مقالة منهجية

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من

DOI:

10.3791/54527

⸱

أكتوبر 23, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cellular, and Developmental Biology, University of Michigan, 2Howard Hughes Medical Institute, University of Michigan

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

توضح هذه الدراسة تقنيات الطبيعية الحيوية، والكيمياء الحيوية والجزيئية لوصف النشاط كوصي من الإشريكية القولونية HdeB في ظل الظروف الحامضية. وقد تم تطبيق هذه الأساليب بنجاح للمرافقين آخرين حامض واقية مثل HdeA ويمكن تعديل للعمل من أجل مرافقين آخرين وظروف الإجهاد.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

وكثيرا ما تتعرض البكتيريا لتغيرات بيئية، مثل التغيرات في درجة الحموضة، ودرجة الحرارة، وحالة الأكسدة، التعرض للضوء أو القوة الميكانيكية. العديد من هذه الشروط يسبب البروتين تتكشف في الخلية ويكون لها تأثير ضار على بقاء الكائن الحي. وقد أظهرت مجموعة من لا علاقة لها، المحرمين الجزيئي الإجهاد محددة للعب أدوار أساسية في بقاء هذه ظروف الإجهاد. في حين مطوية بالكامل وكوصي غير نشط قبل الإجهاد، وهذه البروتينات تتكشف بسرعة ويصبح-كوصي نشط تحت ظروف الإجهاد محددة. تنشيط مرة واحدة، وهذه مرافقين المختلين مشروط ربط عدد كبير من البروتينات المعرضة للتجميع مختلفة، ومنع تجميع وإما بشكل مباشر أو غير مباشر تسهيل بروتين refolding لدى عودته إلى الظروف غير الإجهاد. النهج الأساسي لاكتساب فهم أكثر تفصيلا حول آلية تفعيل والعميل الاعتراف بها ينطوي على تنقية وsubsequenر توصيف هذه البروتينات باستخدام فحوصات في المختبر كوصي. المتابعة في المقايسات إجهاد الجسم الحي ضرورية للغاية لتأكيد مستقل حصلت في نتائج المختبر.

يصف هذا البروتوكول في التجارب المختبرية وأساليب الجسم الحي لوصف النشاط كوصي من E. القولونية HdeB، وهو كوصي حمض تفعيلها. واستخدمت القياسات نثر الخفيفة، مريحة للقراءة خارج عن قدرة HdeB لمنع تجميع الناجم عن حمض من البروتين العميل نموذج المعمول بها، مليون درهم، في المختبر. طبقت التجارب تنبيذ فائق التحليلية للكشف عن تشكيل المعقد بين HdeB ورابطة حقوق الإنسان البروتين عملائها، لتسليط الضوء على مصير البروتينات العميل لدى عودتهم إلى الظروف غير الإجهاد. وأجريت فحوصات النشاط الأنزيمية للبروتينات العميل لرصد آثار HdeB على تعطيل العميل الناجم عن درجة الحموضة وتنشيط. وأخيرا، استخدمت دراسات البقاء على قيد الحياة لرصد ومراقبةص تأثير وظيفة كوصي HdeB في الجسم الحي.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

