مقالة منهجية

عزل البروتينات الدهنية عالية الكثافة لغير الترميز الصغيرة RNA الكمي

DOI:

10.3791/54488

⸱

نوفمبر 28, 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Medicine, Vanderbilt University School of Medicine, 2Center for Quantitative Sciences, Vanderbilt University School of Medicine, 3Department of Cancer Biology, Vanderbilt University School of Medicine

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

يصف هذا البروتوكول عزل وقياس الحمض النووي الريبي الصغير عالي الكثافة للبروتين الدهني.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تنوع الرنا غير الترميز صغيرة (الحمض الريبي النووي الذواب) توسعا سريعا ودورهم في العمليات البيولوجية، بما في ذلك تنظيم الجينات، آخذة في الظهور. الأمر المثير للاهتمام، وجدت sRNAs أيضا خارج الخلايا وتكون موجودة في جميع السوائل البيولوجية ثابت. على هذا النحو، تمثل sRNAs خارج الخلية فئة جديدة من المؤشرات الحيوية المرض ويشارك على الأرجح في الخلايا مما يشير الى وشبكات الاتصالات بين الخلايا. لتقييم قدراتهم والمؤشرات الحيوية، sRNAs يمكن قياسها كميا في البلازما والبول، وغيرها من السوائل. مع ذلك، إلى فهم كامل للتأثير sRNAs خارج الخلية كإشارات الغدد الصماء، فمن المهم تحديد ناقلات التي تنقل وتحميهم في السوائل البيولوجية (على سبيل المثال، البلازما)، والتي تساهم الخلايا والأنسجة لحمامات الحمض الريبي النووي الذواب خارج الخلية، والخلايا والأنسجة قادرة قبول واستخدام خارج الخلية الحمض الريبي النووي الذواب. ولتحقيق هذه الأهداف، فمن الأهمية بمكان لعزل السكان نقية للغاية من الناقلات خارج الخليةلالتنميط الحمض الريبي النووي الذواب وتقدير. لقد أثبتنا سابقا أن البروتينات الدهنية، وخاصة البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL)، والنقل الرنا الميكروية وظيفية (ميرنا) بين الخلايا وHDL-miRNAs تتغير بشكل ملحوظ في المرض. هنا، ونحن بالتفصيل بروتوكول جديد أن تستخدم جنبا إلى جنب HDL العزلة مع تنبيذ فائق الكثافة التدرج (DGUC) وسريع البروتين السائل اللوني (FPLC) للحصول على HDL نقية للغاية لتحديد ملامح المصب وتقدير من جميع sRNAs، بما في ذلك miRNAs، وذلك باستخدام كلا عالية التسلسل -throughput والنهج PCR في الوقت الحقيقي. وهذا البروتوكول أن يكون مصدرا قيما للتحقيق في sRNAs على HDL.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

الترميز غير الرنا خارج الخلية الصغيرة (sRNAs) تمثل فئة جديدة من المؤشرات الحيوية المرض والأهداف العلاجية المحتملة، ومن المرجح تسهل خلية الى خلية الاتصال 1. النوع الأكثر درس على نطاق واسع من الحمض الريبي النووي الذواب والرنا الميكروية (ميرنا) التي ما يقرب من 22 اليلة في الطول، ويتم معالجتها من أشكال السلائف أطول والنصوص الأولية 2. أثبتت miRNAs للنشر ما بعد transcriptionally تنظيم التعبير الجيني من خلال قمع ترجمة البروتين وتحريض تدهور مرنا 2. ومع ذلك، miRNAs هي مجرد واحدة من العديد من أنواع sRNAs. كما sRNAs يمكن المشقوق من tRNAs الأم (sRNAs المشتقة من الحمض الريبي النووي النقال، تقرير التجارة والتنمية)، الرنا صغيرة النووية (sRNAs المستمدة الحمض الريبي النووي الذواب، sndRNA)، الرنا صغيرة نويي (sRNAs المستمدة snoRNA، snRNA)، الرنا الريباسي (sRNAs، RDR الريباسي المشتقة )، Y الرنا (yDR)، وغيرها من الرنا المتنوعة 1. وقد أبلغ عن أمثلة قليلة من هذه sRNAs الرواية إلى وظيفة مماثلة لmiRNAs. ومع ذلك، فإن فو البيولوجيnctions العديد من هذه sRNAs ويبقى أن تحدد، على الرغم من الأدوار في تنظيم الجينات من المرجح 3-6. الأمر المثير للاهتمام، miRNAs وsRNAs أخرى موجودة مستقر في السوائل خارج الخلية، بما في ذلك اللعاب، والبلازما والبول، والصفراء. ومن المرجح حماية sRNAs خارج الخلية من RNases من خلال ارتباطهم مع حويصلات خارج الخلية (EV)، البروتينات الدهنية، و / أو المجمعات بروتين نووي ريبوزي خارج الخلية.

