يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية

مقالة منهجية

حشوية حقن مكروي في الثروة الحيوانية بيضات ملقحة بمساعدة الليزر

8.8K مشاهدة

⸱

DOI:

10.3791/54465

⸱

أكتوبر 5, 2016

 ,  , 
1Department of Animal Science, University of California, Davis

في هذه المقالة

ملخص

يوضح هذا البروتوكول كيفية إجراء الحقن المجهري السيتوبلازمي في البيضة البيقية لحيوانات المزرعة. يمكن استخدام هذه التقنية لتوصيل أي حل إلى الجنين أحادي الخلية مثل أدوات تحرير الجينوم لتوليد بالضربة القاضية.

الملخص

يعد الحقن المجهري السيتوبلازمي في أجنة أحادية الخلية تقنية قوية للغاية. على سبيل المثال ، يتيح توصيل أدوات تحرير الجينوم التي يمكن أن تخلق تعديلات جينية ستكون موجودة في كل خلية من كائن حي بالغ. يمكن استخدامه أيضا لتوصيل siRNA أو mRNAs أو الأجسام المضادة الحجب لدراسة وظيفة الجينات في أجنة ما قبل الزرع. تتكون التقنية التقليدية للحقن الدقيق للأجنة المستخدمة في القوارض من ماصة دقيقة رفيعة جدا تخترق غشاء البلازما مباشرة عند تقدمها إلى الجنين. عندما يتم تطبيق هذه التقنية على الماشية ، فإنها عادة ما تؤدي إلى انخفاض الكفاءة. هذا يرجع أساسا إلى أنه على عكس الفئران والجرذان ، فإن البيضات البيقارية والأغنام والخنازير لديها سيتوبلازم غامق جدا وغشاء بلازما عالي المرونة يجعل من الصعب تحقيق التصور أثناء الحقن واختراق غشاء البلازما. في هذا البروتوكول ، نصف طريقة حقن مجهرية مناسبة لتوصيل المحاليل إلى سيتوبلازم زيجوت الماشية والتي أثبتت نجاحها لأجنة الأغنام والخنازير أيضا. أولا ، يتم استخدام الليزر لإحداث ثقب في المنطقة الشفافة. ثم يتم إدخال ماصة زجاجية غير حادة من خلال الفتحة وتتقدم حتى يصل طرف الإبرة إلى حوالي 3/4 في الجنين. بعد ذلك ، يتم كسر غشاء البلازما عن طريق شفط المحتوى السيتوبلازمي داخل الإبرة. أخيرا ، يتم حقن المحتوى السيتوبلازمي المستنشق متبوعا بالمحلول المعني مرة أخرى في السيتوبلازم الجنيني. تم استخدام هذا البروتوكول بنجاح لتوصيل محاليل مختلفة إلى البيضة الملقحة البقرية والأغنام بكفاءة 100٪ ، والحد الأدنى من التحلل ، ومعدلات نمو الأكياس الأريمية الطبيعية.

المقدمة

حقن مكروي حشوية الأجنة 1-الخلية هي تقنية قوية جدا. ويمكن استخدامه لتوصيل أي حل في جنين، على سبيل المثال، تنتج الجينات تدق الرافضة لدراسة وظيفة الجين أو لتوليد الحيوانات في تحرير الجين. بيضات ملقحة حيوانات المزرعة معظم ذات الصلة زراعيا لديها تكوين الأحماض الدهنية عالية جدا يجعل السيتوبلازم بها مبهمة والظلام 1. لديهم أيضا غشاء البلازما مرنة إلى حد ما (بعد الظهر). هذه الخصائص تجعل حقن مكروي باستخدام pronuclear التقليدي / حقن حشوية كما تستخدم في أنواع القوارض الصعبة وغالبا غير دقيقة.