والبيئة الطبيعية المشتركة التي مسببات الأمراض الميكروبية تجربة الظروف التي تتكشف البروتين الحمضية التي يسببها هي المعدة الثدييات (المدى درجة الحموضة 1-4)، التي تعد بمثابة حاجز فعال ضد مسببات الأمراض التي تنقلها الأغذية 1 الرقم الهيدروجيني الحمضية. البروتين تتكشف والتجميع، والذي كان سببه الجانب الأحماض الأمينية سلسلة بروتوناتيون، ويؤثر على العمليات الحيوية، والأضرار الهياكل الخلوية ويتسبب في نهاية المطاف موت الخلية 1،2. منذ الرقم الهيدروجيني للالجبلة المحيطية البكتيرية equilibrates على الفور تقريبا مع درجة الحموضة البيئية بسبب نشر خالية من البروتونات عبر الغشاء الخارجي يسهل اختراقها، بروتينات غشاء محيط بالجبلة والداخلية من البكتيريا سالبة الجرام هي المكونات الخلوية الأكثر ضعفا في ظل الظروف الحمضية من الإجهاد 3. لحماية بروتيوم محيط بالجبلة ضد الضرر بوساطة حمض السريع، والبكتيريا سالبة الجرام الاستفادة من المحرمين محيط بالجبلة تنشيط حمض HdeA وHdeB. HdeA هو كوصي المختلين مشروط 4،5: في الرقم الهيدروجيني محايدة، HdeA غير بوصفها و، ديمر-كوصي غير نشط مطوية. بناء على التحول درجة الحموضة أقل من الرقم الهيدروجيني 3، وظيفة كوصي HdeA وسرعان ما تنشيط 6،7. تفعيل HdeA يتطلب تغييرات عميقة الهيكلية، بما في ذلك الانفصال حيز أحادية، والجزئي تتكشف أحادية 6-8. بمجرد تفعيلها، HdeA ترتبط بالبروتين التي تتكشف في ظل الظروف الحمضية. ويمنع على نحو فعال التجميع على حد سواء خلال حضانة في انخفاض الرقم الهيدروجيني، وكذلك على تحييد الحموضة. لدى عودته إلى 7.0 درجة الحموضة، HdeA يسهل refolding من البروتينات عملائها بطريقة ATP مستقلة ويحول مرة أخرى إلى مثنوي، التشكل كوصي خاملا 9 منه. وبالمثل، كوصي HdeB مثلي والوصيفة-نشط أيضا في درجة الحموضة 7.0. على عكس HdeA، ومع ذلك، النشاط كوصي HdeB ويصل الحد الأقصى واضح في الرقم الهيدروجيني 4.0، الظروف التي لا تزال مطوية HdeB إلى حد كبير ومثنوي 10. وعلاوة على ذلك، مما خفض مركز دراسات الرقم الهيدروجينيوفاق لتثبيط HdeB. وتشير هذه النتائج أنه على الرغم من التماثل على نطاق واسع، HdeA وHdeB تختلف في طريقتهم في تفعيل وظيفي والسماح لهم لتغطية مجموعة ودرجة الحموضة واسع مع وظيفة كوصي الحمائية. واحد كوصي الأخرى التي تورطت في مقاومة الأحماض من E. القولونية هو Hsp31 حشوية، والذي يظهر على استقرار البروتينات العميل تكشفت حتى تتم استعادة الظروف محايدة. وضع دقيق للعمل Hsp31، ومع ذلك، ظلت غامضة 12. وبالنظر إلى أن البكتيريا ممرض للأمعاء أخرى مثل السالمونيلا تفتقر إلى الاوبرون hdeAB، فمن المحتمل جدا أن مرافقين محيط بالجبلة بعد مجهولين آخرين قد توجد التي تشارك في مقاومة الأحماض من هذه البكتيريا 11.

البروتوكولات المعروضة هنا تسمح لمراقبة النشاط كوصي تعتمد على درجة الحموضة من HdeB في التجارب المختبرية والحية 10 ويمكن تطبيقها للتحقيق مرافقين آخرينمثل Hsp31. بدلا من ذلك، شبكة معقدة من عوامل النسخ التي تتحكم في التعبير عن hdeAB من المحتمل أن يتم التحقيق من قبل في الجسم الحي الإجهاد الفحص. لتوصيف وظيفة كوصي من البروتينات في الجسم الحي، ويمكن تطبيقها على الاجهزة التجريبية المختلفة. طريق واحد هو تطبيق البروتين تتكشف ظروف الإجهاد وظاهريا تميز سلالات متحولة إما بإفراط عن الجينات في المصالح أو تحمل حذف هذا الجين. ويمكن إجراء دراسات البروتين لتحديد أي البروتينات لم يعد مجموع المباراتين تحت ظروف الإجهاد عندما كوصي هو الحاضر، أو تأثير كوصي على انزيم معين يمكن تحديده خلال ظروف الإجهاد باستخدام المقايسات الأنزيمية 14-16. في هذه الدراسة، اخترنا بإفراط HdeB في سلالة rpoH الحذف، التي تفتقر إلى الصدمة الحرارية عامل سيغما 32. RpoH تسيطر على التعبير عن كل E. كبير مرافقين القولونية وحذفها من المعروف أن زيادة السيناتورitivity لظروف الإجهاد البيئية التي تسبب البروتين تتكشف 15. تقرر في الجسم الحي النشاط كوصي من HdeB من خلال رصد قدرتها على قمع حساسية الرقم الهيدروجيني للسلالة Δ rpoH. وإجمالا، فإن البروتوكولات المعروضة هنا توفر نهج سريع ومباشر لوصف النشاط من كوصي الحمضية التي تنشط في المختبر وكذلك في سياق في الجسم الحي.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. التعبير وتنقية محيط بالجبلة HdeB

وأعرب عن HdeB في E. ملاحظة: خلايا القولونية إيواء البلازميد pTrc- hdeB 10، وتنقيته من الجبلة المحيطية على تحلل بوليميكسين.