سابقا، وذكرت أن البروتينات الدهنية، وهي البروتينات الدهنية عالية الكثافة (HDL)، miRNAs النقل في البلازما 7. في هذه الدراسة، تم عزل HDL باستخدام طريقة متتابعة من تنبيذ فائق الكثافة التدرج (DGUC)، البروتين بسرعة اللوني السائل (حجم الاستبعاد هلام اللوني الترشيح، FPLC)، وتقارب اللوني (مكافحة ئي منظمة العفو الدولية (برنامج عمل ألماتي-I) مناعي ) 7. باستخدام كل الوقت الحقيقي PCR القائم صفائف منخفض الكثافة والمقايسات ميرنا الفردية، وتم قياس كمية مستويات ميرنا على HDL معزولة عن شفاءخاصتك والمواضيع hypercholesterolemic 7. باستخدام هذا النهج، كنا قادرين على البيانات الشخصية miRNAs وتحديد miRNAs محددة في الاستعدادات HDL نقية للغاية. منذ عام 2011، فقد قررنا أنه على الرغم اللوني تقارب يعزز HDL النقاء، الأجسام المضادة التشبع يحد بدرجة كبيرة الغلة، ويمكن أن تكون باهظة التكلفة. حاليا، يوصي بروتوكول لدينا على بعد خطوتين طريقة جنبا إلى جنب متسلسل من DGUC تليها FPLC، التي تنتج أيضا عينات HDL عالية الجودة لأسفل مجرى عزل الحمض النووي الريبي والحمض الريبي النووي الذواب الكمي. بسبب التطورات الحديثة في التسلسل الإنتاجية العالية من sRNAs (sRNAseq)، على سبيل المثال، miRNAs، وزيادة الوعي من الطبقات غير ميرنا الحمض الريبي النووي الذواب أخرى، sRNAseq هو تيار دولة من بين الفن في ميرنا والحمض الريبي النووي الذواب التنميط. على هذا النحو، يوصي بروتوكول لدينا قياس miRNAs وsRNAs الآخرين على عينات HDL باستخدام sRNAseq. ومع ذلك، الحمض النووي الريبي مجموع معزولة عن HDL يمكن أن تستخدم أيضا لتحديد miRNAs الفردية وsRNAs الآخرين أو التحقق من صحة النتائج sRNAseq في الوقت الحقيقي باستخدام PCR لpproaches. نحن هنا تصف بالتفصيل بروتوكول لجمع وتنقية والتقدير الكمي، وتحليل البيانات، والتحقق من صحة نقية للغاية HDL-sRNAs.

ويتمثل الهدف العام من هذه الورقة هو لإثبات جدوى وعملية من الحمض الريبي النووي الذواب الكمي في HDL نقية للغاية معزولة من البلازما البشرية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. HDL تنقية (~ 5.5 أيام)

