرى بدلا من هذه.
مجموعة استخراج الجل	Qiagen	28704	مجموعة مثال.