  1. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها من E. خلايا القولونية إيواء البلازميد pTrc- hdeB 10 في 30 مل LB تحتوي على 200 ميكروغرام / مل الأمبيسلين (LB الأمبير). تطعيم أربعة 1 الثقافات L من LB الأمبير وتنمو لهم عند 37 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة حتى يتم التوصل إلى OD ل 600Nm من 0.7. ثم، إضافة 300 ميكرومتر IPTG للحث على التعبير عن HdeB وانخفاض درجة حرارة النمو إلى 30 درجة مئوية.
  2. بعد 5 ساعة التعبير البروتين عند 30 درجة مئوية، حصاد الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 8000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  3. غسل بيليه الخلية مع 100 مل العازلة ألف (50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وأجهزة الطرد المركزي الخلايا مرة أخرى في 8000 x ج لمدة 5 دقائق في 4 درجات مئوية.
  4. وفي وقت لاحق، و resuspendبيليه الخلية في 80 مل العازلة A، التي تحتوي على 1 ملغ / مل سلفات بوليميكسين. لتعطيل الفعال للغشاء الخارجي، وإثارة بلطف تعليق لمدة 1 ساعة على 4 درجات مئوية.
  5. لإزالة جزء حشوية والحطام الخلوي، الطرد المركزي تعليق لمدة 20 دقيقة في 15000 x ج في 4 درجات مئوية. وهذا يؤدي إلى ~ 60 مل طاف تحتوي على HdeB قابل للذوبان.
  6. Dialyze طاف التي تحتوي على مستخلص محيط بالجبلة بين عشية وضحاها ضد حجم 150X العازلة ب (20 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، و 0.5 ملي EDTA، ودرجة الحموضة 8.0) باستخدام غشاء غسيل الكلى مع 6 كيلو دالتون ميغاواط من قطع. تركيز البروتينات إلى 15 مل باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 3 كيلو دالتون. تصفية حل البروتين باستخدام فلتر 0.2 ميكرون المسام.
  7. تطبيق البروتين على عمود الصرف أنيون اللوني (حجم العمود 5 مل) التي تم معايرتها مع 5 أحجام العمود B العازلة مع معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة. مرة واحدة يتم تحميل البروتين على العمود، وغسل العمود مع العازلة B لمدة 10 دقيقة فيمعدل تدفق 2.5 مل / دقيقة. أزل HdeB مع الانحدار الخطي 0-0،5 M كلوريد الصوديوم في B العازلة على مدى فترة زمنية قدرها 50 دقيقة مع معدل تدفق 2.5 مل / دقيقة 6.
  8. تحديد الكسور التي تحتوي HdeB باستخدام 15٪ SDS-PAGE. مزيج 20 عينة ميكرولتر مع 5 ميكرولتر 5X خفض العازلة تحميل SDS. تحميل 10 ميكرولتر على جل وتشغيل العازلة في تريس، جليكاين (14.4 غرام / لتر الجلايسين، 2.9 جم / لتر تريس، 1 غرام / لتر دوديسيل كبريتات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.3). تشغيل هلام في 150 V حتى ترحيل الفرقة برموفينول بالقرب من الجزء السفلي من هلام (~ 45 دقيقة).
  9. تجمع كل الأجزاء HdeB التي تحتوي على، dialyze في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة تخزين HdeB (50 ملي تريس / حمض الهيدروكلوريك، و 200 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0)، وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 300 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 3 كيلو دالتون. تحديد تركيز HdeB في 280 نانومتر باستخدام انقراض معامل ε 280nm = 15595 م -1 سم -1. إعداد 100 مكل وخالية من فلاشزي وقسامات في النيتروجين السائل.
    ملاحظة: يمكن تخزين HdeB في -70 درجة مئوية لمدة 6 أشهر على الأقل.

2. الوصيفة آخر الفحص عن طريق حراريا تتكشف مالات هيدروجيناز (مليون درهم)

ملاحظة: تأثير HdeB تنقيته على تجميع تتكشف حراريا الخنازير نازعة مالات الميتوكوندريا (مليون درهم) في قيم الرقم الهيدروجيني مختلفة تم رصدها على النحو المبين أدناه. جميع التركيزات البروتين المدرجة تشير إلى تركيز مونومر.

