حشوية حقن مكروي في الثروة الحيوانية بيضات ملقحة بمساعدة الليزر

حقن مكروي حشوية الأجنة 1-الخلية هي تقنية قوية جدا. ويمكن استخدامه لتوصيل أي حل في جنين، على سبيل المثال، تنتج الجينات تدق الرافضة لدراسة وظيفة الجين أو لتوليد الحيوانات في تحرير الجين. بيضات ملقحة حيوانات المزرعة معظم ذات الصلة زراعيا لديها تكوين الأحماض الدهنية عالية جدا يجعل السيتوبلازم بها مبهمة والظلام ^1. لديهم أيضا غشاء البلازما مرنة إلى حد ما (بعد الظهر). هذه الخصائص تجعل حقن مكروي باستخدام pronuclear التقليدي / حقن حشوية كما تستخدم في أنواع القوارض الصعبة وغالبا غير دقيقة.

حقن مكروي حشوية مزاياه على حقن مكروي pronuclear لأنه من الأسهل لأداء ويسبب أيضا أقل الأضرار التي لحقت الأجنة المحقونة، مما أدى إلى ارتفاع قابلية ^2. ويتمثل الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار وسيلة ناجحة لتقديم حلول في سيتوبلازم بيضات ملقحة لحيوانات المزرعة. لتكون قادرة على أداءحقن مكروي حشوية مع كفاءة عالية على أجنة الماشية، يتم استخدام الليزر لتوليد حفرة في المنطقة الشفافة (ZP) وبعد ذلك يتم استخدام الزجاج إبرة حادة في نهاية لحقن مكروي. وتهدف هذه الاستراتيجية للحد من الأضرار الميكانيكية مطبوع على الجنين أثناء الحقن. ثم، تطلع محتوى حشوية داخل إبرة حقن يسمح الكسر كفاءة وثقة من رئيس الوزراء ضمان أن الحل يتم تسليم إلى السيتوبلازم للجنين.

وقد تم بالفعل استخدام هذه التقنية بنجاح في أجنة الأبقار لتسليم سيرنا إلى السيتوبلازم اقحي ^3،4 وتوليد الطفرات باستخدام تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / كريسبر يرتبط نظام 9 (Cas9) نظام ^5. بل هو أيضا مناسبة (مع تعديلات طفيفة) لحقن الأبقار المغلقة الركامية البويضات ^6. هنا، وصفنا لدينا بروتوكول حقن تقديم صبغة، التي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لحقن أي ديحل IRED في البيضة الملقحة، وتبين أن استخدام هذا الأسلوب يسبب الحد الأدنى من تحلل و لا يؤثر على تطور الجنين في وقت مبكر.