حقن مكروي حشوية مزاياه على حقن مكروي pronuclear لأنه من الأسهل لأداء ويسبب أيضا أقل الأضرار التي لحقت الأجنة المحقونة، مما أدى إلى ارتفاع قابلية 2. ويتمثل الهدف العام من هذا البروتوكول هو إظهار وسيلة ناجحة لتقديم حلول في سيتوبلازم بيضات ملقحة لحيوانات المزرعة. لتكون قادرة على أداءحقن مكروي حشوية مع كفاءة عالية على أجنة الماشية، يتم استخدام الليزر لتوليد حفرة في المنطقة الشفافة (ZP) وبعد ذلك يتم استخدام الزجاج إبرة حادة في نهاية لحقن مكروي. وتهدف هذه الاستراتيجية للحد من الأضرار الميكانيكية مطبوع على الجنين أثناء الحقن. ثم، تطلع محتوى حشوية داخل إبرة حقن يسمح الكسر كفاءة وثقة من رئيس الوزراء ضمان أن الحل يتم تسليم إلى السيتوبلازم للجنين.

وقد تم بالفعل استخدام هذه التقنية بنجاح في أجنة الأبقار لتسليم سيرنا إلى السيتوبلازم اقحي 3،4 وتوليد الطفرات باستخدام تتجمع interspaced بانتظام يكرر المتناوب قصيرة (كريسبر) / كريسبر يرتبط نظام 9 (Cas9) نظام 5. بل هو أيضا مناسبة (مع تعديلات طفيفة) لحقن الأبقار المغلقة الركامية البويضات 6. هنا، وصفنا لدينا بروتوكول حقن تقديم صبغة، التي يمكن أن تكون قابلة للتطبيق لحقن أي ديحل IRED في البيضة الملقحة، وتبين أن استخدام هذا الأسلوب يسبب الحد الأدنى من تحلل و لا يؤثر على تطور الجنين في وقت مبكر.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

1. Micropipette الإنتاج

  1. حقن micropipette
    1. ضع الشعرية البورسليكات الزجاج (القطر الخارجي (OD): 1.0 ملم، القطر الداخلي (ID): 0.75 ملم) في مجتذب micropipette (في وسط اليمين والشعرية الجهة اليسرى للحامل اللقب) وقفله.
    2. استخدام البرنامج المناسب لسحب الزجاج الشعرية لذلك يؤدي في تلميح رقيقة مع جامع طويلة. (مثال: الحرارة: 825؛ سحب: 30؛ السرعة: 120، المدة: 200؛ الضغط: 500).
    3. إزالة بعناية ماصات سحبت من الجهاز ووضعه على microforge في وضع أفقي.
    4. جلب ماصة سحبت وmicroforge سخان خيوط مع حبة الزجاج لها إلى التركيز. استخدام الشبيكة العدسة لقياس سمك المطلوب ونقل ماصة أفقيا حتى يصل إلى خيوط سخان القطر الداخلي الهدف (5 ميكرون).
    5. ضبط الحرارة إلى حوالي 45٪، وجلب بلطف ماصة أسفل حتى يلامس خيوط. تفعيل سخان لفترة وجيزة. هذا ثتذوب سوء قليلا ماصة لذلك تتمسك خيوط وعلى التبريد، وماصة كسر في نقطة الاتصال توليد قطع على التوالي.
      ملاحظة: ضبط درجة الحرارة المناسبة هو مفتاح الحل في هذه الخطوة منذ درجات حرارة عالية جدا سيجعل منحنى ماصة، وبالتالي فإن قطع على التوالي لن يكون ممكنا، وسوف درجات حرارة منخفضة جدا لا تكون كافية لإذابة ماصة (الشكل 1A).
    6. تقديم التقريبية 30 درجة زاوية بالقرب من غيض ماصة بوضعها حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط سخان. ضبط درجة الحرارة إلى 60٪ وتفعيل سخان.
      ملاحظة: هذا ثني ماصة على خيوط. هذا هو المطلوب زاوية حتى غيض من الإبرة موازية للسطح لوحة حقن عندما شنت في محقن (الشكل 1B).
    7. التعامل مع ماصات حقن مكروي بحذر لأنها حادة جدا وهشة.
  2. micropipette عقد
    1. وضع borosilicأكل الزجاج الشعرية (OD: 1.0 مم، الرقم: 0.75 مم) في مجتذب micropipette (في وسط اليمين والشعرية الجهة اليسرى للحامل اللقب) وقفله.
    2. استخدام البرنامج المناسب لسحب الزجاج الشعرية لذلك يؤدي في تلميح رقيقة مع طويلة حتى تفتق والجدران الموازية (مثال: الحرارة: 815؛ سحب: 20؛ السرعة: 140، المدة: 175؛ الضغط: 200).
    3. إزالة بعناية ماصة سحبها من جهاز مجتذب ووضعه على حامل microforge في وضع أفقي. ضبط التركيز على خيوط سخان وماصة.
    4. استخدام الشبيكة العدسة لقياس قطرها ماصة ونقل ماصة حتى قطرها على خيوط يصل 180 ميكرون.
    5. وفيما يتعلق بحجم المشار إليه، بمناسبة الزجاج الشعرية مع طرف قلم الماس، ثم اضغط بلطف على طرف سحبت لكسر الزجاج. وهذا ينبغي أن يؤدي إلى قطع على التوالي (الشكل 1C).
    6. نقل ماصة لوضع عمودي مع طرفها قريب من خيوط. ضبط درجة الحرارة من microforge إلى 60٪.
    7. النار تلميع غيض من ماصة باستخدام التقنيات القياسية 7 حتى يصل معرف من 40 ميكرون. استخدام الشبيكة العدسة للتحقق من الهوية (1D الشكل).
    8. جعل زاوية على ماصة.
      1. جلب ماصة مرة أخرى إلى الوضع الأفقي حوالي 10 ميكرون بعيدا عن خيوط و 5 ملم بعيدا من طرفها. ضبط درجة الحرارة إلى ما يقرب من 60٪ وتفعيل سخان لثني ماصة على خيوط. يستمر التسخين حتى يتم التوصل إلى زاوية المطلوب (حوالي 30 س). تحقق من زاوية بصريا (الشكل 1E).
        ملاحظة: شنت ماصة عادة إلى microinjector في زاوية تقارب 60 درجة بالنسبة إلى الجزء السفلي من الطبق الحقن. عازمة غيض من ماصة لذلك هو مواز لقاع الطبق، وهو أمر ضروري لحقن الصحيح للجنين في الطائرة المتوسطة لها.
لو "> 2. الإعداد Micromanipulator