  1. لإعداد مليون درهم، dialyze مليون درهم في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة C (50 ملي فوسفات البوتاسيوم، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 100 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 30 كيلو دالتون.
    ملاحظة: مطلوب غسيل الكلى الدقيق مليون درهم كما يتم تسليم مليون درهم كما محلول كبريتات الأمونيوم.
  2. لإزالة الركام، الطرد المركزي البروتين لمدة 20 دقيقة في 20000 x ج في 4 درجات مئوية. تحديد تركيز مليون درهم من قبل الامتصاصية في 280 نانومتر (ε <فرعية> 280 نانومتر = 7950 م -1 سم -1). تجهيز 50 مكل من مليون درهم وفلاش تجميد قسامات للتخزين.
  3. ضع 1 مل الكوارتز كوفيت إلى معمل مضان مجهزة درجة الحرارة للرقابة أصحاب العينة والنمام. تعيين السابق λ / م إلى 350 نانومتر.
  4. إضافة وحدات مناسبة من قبل تحسنت (43 ° C) عازلة D (150 ملي فوسفات البوتاسيوم، 150 مم كلوريد الصوديوم) في القيم المطلوبة درجة الحموضة (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0، ودرجة الحموضة 5.0) إلى كفيت ومجموعة درجة الحرارة في حامل كوفيت إلى 43 درجة مئوية. الحجم الكلي هو 1000 ميكرولتر.
  5. إضافة 12.5 ميكرومتر HdeB (أو بدلا من نفس الحجم من العازلة التخزين HdeB لمراقبة عازلة) إلى المخزن المؤقت، تليها إضافة مليون درهم 0.5 ميكرومتر. تبدأ رصد تشتت الضوء. احتضان رد فعل ل 360 ثانية للسماح كافية تتكشف مليون درهم.
  6. رفع درجة الحموضة إلى 7 بإضافة 0،16-0،34 حجم 2 M K غير مصقول 2 هبو 4 ومواصلة إعادةحبال تشتت الضوء على 440 ثانية أخرى.
  7. تعيين حد لتجميع مليون درهم التي يتم تسجيلها في غياب كوصي عند نقطة زمنية محددة بعد تحييد (هنا بعد 500 ثانية، وعندما لوحظ القصوى تشتت الضوء من مليون درهم) إلى 100٪. تطبيع النشاط HdeB إلى إشارة ضوئية تناثر مليون درهم في غياب HdeB في كل قيمة الرقم الهيدروجيني المشار إليها.

3. الكشف عن HdeB-LDH تشكيل مجمع كتبها التحليلية تنبيذ فائق (AUC)

ملاحظة: تم تنفيذ الترسيب التجارب سرعة HdeB وحدها أو في المجمع مع تتكشف حراريا نازعة اكتات (LDH) باستخدام نابذة التحليلية.

  1. لإعداد LDH، dialyze LDH في 4 درجات مئوية خلال الليل ضد 4 لتر عازلة C (50 ملي فوسفات البوتاسيوم، 50 مم كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.5) وتركيز البروتين إلى ما يقرب من 200 ميكرومتر باستخدام وحدات تصفية الطرد المركزي مع الوزن الجزيئي قطع من 30 كيلو دالتون.
    ملاحظة: مطلوب غسيل الكلى الدقيق لرابطة حقوق الإنسان كما LDيتم تسليم H كما محلول كبريتات الأمونيوم.
  2. لإزالة الركام، الطرد المركزي LDH لمدة 20 دقيقة في 20000 x ج في 4 درجات مئوية. تحديد تركيز رابطة حقوق الإنسان من قبل الامتصاصية في 280 نانومتر (النانومتر = ε 280 43680 م -1 سم -1). تجهيز 50 مكل من LDH وفلاش تجميد قسامات للتخزين.
  3. احتضان 3 LDH ميكرومتر في حضور وغياب HdeB 30 ميكرومتر في المخزن D (درجة الحموضة 4 و 7، على التوالي) لمدة 15 دقيقة في 41 درجة مئوية.
    ملاحظة: الحضانة من رابطة حقوق الإنسان في أعلى نتائج درجات الحرارة في تجميع التام، وليس له تأثير كوصي من HdeB يمكن ملاحظتها.
  4. السماح للعينات يبرد إلى درجة حرارة الغرفة. ثم، وعينات من الحمل إلى الخلايا التي تحتوي على قطاع معيار شكل المركزية 2-قناة مع 1.2 سم طول المسار. تحميل الخلايا في نابذة وتتوازن إلى 22 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 1 ساعة قبل الترسيب.
  5. عينات تدور عند 22 درجة مئوية و 167000 x ج في الدوار منهما لمدة 12 ساعة، ورصد الحوار الاقتصادي الاستراتيجيimentation من البروتين بشكل مستمر عند 280 نانومتر. كما هو موضح سابقا، يتم تحسين إشارة إلى نسبة الضوضاء عندما يتم قياس شدة الضوء ينتقل من كل قناة بدلا من الامتصاصية. هذا أيضا يحسن نوعية تركيب البيانات لاحقا.
  6. إجراء تحليل البيانات مع SEDFIT (الإصدار 15.01b، ديسمبر 2015)، وذلك باستخدام نموذج توزيع ج مستمرة (ق) 17. وهناك أمثلة توضيحية تصف كيفية استخدام SEDFIT يمكن العثور في اشارة 18.
    1. تعيين مستوى الثقة لتسوية ME (الحد الأقصى الانتروبيا) إلى 0.7.
  7. حساب كثافة عازلة وكذلك اللزوجة باستخدام SEDNTERP 19. لتقدير كمية البروتين العميل مجمعة، مقارنة تكاملات LDH الرسوبية في درجة الحموضة 4 إلى الرقم الهيدروجيني 7 كمرجع.
    ملاحظة: دمج المؤامرات توزيع الترسيب يمكن القيام به مباشرة في SEDFIT. برنامج بديل لتحليل البيانات سرعة الترسيب يمكن العثور عليها في استعراض حديث 20.