1. Micropipette الإنتاج

1. حقن micropipette
   1. ضع الشعرية البورسليكات الزجاج (القطر الخارجي (OD): 1.0 ملم، القطر الداخلي (ID): 0.75 ملم) في مجتذب micropipette (في وسط اليمين والشعرية الجهة اليسرى للحامل اللقب) وقفله.
   2. استخدام البرنامج المناسب لسحب الزجاج الشعرية لذلك يؤدي في تلميح رقيقة مع جامع طويلة. (مثال: الحرارة: 825؛ سحب: 30؛ السرعة: 120، المدة: 200؛ الضغط: 500).
   3. إزالة بعناية ماصات سحبت من الجهاز ووضعه على microforge في وضع أفقي.
   4. جلب ماصة سحبت وmicroforge سخان خيوط مع حبة الزجاج لها إلى التركيز. استخدام الشبيكة العدسة لقياس سمك المطلوب ونقل ماصة أفقيا حتى يصل إلى خيوط سخان القطر الداخلي الهدف (5 ميكرون).
   5. ضبط الحرارة إلى حوالي 45٪، وجلب بلطف ماصة أسفل حتى يلامس خيوط. تفعيل سخان لفترة وجيزة. هذا ثتذوب سوء قليلا ماصة لذلك تتمسك خيوط وعلى التبريد، وماصة كسر في نقطة الاتصال توليد قطع على التوالي.
      ملاحظة: ضبط درجة الحرارة المناسبة هو مفتاح الحل في هذه الخطوة منذ درجات حرارة عالية جدا سيجعل منحنى ماصة، وبالتالي فإن قطع على التوالي لن يكون ممكنا، وسوف درجات حرارة منخفضة جدا لا تكون كافية لإذابة ماصة (الشكل 1A).
   6. تقديم التقريبية 30 درجة زاوية بالقرب من غيض ماصة بوضعها حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط سخان. ضبط درجة الحرارة إلى 60٪ وتفعيل سخان.
      ملاحظة: هذا ثني ماصة على خيوط. هذا هو المطلوب زاوية حتى غيض من الإبرة موازية للسطح لوحة حقن عندما شنت في محقن (الشكل 1B).
   7. التعامل مع ماصات حقن مكروي بحذر لأنها حادة جدا وهشة.
2. micropipette عقد
   1. وضع borosilicأكل الزجاج الشعرية (OD: 1.0 مم، الرقم: 0.75 مم) في مجتذب micropipette (في وسط اليمين والشعرية الجهة اليسرى للحامل اللقب) وقفله.
   2. استخدام البرنامج المناسب لسحب الزجاج الشعرية لذلك يؤدي في تلميح رقيقة مع طويلة حتى تفتق والجدران الموازية (مثال: الحرارة: 815؛ سحب: 20؛ السرعة: 140، المدة: 175؛ الضغط: 200).
   3. إزالة بعناية ماصة سحبها من جهاز مجتذب ووضعه على حامل microforge في وضع أفقي. ضبط التركيز على خيوط سخان وماصة.
   4. استخدام الشبيكة العدسة لقياس قطرها ماصة ونقل ماصة حتى قطرها على خيوط يصل 180 ميكرون.
   5. وفيما يتعلق بحجم المشار إليه، بمناسبة الزجاج الشعرية مع طرف قلم الماس، ثم اضغط بلطف على طرف سحبت لكسر الزجاج. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى قطع على التوالي (الشكل 1C).
   6. نقل ماصة لوضع عمودي مع طرفها قريب من خيوط. ضبط درجة الحرارة من microforge إلى 60٪.
   7. النار تلميع غيض من ماصة باستخدام التقنيات القياسية ⁷ حتى يصل معرف من 40 ميكرون. استخدام الشبيكة العدسة للتحقق من الهوية (1D الشكل).
   8. جعل زاوية على ماصة.
      1. جلب ماصة مرة أخرى إلى الوضع الأفقي حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط و 5 ملم بعيدا من طرفها. ضبط درجة الحرارة إلى ما يقرب من 60٪ وتفعيل سخان لثني ماصة على خيوط. يستمر التسخين حتى يتم التوصل إلى زاوية المطلوب (حوالي 30 ^س). تحقق من زاوية بصريا (الشكل 1E).
         ملاحظة: شنت ماصة عادة إلى microinjector في زاوية تقارب 60 ^درجة بالنسبة إلى الجزء السفلي من الطبق الحقن. عازمة غيض من ماصة لذلك هو مواز لقاع الطبق، وهو أمر ضروري لحقن الصحيح للجنين في الطائرة المتوسطة لها.

1. تأكد من أن microinjectors يتم تحميلها بشكل كامل مع النفط وعدم وجود فقاعات الهواء في النظام (فقاعات في microinjector منع مراقبة دقيقة من الحقن).
2. تأكد من أن micromanipulators هم في موقف وسط. وهذا سوف يسمح لمجموعة واسعة من حركة ماصات.
3. إدراج ماصة عقد في حامل micromanipulator الأيسر وماصة الحقن في حامل المجهرية الصحيح.
4. تسمح النفط للدخول في ماصات من الشعرية والتحقق من أن النظام يعمل بشكل صحيح عن طريق نقل النفط صعودا وهبوطا داخل ماصة باستخدام عناصر التحكم microinjector.
   ملاحظة: إذا كان هناك أي تحرك النفط داخل الإبر، قد يكون هناك تسد. في هذه الحالة، استخدم إبرة جديدة.
5. استخدم عناصر التحكم micromanipulator لجلب ماصات في وسط الميدان المجهر وجهة نظر. باستخدام 4X التكبير، تأكد من أن نصائح micropipette هي في الزاوية الصحيحة (صarallel إلى أسفل الطبق).
   ملاحظة: الإعداد الصحيح من الإبر هو المفتاح لنجاح الحقن والنتائج الاتساق.
6. معايرة نظام ليزر التالية دليل معايرة الشركة المصنعة.