  1. تأكد من أن microinjectors يتم تحميلها بشكل كامل مع النفط وعدم وجود فقاعات الهواء في النظام (فقاعات في microinjector منع مراقبة دقيقة من الحقن).
  2. تأكد من أن micromanipulators هم في موقف وسط. وهذا سوف يسمح لمجموعة واسعة من حركة ماصات.
  3. إدراج ماصة عقد في حامل micromanipulator الأيسر وماصة الحقن في حامل المجهرية الصحيح.
  4. تسمح النفط للدخول في ماصات من الشعرية والتحقق من أن النظام يعمل بشكل صحيح عن طريق نقل النفط صعودا وهبوطا داخل ماصة باستخدام عناصر التحكم microinjector.
    ملاحظة: إذا كان هناك أي تحرك النفط داخل الإبر، قد يكون هناك تسد. في هذه الحالة، استخدم إبرة جديدة.
  5. استخدم عناصر التحكم micromanipulator لجلب ماصات في وسط الميدان المجهر وجهة نظر. باستخدام 4X التكبير، تأكد من أن نصائح micropipette هي في الزاوية الصحيحة (صarallel إلى أسفل الطبق).
    ملاحظة: الإعداد الصحيح من الإبر هو المفتاح لنجاح الحقن والنتائج الاتساق.
  6. معايرة نظام ليزر التالية دليل معايرة الشركة المصنعة.

3. إعداد حقن طبق (الشكل 2)