4. رصد مليون درهم التعطيل وإعادة تنشيط في وجود HdeB

ملاحظة: تأثير HdeB تنقيته على refolding من درجة الحموضة تكشفت مليون درهم تم تحديدها من قبل رصد نشاط مليون درهم على التعادل.

  1. احتضان 1 مليون درهم ميكرومتر في المخزن D في القيم المطلوبة درجة الحموضة (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0، ودرجة الحموضة 5.0) لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية في ظل غياب أو وجود 25 ميكرومتر HdeB. ثم، تحول درجة الحرارة إلى 20 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
    ملاحظة: لم يلاحظ وجود refolding مليون درهم حتى في وجود HdeB عندما حضنت مليون درهم في درجات حرارة أعلى من 37 درجة مئوية.
  2. لبدء refolding من حمض مليون درهم التشويه والتحريف، تحييد عينات لدرجة الحموضة 7 بإضافة 0،13-0،42 حجم 0.5 M فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0.
  3. بعد مرور فترة الحضانة لمدة 2 ساعة على 20 درجة مئوية، وتحديد النشاط مليون درهم من خلال رصد انخفاض NADH في 340 نانومتر 9.
    ملاحظة: مليون درهم يحفز تخفيض تعتمد على NADH من أوكسالوآسيتات إلى L-مالات.
  4. مزيج 50 ميكرولتر من رد فعل الحضانة مع 950 ميكرولتر من العازلة الفحص (50 ملي فوسفات الصوديوم، ودرجة الحموضة 8.0، أوكسالوآسيتات 1 ملم، و 150 ميكرومتر NADH).
    ملاحظة: يجب أن يكون تركيز النهائي من مليون درهم في المخزن المؤقت فحص 44 نانومتر.
  5. مراقبة التغير في الامتصاصية باستخدام مقياس الطيف الضوئي، ومجهزة كتلة بلتيير التحكم في درجة الحرارة المحددة إلى 20 درجة مئوية.
  6. عن النشاط مليون درهم مقارنة 44 نانومتر الأصلي مليون درهم التي تم الاحتفاظ بها في درجة الحموضة 7.0.

5. تأثير HdeB Overexpression على E. القولونية البقاء على قيد الحياة تحت الإجهاد حمض

ملاحظة: E. تم عزل كولاي MG1655 الجينومية الحمض النووي باستخدام بروتوكول نشر 21.