3. إعداد حقن طبق (الشكل 2)

1. وضع قطرة 50 ميكرولتر من درجة حرارة (37 درجة مئوية) SOF-HEPES (تكوين مفصلة في قسم المواد) تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) في وسط غطاء من 100 ملم طبق بتري. ضع 1 - قطرة ميكرولتر 2 من الحل ليتم حقنه على مقربة من انخفاض الحقن. تأكد من أن الأجنة لا يبرد أدناه RT.
   ملاحظة: في هذا البروتوكول سوف نقوم بإضافة صبغ ديكستران الأحمر إلى حل عن طريق الحقن لتكون قادرة على تصور موقع الحقن وتتبع في وقت لاحق.
2. تغطية قطرات في لوحة الحقن باستخدام حوالي 10 مل من الزيوت المعدنية.
3. وضع طبق حقن على مسرح المجهر المقلوب وجلب نقطةettes إلى انخفاض الحقن. تأكد من أن الإبر في التركيز داخل قطرة. ضبط ارتفاعها حسب الحاجة باستخدام عناصر التحكم micromanipulator.
4. باستخدام microdispenser، تحميل حوالي 20 - 30 بيضات ملقحة (17-20 ساعة بعد الإخصاب (HPF)) في الجانب العلوي من انخفاض الحقن. أداء حقن في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تحديد عدد الأجنة في انخفاض حقن من السرعة التي يمكن للشخص أن ضخها. لا تحميل المزيد من الأجنة من تلك التي يمكن حقنها في 30 دقيقة.
   1. لتحميل الأجنة في microdispenser، تضغط على المكبس بشكل كامل وتزج طرف في محلول يحتوي على الأجنة. لمس الأجنة ويمكن الحصول عليها مع غيض من الزجاج الشعرية (واحد في ذلك الوقت) والافراج عن ببطء الغطاس حتى يدخل كل جنين في شعري. كرر هذا حتى يتم القبض على جميع الأجنة أعلى أو القدرة microdispenser ممتلئ.
   2. للافراج عن الأجنة تحميل، كساد الغطاس بلطف حتى كامل حجم التعاونntaining الأجنة يتم تحريرها من الشعيرات الدموية.

4. حقن مكروي

1. باستخدام الهدف 4X، تحميل الحل ليتم حقنه في ماصة حقن عن طريق الضغط السلبي (الشفط). تحميل حلا كافيا لحقن 2-3 بيضات ملقحة. ثم نقل إلى تراجع الحقن.
2. داخل قطرة حقن، نقل ماصة عقد حتى يحصل على معلومات سرية بالقرب من البيضة الملقحة. الضغط السلبي (نضح) مع microinjector عقد حتى يحصل ثابتة البيضة الملقحة إلى ماصة عقد والتغيير إلى الهدف 20X.
3. مرة واحدة يتم إرفاق البيضة الملقحة إلى ماصة القابضة، والتحقق من جودة وذلك باستخدام ماصة حقن للتحرك بلطف الجنين في جميع أنحاء دون فصلها. وينبغي أن يكون البيضة الملقحة ذات نوعية جيدة الهيئات القطبية اثنين (على الرغم من أن في بعض الأحيان واحد فقط وينظر) والسيتوبلازم متجانسة. لا حقن بيضات ملقحة غير طبيعية (الشكل 3A).
4. إذا لزم الأمر، إعادة الجنين لحقن السليمموقع. ومن شأن تحديد المواقع الجيدة تكون تلك التي هناك بعض المساحة بين ZP ومساء، حتى رئيس الوزراء لا تحصل على تضررت بواسطة الليزر.
5. تأكد من أن ماصة حقن يتوضع على منتصف الطائرة-الجنين عن طريق لمس بلطف البيضة الملقحة في موقع الحقن. إذا لم يكن عن دورتها منتصف الطائرة، فإن إبرة تميل إلى جعل الجنين تدوير بدلا من ثقب. ضبط ارتفاع ماصة الحقن حسب الحاجة.
6. جعل ثقب في ZP باستخدام الليزر (الشكل 3B).
   1. باستخدام الليزر مكان البرمجيات الشبيكة الليزر في ZP حيث سيتم إجراء ثقب (على الجانب الآخر إلى حيث تعلق الجنين إلى ماصة القابضة). باستخدام جهاز التحكم الليزر نافذة انقر على زر اطلاق النار. تأكد من أن حجم الفتحة كبيرة بما يكفي لخلق فتحة في ZP للإبرة لتمرير من خلال دون الإضرار PM (مثال: 0،662 مللي ثانية نبض العرض / 6.9 ميكرون حجم ثقب).
7. تمرير إبرة حقنمن خلال ثقب في ZP واجراء اتصالات مع رئيس الوزراء. مواصلة دفع ماصة إلى الأمام حتى الإبرة ¾ من الطريق في الجنين (الشكل 3C).
8. مراقبة الموقف من الغضروف المفصلي في الطور البيني حل للنفط، حيث سيؤدي ذلك إلى أن تستخدم للسيطرة على الدوام حجم الحقن.
9. الضغط السلبي (نضح) على ماصة حقن، الأمر الذي سيؤدي في الظهر، والسيتوبلازم الذي يستنشق في إبرة الحقن. تستمر حتى حركة السيتوبلازم في إبرة يسرع أو عند المحتوى السيتوبلازم الخلط مع حقن محلول يمكن رؤيتها. وتشير هذه الكسر من رئيس الوزراء (الشكل 3D).
10. حقن الظهر محتوى حشوية تليها الحل في سيتوبلازم البيضة الملقحة عن طريق تطبيق الضغط الايجابي (حقن)، حتى الغضروف المفصلي في الطور البيني حل للنفط تقدمت يعادل قطر البيضة الملقحة واحد بعد نقطة الانطلاق.
    ملاحظة: في ظل ظروف لدينا، وهذا ممثلى أعضاءsents حوالي 7 رر من حل حقن (الشكل 3E).
11. التغيير إلى الهدف 4X ونقل حقن الجنين / ثانية إلى الجانب السفلي من انخفاض الحقن. الافراج عن الجنين عن طريق الضغط الإيجابي على microinjector القابضة. الحفاظ على الأجنة غير المحقونة على الجانب العلوي، وحقن تلك الموجودة على الجانب السفلي من الهبوط للمساعدة في تتبع حقن الأجنة / غير حقنه والعمل بكفاءة.