  1. وضع قطرة 50 ميكرولتر من درجة حرارة (37 درجة مئوية) SOF-HEPES (تكوين مفصلة في قسم المواد) تستكمل مع 20٪ مصل بقري جنيني (FBS) في وسط غطاء من 100 ملم طبق بتري. ضع 1 - قطرة ميكرولتر 2 من الحل ليتم حقنه على مقربة من انخفاض الحقن. تأكد من أن الأجنة لا يبرد أدناه RT.
    ملاحظة: في هذا البروتوكول سوف نقوم بإضافة صبغ ديكستران الأحمر إلى حل عن طريق الحقن لتكون قادرة على تصور موقع الحقن وتتبع في وقت لاحق.
  2. تغطية قطرات في لوحة الحقن باستخدام حوالي 10 مل من الزيوت المعدنية.
  3. وضع طبق حقن على مسرح المجهر المقلوب وجلب نقطةettes إلى انخفاض الحقن. تأكد من أن الإبر في التركيز داخل قطرة. ضبط ارتفاعها حسب الحاجة باستخدام عناصر التحكم micromanipulator.
  4. باستخدام microdispenser، تحميل حوالي 20 - 30 بيضات ملقحة (17-20 ساعة بعد الإخصاب (HPF)) في الجانب العلوي من انخفاض الحقن. أداء حقن في درجة حرارة الغرفة حتى يتم تحديد عدد الأجنة في انخفاض حقن من السرعة التي يمكن للشخص أن ضخها. لا تحميل المزيد من الأجنة من تلك التي يمكن حقنها في 30 دقيقة.
    1. لتحميل الأجنة في microdispenser، تضغط على المكبس بشكل كامل وتزج طرف في محلول يحتوي على الأجنة. لمس الأجنة ويمكن الحصول عليها مع غيض من الزجاج الشعرية (واحد في ذلك الوقت) والافراج عن ببطء الغطاس حتى يدخل كل جنين في شعري. كرر هذا حتى يتم القبض على جميع الأجنة أعلى أو القدرة microdispenser ممتلئ.
    2. للافراج عن الأجنة تحميل، كساد الغطاس بلطف حتى كامل حجم التعاونntaining الأجنة يتم تحريرها من الشعيرات الدموية.

4. حقن مكروي

  1. باستخدام الهدف 4X، تحميل الحل ليتم حقنه في ماصة حقن عن طريق الضغط السلبي (الشفط). تحميل حلا كافيا لحقن 2-3 بيضات ملقحة. ثم نقل إلى تراجع الحقن.
  2. داخل قطرة حقن، نقل ماصة عقد حتى يحصل على معلومات سرية بالقرب من البيضة الملقحة. الضغط السلبي (نضح) مع microinjector عقد حتى يحصل ثابتة البيضة الملقحة إلى ماصة عقد والتغيير إلى الهدف 20X.
  3. مرة واحدة يتم إرفاق البيضة الملقحة إلى ماصة القابضة، والتحقق من جودة وذلك باستخدام ماصة حقن للتحرك بلطف الجنين في جميع أنحاء دون فصلها. وينبغي أن يكون البيضة الملقحة ذات نوعية جيدة الهيئات القطبية اثنين (على الرغم من أن في بعض الأحيان واحد فقط وينظر) والسيتوبلازم متجانسة. لا حقن بيضات ملقحة غير طبيعية (الشكل 3A).
  4. إذا لزم الأمر، إعادة الجنين لحقن السليمموقع. ومن شأن تحديد المواقع الجيدة تكون تلك التي هناك بعض المساحة بين ZP ومساء، حتى رئيس الوزراء لا تحصل على تضررت بواسطة الليزر.
  5. تأكد من أن ماصة حقن يتوضع على منتصف الطائرة-الجنين عن طريق لمس بلطف البيضة الملقحة في موقع الحقن. إذا لم يكن عن دورتها منتصف الطائرة، فإن إبرة تميل إلى جعل الجنين تدوير بدلا من ثقب. ضبط ارتفاع ماصة الحقن حسب الحاجة.
  6. جعل ثقب في ZP باستخدام الليزر (الشكل 3B).
    1. باستخدام الليزر مكان البرمجيات الشبيكة الليزر في ZP حيث سيتم إجراء ثقب (على الجانب الآخر إلى حيث تعلق الجنين إلى ماصة القابضة). باستخدام جهاز التحكم الليزر نافذة انقر على زر اطلاق النار. تأكد من أن حجم الفتحة كبيرة بما يكفي لخلق فتحة في ZP للإبرة لتمرير من خلال دون الإضرار PM (مثال: 0،662 مللي ثانية نبض العرض / 6.9 ميكرون حجم ثقب).
  7. تمرير إبرة حقنمن خلال ثقب في ZP واجراء اتصالات مع رئيس الوزراء. مواصلة دفع ماصة إلى الأمام حتى الإبرة ¾ من الطريق في الجنين (الشكل 3C).
  8. مراقبة الموقف من الغضروف المفصلي في الطور البيني حل للنفط، حيث سيؤدي ذلك إلى أن تستخدم للسيطرة على الدوام حجم الحقن.
  9. الضغط السلبي (نضح) على ماصة حقن، الأمر الذي سيؤدي في الظهر، والسيتوبلازم الذي يستنشق في إبرة الحقن. تستمر حتى حركة السيتوبلازم في إبرة يسرع أو عند المحتوى السيتوبلازم الخلط مع حقن محلول يمكن رؤيتها. وتشير هذه الكسر من رئيس الوزراء (الشكل 3D).
  10. حقن الظهر محتوى حشوية تليها الحل في سيتوبلازم البيضة الملقحة عن طريق تطبيق الضغط الايجابي (حقن)، حتى الغضروف المفصلي في الطور البيني حل للنفط تقدمت يعادل قطر البيضة الملقحة واحد بعد نقطة الانطلاق.
    ملاحظة: في ظل ظروف لدينا، وهذا ممثلى أعضاءsents حوالي 7 رر من حل حقن (الشكل 3E).
  11. التغيير إلى الهدف 4X ونقل حقن الجنين / ثانية إلى الجانب السفلي من انخفاض الحقن. الافراج عن الجنين عن طريق الضغط الإيجابي على microinjector القابضة. الحفاظ على الأجنة غير المحقونة على الجانب العلوي، وحقن تلك الموجودة على الجانب السفلي من الهبوط للمساعدة في تتبع حقن الأجنة / غير حقنه والعمل بكفاءة.