  1. الكثافة التدرج تنبيذ فائق (DGUC، ~ 5 أيام)
    1. إضافة 90 ميكرولتر من 100X المضادة للتأكسد إلى 9 مل من البلازما معزولة من الدم الوريدي جديدة.
    2. ضبط كثافة البلازما مع شركة KBR من 1.006 غرام / مليلتر إلى 1.025 غرام / مليلتر بإضافة 0.251 ز KBR إلى 9 مل من البلازما من الخطوة 1.1.1 (0.0278 جم / مل KBR البلازما). صخرة البلازما حتى يذوب كل الملح في درجة حرارة الغرفة، ونقل إلى نابذة الأنابيب وضمان جميع فقاعات ترتفع إلى الأعلى.
    3. ثني غيض من إبرة 18 G 90 ° 1 سم من الحافة، والجانب شطبة مواجهة. باستخدام حقنة وإبرة قياس 18، وضع بعناية 3 مل من تراكب حل # 1 على البلازما (الجدول 1).
      ملاحظة: إبرة عازمة يضمن كل VLDL / المختبر الدولي للألماس، LDL، وتتم إزالة HDL دون خلط مع تراكب.
    4. إزالة معظم الفقاعات في الجزء العلوي، وترك 2-3 الفضاء ملم من الغضروف المفصلي إلى أعلى الأنبوب ويتنبهوضع LLY الأنابيب في الدلاء SW-40Ti.
    5. تزن كل دلو (مع قبعات) على التوازن، والتوازن تماما مع دلو المعاكس (دلو + الحد الأقصى): رقم 1 إلى رقم 4، رقم 2 إلى رقم 5، ورقم 3 إلى رقم 6.
      ملاحظة: يجب أن تكون هذه الدلاء متوازن ومطابقة في جميع الأوقات.
    6. وضع الدوار في نابذة (قائمة المواد). أجهزة الطرد المركزي في 274400 x ج لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الفرامل وسيط رقم 4.
    7. إزالة بعناية دلاء من الدوار وأنابيب من الدلاء.
    8. إزالة بعناية 2 مل من الطبقة العليا من تراكب باستخدام المحاقن والإبر عازمة. وستكون هذه هي جزء VLDL / المختبر الدولي للألماس والتي يمكن تخزينها في 4 ° C أو -80 ° C.
    9. بعد إزالة جزء VLDL / المختبر الدولي للألماس، وجمع 7 مل المتبقية من العينة (البلازما) ووضعه في أنبوب مخروطي 15 مل. تبرزي حجم العينة ما يصل إلى 9 مل مع تراكب حل # 2 (الجدول 1).
    10. ضبط كثافة عينة من 1.025 غرام / مليلتر إلى 1.080 غرام / مليلتر مع KBR باستخدامما يقرب من 0.746 ز كي بي آر في العينة 9 مل أو 0.0828 جم / مل KBR من العينة. صخرة بلطف العينة حتى يتم حل KBR كل (حوالي 20 دقيقة)، ونقل إلى نابذة أنبوب بينما ترتفع ضمان فقاعات إلى الأعلى.
    11. مع المحاقن والإبر، ضع بعناية 3 مل من تراكب حل # 3 على عينة (الجدول 1). ترك 2-3 الفضاء ملم من الغضروف المفصلي إلى أعلى الأنبوب.
    12. إزالة معظم أي فقاعات المتبقية في الجزء العلوي من الأنبوب ووضع بعناية أنابيب نابذة شغل في الدلاء SW-40Ti.
    13. تزن كل دلو (مع قبعات) على التوازن، والتوازن تماما مع دلو المعاكس + كأب، وكما هو الحال في 1.1.5.
    14. وضع الدوار في نابذة (انظر قائمة من المواد). أجهزة الطرد المركزي في 274400 x ج لمدة 24 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الفرامل وسيط رقم 4.
    15. إزالة بعناية دلاء من الدوار وأنابيب من الدلاء.