5. الأجنة استعادة وحقن نتائج

1. تقديم 3 قطرات من حوالي 200 ميكرولتر في طبق جديد مع تسخينه مسبقا SOF-HEPES. جمع الأجنة حقن باستخدام microdispenser (كما هو موضح أعلاه). غسل الأجنة المحقونة عن طريق نقلها من خلال 3 SOF-HEPES يسقط.
2. عدد الأجنة هي lysed خلال حقن مكروي والتخلص منها.
   ملاحظة: البيضة الملقحة هي lysed يمكن تمييزها بسهولة من واحدة سليمة منذ أول واحد يبدو شفافة، وملء ZP كله، وأنها عادة ما تكون حشويةمحتوى تسرب إلى خارج الجنين.
3. اختياريا، والتحقق من كفاءة حقن مكروي باستخدام المجهر الفلورسنت. كن على علم أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تحدث الضرر الجنين الذي يمكن أن يؤثر على تطور لاحق.
4. جماعات ثقافة 25 الأجنة المحقونة في 50 قطرات ميكرولتر من المتوسطة البوتاسيوم البسيط الأمثل (KSOM) تستكمل مع 4 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) تحت الزيوت المعدنية في 38.5 درجة مئوية، 5٪ CO ₂ في الهواء، والرطوبة من التشبع.
5. تكملة سائل الإعلام والثقافة مع 5٪ FBS بعد يومين من الحقن.
6. تحقق الكيسة الأريمية (BL) معدلات 7 أيام بعد الحقن. حساب BL أسعار الفائدة في عدد من الأجنة الكيسة / العدد الكلي للأجنة مثقف في هذا الانخفاض.

بمساعدة الليزر حقن مكروي حشوية هو بروتوكول قوية وموثوق بها لتقديم حلول في سيتوبلازم بيضات ملقحة الماشية. ويبين الشكل 3 مخطط العام للبيضات ملقحة قبل وبعد حقن فضلا عن مخطط الشامل لهذه التقنية. يستخدم ديكستران الحمراء عن طريق الحقن الحل للسماح الموقع تتبع الحقن والحقن كفاءة ودقة. ويتضح نجاح تنفيذ الحل في الشكل 4 يظهر الجنين حقن مؤخرا والتي يتم توزيعها الصبغة متجانس في السيتوبلازم. باستخدام هذه التقنية يتم حقن 100٪ من الأجنة في السيتوبلازم بهم.

وقد أثبت هذا البروتوكول لدينا أسعار تحلل الحد الأدنى في الأبقار والأغنام بيضات ملقحة. فقط كانت هي lysed 15.6 ± 5 و 5.8 ± 3.9٪ من الأجنة المحقونة في الأبقار والأغنام، على التوالي، نتيجة للحقن مكروي الشكل (6)، وهناك توجد فروق ذات دلالة إحصائية في معدلات التنمية الكيسة في السيطرة مقابل مجموعة حقن لكل من الأبقار (مراقبة 32.8 ± 6.6٪، 31.4 ± 5.9٪ حقن) وأجنة الأغنام (مراقبة 40.3 ± 7.8، 30.3 ± 6.0٪ حقن).