5. الأجنة استعادة وحقن نتائج

  1. تقديم 3 قطرات من حوالي 200 ميكرولتر في طبق جديد مع تسخينه مسبقا SOF-HEPES. جمع الأجنة حقن باستخدام microdispenser (كما هو موضح أعلاه). غسل الأجنة المحقونة عن طريق نقلها من خلال 3 SOF-HEPES يسقط.
  2. عدد الأجنة هي lysed خلال حقن مكروي والتخلص منها.
    ملاحظة: البيضة الملقحة هي lysed يمكن تمييزها بسهولة من واحدة سليمة منذ أول واحد يبدو شفافة، وملء ZP كله، وأنها عادة ما تكون حشويةمحتوى تسرب إلى خارج الجنين.
  3. اختياريا، والتحقق من كفاءة حقن مكروي باستخدام المجهر الفلورسنت. كن على علم أن التعرض للأشعة فوق البنفسجية يمكن أن تحدث الضرر الجنين الذي يمكن أن يؤثر على تطور لاحق.
  4. جماعات ثقافة 25 الأجنة المحقونة في 50 قطرات ميكرولتر من المتوسطة البوتاسيوم البسيط الأمثل (KSOM) تستكمل مع 4 ملغ / مل ألبومين المصل البقري (BSA) تحت الزيوت المعدنية في 38.5 درجة مئوية، 5٪ CO 2 في الهواء، والرطوبة من التشبع.
  5. تكملة سائل الإعلام والثقافة مع 5٪ FBS بعد يومين من الحقن.
  6. تحقق الكيسة الأريمية (BL) معدلات 7 أيام بعد الحقن. حساب BL أسعار الفائدة في عدد من الأجنة الكيسة / العدد الكلي للأجنة مثقف في هذا الانخفاض.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

بمساعدة الليزر حقن مكروي حشوية هو بروتوكول قوية وموثوق بها لتقديم حلول في سيتوبلازم بيضات ملقحة الماشية. ويبين الشكل 3 مخطط العام للبيضات ملقحة قبل وبعد حقن فضلا عن مخطط الشامل لهذه التقنية. يستخدم ديكستران الحمراء عن طريق الحقن الحل للسماح الموقع تتبع الحقن والحقن كفاءة ودقة. ويتضح نجاح تنفيذ الحل في الشكل 4 يظهر الجنين حقن مؤخرا والتي يتم توزيعها الصبغة متجانس في السيتوبلازم. باستخدام هذه التقنية يتم حقن 100٪ من ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