  1. تضخيم hdeB من E. القولونية MG1655 بواسطة PCR باستخدام بادئات hdeB - BamH I-مراجعة GGT GGT CTG GGA TCC TTA ATT CGG الجهاز المركزي للمحاسبات GTC ATT وhdeB - ECOR I-مهاجم GGT دول مجلس التعاون الخليجي غا عقاري AGG AGG CGC ATG AAT ATT TCA تكت لجنة مكافحة الإرهاب C.
  2. إعداد تفاعل PCR في 50 ميكرولتر على النحو التالي: 10 ميكرولتر 5X العازلة البلمرة، و 200 ميكرومتر dNTPs، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي JUD2، و 0.5 ميكرومتر التمهيدي JUD5، 150 نانوغرام الجيني MG1655 الحمض النووي، و 0.5 ميكرولتر بوليميريز الحمض النووي، إضافة ده 2 O 50 ميكرولتر.
  3. أداء التضخيم من hdeB على النحو التالي: الخطوة 1: 5 دقائق في درجة حرارة 95 درجة مئوية، و1 دورة. خطوة 2: 30 ثانية في 95 درجة مئوية، و 30 ثانية في 55 درجة مئوية، و 30 ثانية في 72 درجة مئوية، 40 دورة. خطوة 3: 10 دقيقة عند 72 درجة مئوية.
  4. استنساخ الناتجة PCR جزء في مواقع ECOR الأول وBamH أنا البلازميد pBAD18 باستخدام الطرق القياسية لاستنساخ الموقع قيود. تنقية البلازميد باستخدام طقم تنقية البلازميد وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحقق من البلازميد الناجم عن تسلسل 10.
  5. تحويل البلازميد معربا عن HdeB أو فارغة pBAD18 مكافحة ناقلات الأمراض في BB7224 سلالة (Δ rpoH) (النمط الجيني: F - λ -، E14 - [araD139] ب / ص [6؛ (صندوق الفرعي لاك) 169 flhD5301 Δ (fruK-yeiR) 725 (fruA25) relA1 rpsL150 (ن خ ص) rbsR22 Δ (fimB-FIME) 632 (:: IS1) ptsF25 zhf :: تينيسي 10 (ح S) suhX401 deoC1 اراد + rpoH :: اساسه + و 16) باستخدام الخلايا المختصة كيميائيا.
    ملاحظة: هذه السلالة هي حساسة للحرارة.
  6. بعد 45 ثانية الحرارة صدمة في 42 درجة مئوية، وقبل والطلاء، واحتضان الخلايا عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة. أداء واحدة مستعمرة خط الرافضة من الحيوانات المستنسخة الإيجابية واحتضان بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. إعداد الثقافة بين عشية وضحاها في 50 مل LB الأمبير وزراعة الخلايا في 200 دورة في الدقيقة و 30 درجة مئوية.
  7. تمييع الثقافات بين عشية وضحاها من 40 أضعاف إلى 25 مل LB الأمبير وتنمو البكتيريا في وجود 0.5٪ الارابينوز (آرا) عند 30 درجة مئوية و 200 دورة في الدقيقة لل 600Nm OD = 1.0 للحث على التعبير البروتين HdeB.
  8. لتجارب التحول درجة الحموضة، واستخدام LBأمبير + آرا لتمييع الخلايا لل 600Nm OD من 0.5 والتكيف مع القيم الخاصة الرقم الهيدروجيني (هنا: الرقم الهيدروجيني 2.0، ودرجة الحموضة 3.0، ودرجة الحموضة 4.0) وذلك بإضافة كميات مناسبة من 5 M حمض الهيدروكلوريك.
  9. بعد النقاط الزمنية المشار إليها (درجة الحموضة 2، 1 دقيقة، الرقم الهيدروجيني 3، 2.5 دقيقة، الرقم الهيدروجيني 4، 30 دقيقة)، تحييد الحضارات إضافة كميات مناسبة من 5 M هيدروكسيد الصوديوم.
  10. مراقبة نمو الثقافات تحييد في ثقافة السائل لمدة 12 ساعة على 30 درجة مئوية باستخدام القياسات OD.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

HdeA وHdeB هي مثلي E. البروتينات القولونية، والمعروف لحماية البروتينات محيط بالجبلة ضد ظروف الإجهاد الحمضية 10. كشفت عملنا التي تشبه إلى HdeA، HdeB يعمل أيضا تنشيط حمض كوصي الجزيئية. ومع ذلك، وعلى النقيض من وظائف HdeA، HdeB في الرقم الهيدروجيني التي لا تزال محتملة للجراثيم، ولكن أعلى بكثير من الحد الأمثل الرقم الهيدروجيني للHdeA 6،9،10،22. للتحقيق في الأمثل الرقم الهيدروجيني من النشاط كوصي HdeB في المختبر...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