وتشير هذه النتائج إلى أن حقن داخل الهيولى بمساعدة الليزر يسبب أضرار طفيفة أثناء الحقن والنتائج في معدلات التنمية الكيسة العادية.

الشكل 1: مخطط العام عرض كيفية جعل القابضة وحقن الماصات. AB) حقن ماصة، م) عقد ماصة. أ) تلمس برفق خيوط مع ماصة سحبت في القطر المطلوب (5 ميكرون). تفعيل لفترة وجيزة سخان (أظهر في س نطاق). هذا وسوف تذوب قليلا ماصة لذلك تتمسك خيوط وعلى التبريد، وماصة وكسر في نقطة الاتصال توليد قطع على التوالي. ب) تقديم وزاوية في ماصة حوالي 0.5 سم بعيدا عن طرفها عن طريق وضع ماصة حول 10 ميكرون بعيدا عن خيوط سخان. يستمر التسخين حتى يتم تحقيق زاوية المرجوة. ج) استخدام قلم الماس الحافة للاحتفال وقطع ماصة عقد في القطر المطلوب (180 ميكرون). د) في وضع عمودي، النار تلميع غيض من ماصة عقد حتى تصل إلى القطر المطلوب الداخلي (40 ميكرون). E) تقديم زاوية على ماصة جلب ماصة مرة أخرى إلى وضع أفقي على ميكرون الزوجين بعيدا عن خيوط وحوالي 0.5 سم بعيدا عن طرفها. تفعيل سخان لثني ماصة على خيوط. يستمر التسخين حتى يتم تحقيق زاوية المرجوة. انظر 8،9،10 لمزيد من التفاصيل حول كيفية جعل الإبر.= "https://www.jove.com/files/ftp_upload/54465/54465fig1large.jpg" الهدف = "_ فارغة"> الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل 2:.. الإعداد العام لحقن طبق ترتيب الماصات، قطرات، ويتم عرض الأجنة في هذا الرسم الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3): بمساعدة الليزر داخل الهيولى بروتوكول حقن أ) رسم تخطيطي العام لاقحة تعلق على ماصة عقد قبل الحقن. PB: الهيئات القطبية، ZP: المنطقة الشفافة، CYT: السيتوبلازم، PN: pronuclei، PM: البلازما MEMBRAN ه، HP: عقد ماصة، IP: حقن ماصة BE) خطوات حقن مكروي: B) جعل ثقب في ZP من البيضة الملقحة التي تعلق على ماصة عقد باستخدام الليزر C) وضع ماصة حقن نحو الجانب الآخر من الجنين. . التحقق من موقف الغضروف المفصلي (أ). د) كسر غشاء البلازما بواسطة الشفط محتوى حشوية داخل ماصة الحقن. E) حقن المحتوى مرة أخرى حشوية والحل في السيتوبلازم اقحي، حتى يصل الغضروف المفصلي قطر البيضة الملقحة واحد (ب) الماضي نقطة الانطلاق . يمثل المسافة AB = 7 رر من المحلول المحقون. F) رسم تخطيطي العام للالبيضة الملقحة بعد الحقن. لاحظ أن الحل حقن ينتشر بشكل متجانس في السيتوبلازم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"1">
الرقم 4: الرقم ممثل لاقحة المصبوبة مع ديكستران الحمراء أ) صورة حقل مشرق من البيضة الملقحة ب حقن) صورة الفلورسنت من البيضة الملقحة حقن الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الرقم 5: نسبة هي lysed الأجنة بعد اقحة حقن مكروي في نوعين من أنواع مختلفة تمثل البيانات 4 يعيد للأجنة الأبقار (103 بيضات ملقحة حقن) و 3 نسخ متماثلة للأجنة الأغنام (173 بيضات ملقحة حقن). تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة الرجاء انقر هنا لعرضنسخة أكبر من هذا الرقم.

يمثل الكيسة الاسعار في الأبقار وصوف الأجنة البيانات 4 يعيد للأنواع الأبقار مع ما مجموعه 102 وحقن 156 الأجنة السيطرة و3 يعيد للأنواع الأغنام مع ما مجموعه 163 وحقن 239 الأجنة التحكم: الرقم 6. تمثل أشرطة الخطأ ووزارة شؤون المرأة الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.