    16. إزالة بعناية 2 مل من الطبقة العليا من تراكب باستخدام حقنة ويكونالإقليم الشمالي إبرة. وستكون هذه هي جزء LDL التي يمكن تخزينها في 4 ° C أو -80 ° C.
    17. بعد إزالة جزء LDL، وجمع ما تبقى تقريبية 7 مل من عينة (البلازما) ووضعه في أنبوب جديد 15 مل المخروطية. تبرزي حجم العينة (البلازما) ما يصل إلى 9 مل مع 1.080 غ / مل من محلول رقم 4 (الجدول 1).
    18. ضبط كثافة عينة من 1.080 غرام / مليلتر إلى 1.30 جم / مل مع KBR باستخدام 3.33 ز كي بي آر في 9 مل العينة (البلازما) أو 0.37 ز KBR لكل مل من العينة. صخرة أو تستنهض الهمم قليلا العينة حتى يتم حل KBR (الملح) كل ونقل إلى نابذة أنبوب.
    19. مع المحاقن والإبر، ضع بعناية 3 مل من تراكب حل # 5 على عينة (الجدول 1).
    20. إزالة معظم أي فقاعات المتبقية في الجزء العلوي من الأنبوب، وترك 2- مساحة 3 ملم من الغضروف المفصلي إلى أعلى الأنبوب ووضع بعناية أنابيب نابذة شغل في الدلاء SW-40Ti.
    21. تزن كل دلو (مع القبعات) على التوازن، والتوازن بالضبط مع دلو المعاكس + كأب، وكما هو الحال في 1.1.5.
    22. وضع الدوار في نابذة (انظر قائمة من المواد). أجهزة الطرد المركزي في 274400 x ج لمدة 48 ساعة عند 4 درجات مئوية مع الفرامل رقم 4.
    23. إزالة بعناية دلاء من الدوار وأنابيب من الدلاء.
    24. إزالة بعناية ما يقرب من 2 مل من الطبقة العليا من تراكب باستخدام المحاقن والإبر عازمة. هذا هو جزء HDL، والتي يمكن تخزينها في 4 درجات مئوية أو -80 درجة مئوية.
      ملاحظة: بعد HDL DGUC يمكن مدال لإزالة الحلول عالية من الملح.
    25. لdialyze، ضع جزء HDL التي تم جمعها في كم غسيل الكلى مختوم (10000 ميغاواط قطع) وdialyze بين عشية وضحاها في 1 لتر برنامج تلفزيوني 1X. عازلة تغيير غسيل الكلى (برنامج تلفزيوني 1X) 3 مرات خلال 24 ساعة. سوف اضطراب طيف من برنامج تلفزيوني مع المغناطيسي ضجة بار تحسين غسيل الكلى.
    26. تحديد تركيز البروتين من DGUC-HDL باستخدام أسلوب BCA 8.
  2. سريع البروتين السائل CHROالفصل الكروماتوغرافي (FPLC) أو الحجم، الاستبعاد اللوني (~ 6 ساعات)
    1. تصفية 1.2 ملغ من DGUC-HDL (البروتين الكلي) في 500 ميليلتر من خلال 0.22 ميكرون فلتر الصغيرة الطرد المركزي (انظر قائمة من المواد)، مباشرة قبل الحقن.
      ملاحظة: لتصفية إضافية من العينة DGUC-HDL من خلال 0.45 ميكرون فلتر الصغيرة الطرد المركزي قبل مرشح 0.22 ميكرون قد تكون هناك حاجة لبعض العينات.
    2. جمع تصفيتها عينة DGUC-HDL، تحميل حقن حقنة FPLC (ملء)، والتأكد من عدم وجود فقاعات في حقنة قبل الحقن في FPLC.
    3. ضبط معدل تدفق FPLC إلى 0.3 مل / دقيقة مع حد الضغط على 2.6 ميجا باسكال. تتوازن الأعمدة مع 0.2 أحجام العمود (حوالي 15 مل) من العازلة، قبل أن يجرب الحقن. حقن عينة مع 3 مل من العازلة في (حقن حلقة) أداة FPLC وبدء التشغيل. جمع 1.5 كسور مل لما مجموعه 72 الكسور.