من أجل دراسة آلية تفعيل وظيفة كوصي من HdeB، كميات كبيرة من HdeB يجب أن تكون أعرب وتنقيته. تتوفر لإنتاج مستويات عالية من بروتين الهدف، بما في ذلك pTrc أو pBAD ناقلات، وكلاهما المستخدمة في هذه الدراسة عدد من أنظمة ناقلات التعبير. المروجين يمكن الوصول إليها بسهولة لE. القولونية البلمرة RNA، وبالتالي تسمح upregulated بقوة تعبيرا عن HdeB في أي E. سلالة القولونية. هذا الجانب أهمية خاصة في الجسم الحي دراسة overexpression من HdeB تحت ظروف الإجهاد ...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورة كلوديا كريمرز لها النصيحة مفيدة على المقايسات كوصي. واعترف كين وان للحصول على المساعدة الفنية له في تنقية HdeB. وأيد هذا العمل من قبل معهد هوارد هيوز الطبي (لJCAB) والمعاهد الوطنية للصحة منح RO1 GM102829 إلى JCAB وUJJ-UD يدعمها زمالة أبحاث ما بعد الدكتوراه المقدمة من مؤسسة البحوث الألمانية (DFG).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
NEB10-beta E. القولوني< / em> خلايانيو إنجلاند بيولابيسC3019I
أمبيسيلينالذهب التكنولوجيا الحيويةA-301-3
رطل مزيج المرق ، لينوكسلاب اكسبرس3003
IPTGالذهب التكنولوجيا الحيويةI2481C50
كلوريد الصوديومفيشر ScientificS271-10
تريسأمريسكو0826-5 كجم
EDTAفيشر العلميBP120-500
كبريتات بوليميكسين ب  شركة ICN Biomedicals Inc.100565
0.2 ومايكرو ؛ فلتر حقنة مساممعقمة كورنينج431218
HiTrap Q HP (CV 5 مل)GE Healthcare Life Sciences17-1153-01
Mini-Protean TGX ، 15٪Bio-Rad4561046
نازعة هيدروجين مالات (MDH)روش10127914001
فوسفات البوتاسيوم (أحادي القاعدة)فيشر ScientificBP362-500
بوتاسيوم فوسفات (ثنائي الحجم)فيشر ScientificBP363-1
F-4500 مقياس الطيف الضوئي الفلوريهيتاشيFL25
OxaloacetateSigmaO4126-5G
NADHSigma & nbsp ؛N8129-100MG
فوسفات الصوديوم أحادي القاعدةSigma S9390-2.5KG
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدةسيجما   ؛S397-500
نازعة هيدروجين اللاكتات (LDH)Roche10127230001
Beckman Proteome Lab XL-I الطرد المركزي التحليلي BeckmanCoulter392764< / a>
المركزية ، 12 مم ، Beckman Coulter المملوء بالفحممن إيبون 306493
AN-50 Ti Rotor ، تحليلي ، معالجبيكمان كولتر 363782
بلس Miniprep KitPromegaA1470يستخدم لتنقية البلازميد (البروتوكول 5.1)
L-arabinoseGold BiotechnologyA-300-500
GlycineDOT Scientific IncDSG36050-1000
كوفيت خلية مضانHellma Analytics119004F-10-40
قليل النوكليوتيداتInvitrogen
Phusion بوليميراز الحمض النووي عالي الدقةنيو إنجلاند BiolabsM0530S
dNTP مجموعةInvitrogen10297018
حمض الهيدروكلوريكفيشر ScientificA144-212
هيدروكسيد الصوديومفيشر ScientificBP359-500
Amicon Ultra 15 مل 3K NMWLMilliporeUFC900324
جهاز طرد مركزي Avanti J-26XPIBeckman Coulter393127
Varian Cary 50 مقياس الطيف الضوئيAgilent Tech
Spectra / Por 1 غشاء غسيل الكلى MWCO: 6 كيلو دالتونمختبرات الطيف132650
وحدات تصفية الطرد المركزي Amicon Ultra 30KMilliporeUFC803024
SDSفيشر العلميbp166-500
فيريتي 96 بئر الحرارية الدراجةالحرارية ثيرمو فيشر4375786