Microinjection من بيضات ملقحة هي طريقة راسخة لتقديم حلول في أجنة الثدييات. مع بعض الاختلافات التي تعتمد على الأنواع والهدف من التجربة، وهذه التقنية يمكن استخدامها على نطاق واسع. وتبين لنا كيفية أداء حقن مكروي داخل الهيولى استخدام الليزر لمساعدة مدخل micropipette كليلة نهاية. بيضات ملقحة من بعض الأنواع الحيوانية (مثل الأبقار والأغنام والخنازير) لديها السيتوبلازم الظلام، مما يعوق تصور ماصة حقن مرة واحدة داخل الجنين. أيضا، أغشية البلازما الخاصة بهم ومرنة للغاية، مما يجعل اختراقهم بإب...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

يتم دعم العمل المتعلق بهذه التقنية

من قبل مشاريع NIH / NICHD RO1 HD070044 ومشاريع USDA / NIFA Hatch W-3171 و W-2112.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
مجتذب الماصات الدقيقةأداة Sutter InstrumentP-97
أدوات Sutter الشعرية الزجاجيةB100-75-10هذه الشعيرات الدموية لصنع الماصات المثبتة وحقنها. يمكن استخدام أي أنابيب بورسليكات سميكة / قياسية بدون خيوط.
MicroforgeNarishigeMF-9مجهزة بعدسة تكبير 10X.
MicromanipulatorNikon / NarishigeNT88-V3
مجهر مقلوبنيكونTE2000-Uمزود بعدسات 4X و 20X ونظام ليزر.
أدوات أبحاثالليزر7-47-500زحل 5 ليزر نشط.
موزع دقيقدروموند3-000-105يستخدم الموزع الدقيق لتحريك الأجنة. يمكن أيضا استخدام ماصة p10 مع تحميل أقل حجم ممكن.
طبق ثقافة 100 × 15 ممFalcon351029استخدم غطاء الطبق لعمل لوحة الحقن نظرا لجدرانها السفلية وستجعل وضع وتحريك المعالج الدقيق أسهل. يمكن أيضا استخدام غطاء طبق ثقافة 60 مم.
طبق ثقافة 35 ممCorning430165تستخدم هذه الأطباق لزراعة الأجنة في 50 مو ؛ ل قطرات مغطاة بالزيت المعدني. بدلا من ذلك ، يمكن أيضا استخدام طبق 4 آبار. بغض النظر عن الطبق المختار لزراعة الأجنة ، يجب دائما موازنتها في الحاضنة لمدة 4 ساعات على الأقل قبل نقل الأجنة إليها.
حاضنةسانيوMCO-19AICأي حاضنة يمكن ضبطها على 38.5 درجة ؛ C ، يمكن استخدام ظروف C 2< / sub> .
مجهر مجسمنيكونSMZ800يستخدم لتصور الأجنة في قطرات الثقافة وأثناء الغسيل. يمكن استخدام أي مجهر مجسم بتكبير 10X.
وحدة التحكم HTMinitube12055/0400نظام تسخين متصل بالمجهر المجسم.
المجهر الساخنMinitube12055/0003نظام التدفئة المتصل بالمجهر المجسم.
ديكستران ريدثيرمو ساینتفيكD1828يستخدم محلول معقم 10 مجم / مل للحقن.
الزيوت المعدنيةsigmaM8410حافظ على الزيت المعدني في درجة حرارة الغرفة و   محمي من الضوء باستخدام ورق القصدير.
KSOMaa Evolve BovineZenitZEBV-100مكمل ب 4 مجم / مل BSA. يجب موازنة ألواح KSOM لزراعة الأجنة في حاضنة لمدة 4 ساعات على الأقل قبل الاستخدام.
FBSGemini-Bio100-525استخدم FBS مؤهلا للخلايا الجذعية.
البيضة الملقحةمن 17 إلى 20 hpf ويمكن اشتقاقها in-vitro< / em>- أو in-vivo< / em>-.
كلوريد الصوديومسيجماS5886التركيز النهائي: 107.7 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
KClSigmaP5405التركيز النهائي: 7.16 ملليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
KH2PO4SigmaP5655التركيز النهائي: 1.19 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
MgCl2< / sub> 6H2< / sub>OSigmaM2393التركيز النهائي: 0.49 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
الصوديوم DL-lactateSigmaL4263التركيز النهائي: 5.3 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
CaCl2-2H2O سيجماC7902التركيز النهائي: 1.71 ملليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
D- (& ناقص;)-الفركتوز سيجماF3510التركيز النهائي: 0.5 ملليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
HEPES سيجماH4034التركيز النهائي: 21 ملم. مكون من وسط SOF-HEPES.
MEM-NEAASigmaM7145التركيز النهائي: 1x. مكون من وسط SOF-HEPES.
BME-EAASigmaB6766التركيز النهائي: 1x. مكون من وسط SOF-HEPES.
NaHCO3SigmaS5761التركيز النهائي: 4 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
بيروفات الصوديومسيجماP4562التركيز النهائي: 0.33 مليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
جلوتاماكسجيبكو35050التركيز النهائي: 1 ملليمتر. مكون من وسط SOF-HEPES.
BSASigmaA-3311التركيز النهائي: 1 مجم / مل. مكون من وسط SOF-HEPES.
جنتاميسينسيجماG-1397التركيز النهائي: 5 مو ؛ جم / مل. مكون من وسط SOF-HEPES.
الماء لنقل الأجنةSigmaW1503مكون من وسط SOF-HEPES.
SOF-HEPES متوسطصنع في المختبردرجة الحموضة 7.3 - 7.4 ، 280 & plusmn ؛ 10 مللي أوس. تصفية معقمة من خلال 22 & mu; يمكن تخزين مرشح M في الثلاجة عند 4 درجات ؛ ج لمدة 1 شهر. دافئ في 37 درجة. ج حمام مائي قبل الاستخدام.
تستخدم مرحلة يتم حقن