2. عالية الإنتاجية RNA الصغيرةالتسلسل (sRNAseq، ~ 9 أيام)

  1. عزل الحمض النووي الريبي (~ 1 يوم)
    1. تحديد الكسور FPLC الموافق DGUC-HDL من خلال تحديد مستويات الكولسترول الكلي باستخدام مجموعة اللونية وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. استخدام هذا FPLC مجموعة المتابعة، ونتوقع أن تجد 6-7 كسور FPLC تحتوي على DGUC-HDL.
    2. جمع كل حجم (حوالي 8 -1 0 مل بركة من 1.45 مل جزء مجلدات) من كسور DGUC-HDL FPLC والتركيز باستخدام 10 كيلو دالتون ميجاوات وحدات تصفية الطرد المركزي قطع في 4000 x ج لمدة 1 ساعة عند 4 درجات مئوية أو حتى التركيز HDL ما يقرب من 100 ميكرولتر.
    3. جمع تركيز HDL وقياس تركيز البروتين الكلي الحميد باستخدام طريقة BCA 8.
    4. تحديد أعلى تركيز HDL البروتين الكلي، تصل إلى 1 ملغ، والتي يمكن aliquoted من كل عينة في المجموعة. على سبيل المثال، عزل الحمض النووي الريبي من نفس الكمية من HDL البروتين الكلي لكل عينة.
    5. أداء عزل الحمض النووي الريبي باستخدامبروتوكول تعديل (انظر قائمة من المواد).
      1. إضافة 10X حجم كاشف الفينول تحلل (انظر قائمة من المواد) عينة ودوامة لمدة 1 دقيقة.
      2. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
      3. إضافة الكلوروفورم (20٪ من حجم كاشف الفينول تحلل المستخدمة في الخطوة 2.1.5.1) ويهز بقوة لمدة 15 ثانية.
      4. يحضن في درجة حرارة الغرفة ل2-3 دقيقة.
      5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 12000 x ج في 4 درجات مئوية في جهاز للطرد المركزي المبردة.
      6. نقل المرحلة المائية العليا لأنبوب جديد، وتجنب البيني.
      7. إضافة إلى حجم 1.5X من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى المرحلة المائية ودوامة لمدة 1 دقيقة.
      8. تخزين العينات لمدة 1 ساعة على الأقل أو طوال الليل في -80 درجة مئوية.
      9. تواصل مع بروتوكول عزل الحمض النووي الريبي باستخدام أعمدة صغيرة المقدمة.
      10. أزل مع 30 ميكرولتر من ريبونوكلياز خالية H 2 O. أولا إضافة 15 ميكرولتر من H 2 O مباشرة إلى فريت، وتدور بسرعة منخفضة (2000 x ج) لمدة 2 دقيقة، وثم تدور بسرعة عالية (كحد أقصى) لمدة 1 دقيقة. كرر هذه الخطوة مع 15 ميكرولتر إضافية من H 2 O.
    6. الشروع فورا في الحمض الريبي النووي الذواب جيل مكتبة أو متجر في -80 درجة مئوية.
  2. الجيل مكتبة (~ 6 ساعات)
    1. إعداد مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] باستخدام الحمض الريبي النووي الذواب جيل مكتبة بروتوكول عدة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع تعديل واحد لتضخيم PCR كما هو موضح أدناه.
      1. إعداد mastermix PCR على الجليد التي تحتوي على 0.5 ميكرولتر الدناز / ريبونوكلياز خالية H 2 O، 15 ميكرولتر PCR مزيج (الرابطة الاسلامية الباكستانية) و 1 ميكرولتر RNA PCR التمهيدي (RP1) لكل عينة (بما في ذلك مبلغ إضافي 10٪ للpipetting لخطأ).
      2. إضافة 16.5 ميكرولتر من PCR مزيج من كل (كدنا]) عينة.
      3. تعيين الرقم القياسي / الباركود على كل عينة لمضاعفة وإضافة 1 ميكرولتر مؤشر التمهيدي PCR (إلى الرقم المناظر) للعينة.
      4. إجراء دوران سريع باستخدام microfuge.
        ملاحظة: الحجم الكلي ينبغييكون الآن 30 ميكرولتر لكل عينة.
      5. أداء الظروف ركوب الدراجات لPCR التضخيم كما هو موضح في الجدولين 2 و 3.
  3. حجم اختر مكتبة الحمض الريبي النووي الذواب لإزالة محول: محولات (~ 1.5 ساعة)
    1. أداء المكتبة الحجم التحديد باستخدام التلقائي حجم الحمض النووي محدد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة مع المعلمات حجم التالية: الهدف: 156 نقطة أساس، البدء: 135 سنة مضت، نهاية: 177 سنة مضت، المدى العلم: واسعة.
  4. الحمض النووي تنظيف (~ 0.5 ساعة)
    1. تنظيف حجم مختارة الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
    2. أزل نظيفة وتتركز الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] مع H 2 × 7 ميكرولتر الدناز / ريبونوكلياز خالية من 2 O.
  5. قياس وتقييم الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] مكتبة المحصول والجودة (~ 1 ساعة)
    1. تقييم الحمض الريبي النووي الذواب كدنا] جودة المكتبات وحجم باستخدام رقاقة الحمض النووي ذات حساسية عالية على bioanalyzer (قائمة المواد) حسب التصنتعليمات urer ل.
    2. قياس تركيزات مكتبة الحمض الريبي النووي الذواب [كدنا الفردية باستخدام فحص الحمض النووي ذات حساسية عالية (قائمة المواد)، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
      ملاحظة: من المستحسن أن يكون جميع العينات مع مؤشرات مختلفة يتم تشغيلها على نفس الممر من الخلية التدفق إن أمكن. إذا كنت بحاجة حارة أكثر من واحد، مزيج حالة ومراقبة العينات بشكل مناسب.
  6. الإنتاجية العالية الحمض الريبي النووي الذواب التسلسل (~ 7 أيام)
    1. تجمع الفرد فهرسة المكتبات الحمض الريبي النووي الذواب بناء على تركيزات متساوي المولية.
    2. مجمعة شاشة مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب عن الجودة باستخدام ذات حساسية عالية رقاقة الحمض النووي على bioanalyzer وتحديد تركيز الحمض النووي المكتبة كما هو الحال في 2.5.1 - 2.5.2.
    3. أداء الكمي PCR (QPCR) من المحتويات محول لضمان عمق التسلسل المناسب باستخدام مكتبة التسلسل عدة QPCR الكمي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة (قائمة المواد).
    4. أداء التسلسل باستخدام قراءة واحدة، 50 ببروتوكول ص لتصل إلى عمق حوالي 20 - 25 M يقرأ / عينة، وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.