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Smith, J. L. The Role of Gastric Acid in Preventing Foodborne Disease and How Bacteria Overcome Acid Conditions. J Food Protect. 66, 1292-1303 (2003).
  2. Hong, W., Wu, Y. E., Fu, X., Chang, Z. Chaperone-dependent mechanisms for acid resistance in enteric bacteria. Trends Microbiol. 20 (7), 328-335 (2012).
  3. Koebnik, R., Locher, K. P., Van Gelder, P. Structure and function of bacterial outer membrane proteins: barrels in a nutshell. Mol Microbiol. 37, 239-253 (2000).
  4. Reichmann, D., Xu, Y., et al. Order out of Disorder: Working Cycle of an Intrinsically Unfolded Chaperone. Cell. 148 (5), 947-957 (2012).
  5. Bardwell, J. C. A., Jakob, U. Conditional disorder in chaperone action. Trends Biochem Sci. 37 (12), 517-525 (2012).
  6. Tapley, T. L., Korner, J. L., et al. Structural plasticity of an acid-activated chaperone allows promiscuous substrate binding. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (14), 5557-5562 (2009).
  7. Hong, W., Jiao, W., et al. Periplasmic Protein HdeA Exhibits Chaperone-like Activity Exclusively within Stomach pH Range by Transforming into Disordered Conformation. J Biol Chem. 280 (29), 27029-27034 (2005).
  8. Zhang, B. W., Brunetti, L., Brooks, C. L. III Probing pH-Dependent Dissociation of HdeA Dimers. J Am Chem Soc. 133, 19393-19398 (2011).
  9. Tapley, T. L., Franzmann, T. M., Chakraborty, S., Jakob, U., Bardwell, J. C. A. Protein refolding by pH-triggered chaperone binding and release. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (3), 1071-1076 (2010).
  10. Dahl, J. -U., Koldewey, P., Salmon, L., Horowitz, S., Bardwell, J. C. A., Jakob, U. HdeB Functions as an Acid-protective Chaperone in Bacteria. J Biol Chem. 290 (1), 65-75 (2015).
  11. Waterman, S. R., Small, P. L. C. Identification of sigmas-dependent genes associated with the stationary-phase acid-resistance phenotype of Shigella flexneri. Mol Microbiol. 21 (5), 925-940 (1996).
  12. Mucacic, M., Baneyx, F. Chaperone Hsp31 Contributes to Acid Resistance in Stationary-Phase Escherichia coli. Appl Environ Microbiol. 73 (3), 1014-1018 (2007).
  13. Daugherty, D. L., Rozema, D., Hanson, P. E., Gellman, S. H. Artificial Chaperone-assisted Refolding of Citrate Synthase. J Biol Chem. 273, 33961-33971 (1998).
  14. Jakob, U., Muse, W., Eser, M., Bardwell, J. C. A. Chaperone Activity with a Redox Switch. Cell. 96 (3), 341-352 (1999).
  15. Guisbert, E., Yura, T., Rhodius, V. A., Gross, C. A. Convergence of Molecular, Modeling, and Systems Approaches for an Understanding of the Escherichia coli Heat Shock Response. Microbiol Mol Biol Rev. 72 (3), 545-554 (2008).
  16. Tomoyasu, T., Mogk, A., Langen, H., Goloubinoff, P., Bukau, B. Genetic dissection of the roles of chaperones and proteases in protein folding and degradation in the Escherichia coli cytosol. Mol Microbiol. 40 (2), 397-413 (2001).
  17. Schuck, P. Size-Distribution Analysis of Macromolecules by Sedimentation Velocity Ultracentrifugation and Lamm Equation Modeling. Biophys J. 78 (3), 1606-1619 (2000).
  18. Analytical ultracentrifugation direct boundary modeling with sedfit. analyticalultracentrifugation.com. , Available from: http://www.analyticalultracentrifugation.com/default.htm (2016).
  19. Sednterp. bitcwiki.sr.unh.edu. , Available from: http://bitcwiki.sr.unh.edu/index.php/Main_Page (2012).
  20. Patel, T. R., Winzor, D. J., Scott, D. J. Analytical ultracentrifugation: A versatile tool for the characterisation of macromolecular complexes in solution. Methods. 95, 55-61 (2016).
  21. Sambrook, J., Russell, D. W. Purification of Nucleic Acids by Extraction with Phenol:Chloroform. Cold Spring Harb Protoc. 2006, (2006).
  22. Foit, L., George, J. S., Zhang, B. inW., Brooks, C. L., Bardwell, J. C. A. Chaperone activation by unfolding. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 1254-1262 (2013).
  23. Nicoll, W. S., Boshoff, A., Ludewig, M. H., Hennessy, F., Jung, M., Blatch, G. L. Approaches to the isolation and characterization of molecular chaperones. Protein Express Purif. 46, 1-15 (2006).
  24. Minami, Y., Hohfeld, J., Ohtsuka, K., Hartl, F. U. Regulation of the Heat-shock Protein 70 Reaction Cycle by the Mammalian DnaJ Homolog, Hsp40. J Biol Chem. 271 (32), 19617-19624 (1996).
  25. Quan, S., Koldewey, P. Genetic selection designed to stabilize proteins uncovers a chaperone called Spy. Nat Struct Mol Biol. 18, 262-269 (2011).
  26. Gray, M. J., Wholey, W. Y. Polyphosphate Is a Primordial Chaperone. Mol Cell. 53 (5), 689-699 (2014).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

HdeB

مقالات ذات صلة