المراجع

  1. McEvoy, T., Coull, G., Broadbent, P., Hutchinson, J., Speake, B. Fatty acid composition of lipids in immature cattle, pig and sheep oocytes with intact zona pellucida. J Reprod Fertil. 118 (1), 163-170 (2000).
  2. Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).
  3. Ross, P. J., et al. Parthenogenetic activation of bovine oocytes using bovine and murine phospholipase C zeta. BMC Dev Biol. 8 (1), (2008).
  4. Canovas, J., Cibelli, J. B., Ross, P. J. Jumonji domain-containing protein 3 regulates histone 3 lysine 27 methylation during bovine preimplantation development. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (7), 2400-2405 (2012).
  5. Bogliotti, Y. S., et al. 4 Developmental outcomes and effiency of two CRISPR/Cas9 microinjection methods in bovine zygotes. Reprod Fertil Dev. 27 (1), 94-94 (2015).
  6. Bakhtari, A., Ross, P. J. DPPA3 prevents cytosine hydroxymethylation of the maternal pronucleus and is required for normal development in bovine embryos. Epigenetics. 9 (9), 1271-1279 (2014).
  7. Yaul, M., Bhatti, R., Lawrence, S. Evaluating the process of polishing borosilicate glass capillaries used for fabrication of in-vitro fertilization (iVF) micro-pipettes. Biomed Microdevices. 10 (1), 123-128 (2008).
  8. Sutter Instrument. Pipette Cookbook 2015 P-97 & P-1000 Micropipette Pullers. , Sutter Instrument. www.sutter.com/PDFs/pipette_cookbook.pdf (2015).
  9. Sutter Instrument. P-97 Flaming/BrownTM Micropipette Puller Operation Manual Rev. 2.30 - DOM (20140825). , www.sutter.com/manuals/P-97-DOM_OpMan.pdf (2014).
  10. Cibelli, J. B., Lanza, R. P., Campbell, K. H. S., West, M. D. Principles of cloning. , Academic Press. (2002).
  11. Wang, B., et al. Expression of a reporter gene after microinjection of mammalian artificial chromosomes into pronuclei of bovine zygotes. Mol Reprod Dev. 60 (4), 433-438 (2001).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

الوسوم

الحقن المجهري بمساعدة الليزرالحقن السيتوبلازميالمنطقة الشفافةالماصة المجهرية ذات الطرف غير المدببتمزق الغشاء البلازميحقن الأجنةتقنية التشكيل المجهريإيصال المحلولتطور الكيسة الأرومية
حشوية حقن مكروي في الثروة الحيوانية بيضات ملقحة بمساعدة الليزر
تواصل معنا
أوصِ به للمكتبة

الخصوصية

شروط الاستخدام

السياسات

حقوق الطبع والنشر © 2026 MyJoVE Corporation. جميع الحقوق محفوظة.