3. تحليل البيانات (~ 1 يوم)

  1. استخدام bcl2fastq2، وفقا لتعليمات دليل المستخدم، لملفات fastq الخام المعالجة المسبقة لعينات demultiplexed (قائمة المواد).
  2. استخدام Cutadapt لخفض محولات 9 و إزالة يقرأ <16 النيوكليوتيدات (اليلة) في الطول، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
  3. إزالة تسلسل التلوث الموجودة في مكتبات الحمض الريبي النووي الذواب، بما في ذلك تسلسل وقف الحل (STP: CCACGTTCCCGTGG) ومحول ترحيل (CTACAGTCCGACGATC) باستخدام وظيفة removeSequenceInFastq في إطار NGSPERL، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
  4. أداء مقاييس مراقبة الجودة من قبل FastQC مركز العلوم الكمي (CQS) أدوات تستخدم، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
  5. توليد قائمة غير زائدة من "متطابقة" يقرأ (انهيار redundaيقرأ الإقليم الشمالي) وأرقام النسخة الأصلية باستخدام CQSTools، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
  6. محاذاة يقرأ على الجينوم البشري باستخدام Bowtie1.1.2 السماح 1 عدم تطابق (خيارات: -A -m 100 --best --strata -v 1)، وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
  7. أداء قراءة المحاذاة، العد، ويؤدي المهام التلخيص باستخدام NGSPERL، وفقا لتعليمات دليل المستخدم.
  8. تحويل جدول العد تصديرها إلى ملف البيانات.
  9. تطبيع يقرأ من فئة معينة (على سبيل المثال، miRNAs) لعدد من يقرأ لتلك الفئة (على سبيل المثال، عدد من miRNAs يقرأ) وإشارات التقرير بأنه يقرأ لكل المعينة ميرنا (RPMM). (على سبيل المثال، RPMM = (مير-X / إجمالي # ميرنا يقرأ) * 1000000).
  10. مدخلات تطبيع جدول العد إلى تقنية عامة لون واحد في البرنامج لمستوى منخفض والتفضيلية رفيع المستوى يحلل وفقا لتعليمات دليل المستخدم (قائمة المواد).
    ملاحظة: في الوقت الراهن، هناك جينات التدبير المنزلي لا تميز جيدا / صرنأما بالنسبة HDL-الحمض الريبي النووي الذواب. ويمكن استخدام ضبط ارتفاع في، ولكن يمكن أن يكون مشكلة. تطبيع إلى HDL مجموع المدخلات البروتين أو حجم ينصح. الأهم من ذلك، فمن المستحسن للتحقق من صحة النتائج التسلسل من قبل واحدة من استراتيجيات مختلفة لتحديد miRNAs وsRNAs في الوقت الحقيقي باستخدام PCR أو PCR الكمي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول هو عبارة عن سلسلة من أساليب إنشاء ترتبط معا للسماح لتقدير حجم sRNAs على HDL نقية للغاية من الإنتاجية العالية التسلسل أو في الوقت الحقيقي PCR (الشكل 1). لإثبات جدوى وتأثير هذا البروتوكول، وتنقيته HDL من البلازما البشرية على الركيزتين DGUC وFPLC الأسلوب. وتركزت كسور FPLC جمعها الموافق HDL (الكوليسترول عن طريق التوزيع) وتم عزل الحمض النووي الريبي مجموع من 1 ملغ من الكوليسترول الجيد (البروتين الكلي). تم إنشاؤها مكتبات ال...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم تصميم هذا البروتوكول لتحديد miRNAs وsRNAs الآخرين من خلال الإنتاجية العالية التسلسل أو في الوقت الحقيقي PCR على HDL نقية للغاية. كما هو الحال مع أي نهج، ينبغي إيلاء اعتبار خاص لكل خطوة في عملية HDL تنقية وRNA ومن ثم قياس sRNAs. تم تصميم هذا البروتوكول لمشاريع بدءا ≥ 2 مل من البلازما. ومع ذلك، يمكن أن تكتمل بنجاح تحليلات الحمض النووي الريبي جودة عالية مع HDL تنقيته من اقل من 80 ميكرولتر من البلازما البشرية أو الماوس باستخدام تقارب اللوني. ومع ذلك، وأكبر كميات انطلاق البلازما تنت...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم دعم هذا العمل من خلال جوائز من المعاهد الوطنية للصحة والمعهد الوطني للقلب والرئة والدم إلى KCV HL128996 و HL113039 و HL116263. تم دعم هذا العمل أيضا من خلال جوائز من جمعية القلب الأمريكية إلى KCV CSA2066001 و DLM POST26630003 و RMA POST25710170.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أجهزة الطرد المركزي الفائقة بيكمان كولترA99839Optima XPN-80
جهاز طرد مركزي فائق الدواربيكمانكولتر 331362SW-41Ti
AKTA نظام FPLC النقيGE Healthcare29018224
3x FPLC Superdex 200 زيادة الأعمدة في الخطGE Healthcare28990944 10/300 gl
SynergyMxBioTek Instruments7191000
منضدية جهاز طرد مركزيThermo Scientific75004525Sorvall ST40R
جهاز طرد مركزي مبردEppendorf226298675417R (تم شراؤه من خلال USA Scientific)
Microfuge الولايات المتحدة الأمريكية العلمية2631-0006
PippenPrepSage SciencePIP0001
2100 Bioanalyzer AgilentG2938B
عالية الحساسية اختبار الحمض النوويAgilent5067-4626
مكتبة التسلسل qPCR مجموعة القياس الكميIlluminaSY-930-1010
ProFlex Thermal Cyclerالأنظمة الحيوية التطبيقية4484073
QuantStudio 12k FlexApplied Biosystems4471134
EpMotion RobotEppendorf9600001115070
أنابيب طرد مركزي فائقة الوضوحبيكمان كولتر344059
بروميد البوتاسيومفيشر للكيماوياتP205-500
أنبوب مخروطي 15 ملThermo Scientific339650
مرشحات الطرد المركزي الدقيقة 0.45 & micro ؛ مMilliporeUFC30HV00
مرشحات الطرد المركزي الدقيقة 0.22 & mMilliporeUFC30GV00
miRNAasy مجموعات عزل الحمض النووي الريبي الكليQiagen217004
مجموعة قياس الألوان الكلي للكوليسترولCliniqa (Raichem)R80035
10,000 ميجاوات مرشح الطرد المركزي المقطوعAmiconUFC801024من خلال أنابيب شريط Millipore
PCRAxygenPCR-0208-Cالتي تم شراؤها من خلال فيشر
مجموعة microRNA RTLife Technologies4366597ل 1000 تفاعل
PCR Master mixLifeTechnologies 4440041زجاجة 50 مل
Pierce BCA kitThermo Scientific23225
Clean and ConcentraterKit ZymoD4014
غسيل الكلىSpectrum Labs132118من خلال فيشر
bcl2fastq2Illuminan / aSoftware
Cutadapthttps://github.com/marcelm/cutadaptN / aSoftware
NGSPERLgithub.com/shengqh/ngsperlN / aSoftware
CQSToolsgithub.com/shengqh/CQS.ToolsN / aSoftware
Bowtie 1.1.2 http://bowtie-bio.sourceforge.netبرنامج
GeneSpringGX13.1.1Agilentn / aSoftware
أنابيب

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vickers, K. C., Roteta, L. A., Hucheson-Dilks, H., Han, L., Guo, Y. Mining diverse small RNA species in the deep transcriptome. Trends Biochem Sci. 40, 4-7 (2015).
  2. Bartel, D. P. MicroRNAs: genomics, biogenesis, mechanism, and function. Cell. 116, 281-297 (2004).
  3. Haussecker, D., et al. Human tRNA-derived small RNAs in the global regulation of RNA silencing. RNA. 16, 673-695 (2010).
  4. Li, Z., et al. Extensive terminal and asymmetric processing of small RNAs from rRNAs, snoRNAs, snRNAs, and tRNAs. Nucleic Acids Res. 40, 6787-6799 (2012).
  5. Martens-Uzunova, E. S., Olvedy, M., Jenster, G. Beyond microRNA--novel RNAs derived from small non-coding RNA and their implication in cancer. Cancer Lett. 340, 201-211 (2013).
  6. Maute, R. L., et al. tRNA-derived microRNA modulates proliferation and the DNA damage response and is down-regulated in B cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1404-1409 (2013).
  7. Vickers, K. C., Palmisano, B. T., Shoucri, B. M., Shamburek, R. D., Remaley, A. T. MicroRNAs are transported in plasma and delivered to recipient cells by high-density lipoproteins. Nat Cell Biol. 13, 423-433 (2011).
  8. Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
  9. Chen, C., Khaleel, S. S., Huang, H., Wu, C. H. Software for pre-processing Illumina next-generation sequencing short read sequences. Source Code Biol Med. 9, 8(2014).
  10. Vickers, K. C., Remaley, A. T. Lipid-based carriers of microRNAs and intercellular communication. Curr Opin Lipidol. 23, 91-97 (2012).
  11. Greening, D. W., Xu, R., Ji, H., Tauro, B. J., Simpson, R. J. A protocol for exosome isolation and characterization: evaluation of ultracentrifugation, density-gradient separation, and immunoaffinity capture methods. Methods Mol Biol. 1295, 179-209 (2015).
  12. Sung, B. H., Ketova, T., Hoshino, D., Zijlstra, A., Weaver, A. M. Directional cell movement through tissues is controlled by exosome secretion. Nat Commun. 6, 7164(2015).
  13. Livak, K. J., Schmittgen, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25, 402-408 (2001).
  14. Jung, R., Lubcke, C., Wagener, C., Neumaier, M. Reversal of RT-PCR inhibition observed in heparinized clinical specimens. Biotechniques. 23, (1997).
  15. Johnson, M. L., Navanukraw, C., Grazul-Bilska, A. T., Reynolds, L. P., Redmer, D. A. Heparinase treatment of RNA before quantitative real-time RT-PCR. Biotechniques. 35, 1140-1142 (2003).
  16. Garcia, M. E., Blanco, J. L., Caballero, J., Gargallo-Viola, D. Anticoagulants interfere with PCR used to diagnose invasive aspergillosis. J Clin Microbiol. 40, 1567-1568 (2002).
  17. Yokota, M., Tatsumi, N., Nathalang, O., Yamada, T., Tsuda, I. Effects of heparin on polymerase chain reaction for blood white cells. J Clin Lab Anal. 13, 133-140 (1999).
  18. Bai, X., et al. Predictive value of quantitative PCR-based viral burden analysis for eight human herpesviruses in pediatric solid organ transplant patients. J Mol Diagn. 2, 191-201 (2000).
  19. McShine, R. L., Sibinga, S., Brozovic, B. Differences between the effects of EDTA and citrate anticoagulants on platelet count and mean platelet volume. Clin Lab Haematol. 12, 277-285 (1990).
  20. Fichtlscherer, S., et al. Circulating microRNAs in patients with coronary artery disease. Circ Res. 107, 677-684 (2010).
  21. Pritchard, C. C., Cheng, H. H., Tewari, M. MicroRNA profiling: approaches and considerations. Nat Rev Genet. 13, 358-369 (2012).
  22. Kirschner, M. B., et al. Haemolysis during sample preparation alters microRNA content of plasma. PLoS One. 6, e24145(2011).
  23. Kannan, M., Atreya, C. Differential profiling of human red blood cells during storage for 52 selected microRNAs. Transfusion. 50, 1581-1588 (2010).
  24. Chen, S. Y., Wang, Y., Telen, M. J., Chi, J. T. The genomic analysis of erythrocyte microRNA expression in sickle cell diseases. PLoS One. 3, e2360(2008).
  25. Balzano, F., et al. miRNA Stability in Frozen Plasma Samples. Molecules. 20, 19030-19040 (2015).
  26. Redgrave, T. G., Roberts, D. C., West, C. E. Separation of plasma lipoproteins by density-gradient ultracentrifugation. Anal Biochem. 65, 42-49 (1975).
  27. Cheung, M. C., Wolf, A. C. Differential effect of ultracentrifugation on apolipoprotein A-I-containing lipoprotein subpopulations. J Lipid Res. 29, 15-25 (1988).
  28. Kunitake, S. T., Kane, J. P. Factors affecting the integrity of high density lipoproteins in the ultracentrifuge. J Lipid Res. 23, 936-940 (1982).
  29. Laurent, L. C., et al. Meeting report: discussions and preliminary findings on extracellular RNA measurement methods from laboratories in the NIH Extracellular RNA Communication Consortium. J Extracell Vesicles. 4, 26533(2015).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

BCA

مقالات ذات صلة