مقالة منهجية

إنتاج الخلايا الجذعية المحفزة من الفأر الأمنيوسي الخلايا السوائل عن طريق نظام ينقول

6.6K مشاهدات

⸱

DOI:

10.3791/54598

⸱

فبراير 28, 2017

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Stem Cell and Regenerative Medicine Laboratory, Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Citta della Speranza, 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 3Stem Cells and Regenerative Medicine Section, Developmental Biology and Cancer Programme, UCL Institute of Child Health and Great Ormond Street Hospital

في هذه المقالة

ملخص

في هذه الدراسة ، نقوم بإنشاء خلايا جذعية مستحثة متعددة القدرات من خلايا السائل الأمنيوسي للفأر ، باستخدام نظام ينقولات غير فيروسيا.

الملخص

يتم إنشاء الخلايا الجذعية المستحثة متعددة القدرات (iPS) من الخلايا الجسدية للفأر والإنسان عن طريق التعبير القسري عن عوامل النسخ المحددة باستخدام طرق مختلفة. هنا ، أنتجنا خلايا iPS من خلايا السائل الأمنيوسي للفأر ، باستخدام نظام ينقولات غير فيروسية. أظهرت جميع خطوط خلايا iPS التي تم الحصول عليها خصائص الخلايا متعددة القدرات ، بما في ذلك القدرة على التمايز نحو مشتقات جميع الطبقات الجرثومية الثلاث في المختبر وفي الجسم الحي. تفتح هذه الاستراتيجية إمكانية استخدام خلايا الأجنة المريضة لتطوير علاجات جديدة للعيوب الخلقية.

المقدمة

التشخيص قبل الولادة هو أداة هامة السريرية لتقييم أمراض وراثية (أي التشوهات الكروموسومية والأمراض monogenetic أو polygenetic / سياقاتها) والتشوهات الخلقية (فتق الحجاب الحاجز الخلقي أي، آفات الرئة الكيسي، فتق سرري، انشقاق البطن الخلقي). السائل الذي يحيط بالجنين (AF) الخلايا هي بسيطة للحصول عليه من إجراءات المقرر بشكل روتيني خلال الثلث الثاني من الحمل (أي بزل السلى وamnioreduction) أو العمليات القيصرية 1 و 2. توافر خلايا AF من المرضى قبل الولادة وحديثي الولادة يوفر إمكانية استخدام هذا المصدر للطب التجديدي، والتحقيق في العديد من الباحثين إمكانية لعلاج الأضرار الأنسجة المختلفة أو الأمراض باستخدام السكان الخلايا الجذعية المعزولة من AF 3، 4، 5، 6، 7، 8، 9، 10، 11، 12. إمكانية الحصول بسهولة خلايا AF من المرضى المريضة، في إطار الوقت الذي المرض غالبا ما يكون ثابتا، يفتح الطريق أمام فكرة استخدام هذا المصدر خلية لأغراض إعادة برمجة. في الواقع، الناجم الجذعية المحفزة (آي بي إس) الخلايا المشتقة من الخلايا AF يمكن أن تكون متباينة في خلايا الفائدة للفي المختبر لاختبار المخدرات أو نهج هندسة الأنسجة، من أجل إعداد العلاج المناسب المريض محددة قبل الولادة. وقد أظهرت العديد من الدراسات بالفعل قدرة الخلايا AF إلى إعادة برمجة ومتباينة في مجموعة واسعة من أنواع الخلايا 13، 14، 15، 16، 17 </ سوب>، 18، 19، 20، 21، 22، 23، 24، 25، 26، 27.

منذ اكتشاف تاكاهاشي وياماناكا 28 من الخلايا الجسدية إعادة برمجة من خلال التعبير القسري لأربعة عوامل النسخ (Oct4، Sox2، cMyc وKlf4)، أحرز تقدم في مجال إعادة برمجة. النظر في طرق مختلفة، يمكننا أن نميز بين النهج الفيروسية وغير الفيروسية. أول تتوقع استخدام ناقلات فيروسية (الفيروسات القهقرية وlentiviruses)، التي لديها كفاءة عالية ولكن إسكات عادة ناقصة من التحوير فيروسات، مع كل ما يترتب من خط الخلايا المعاد برمجتها جزئيا وخطرالطفرات 29، 30، 31 إقحامي. يستخدم الأسلوب غير الفيروسية استراتيجيات مختلفة: البلازميدات أي ناقلات، مرنا والبروتين والترانسبوزونات. ويهدف اشتقاق خلايا الجذع خالية من متواليات المعدلة وراثيا للالتفاف على الآثار الضارة المحتملة من التعبير التحوير المتسرب والطفرات إقحامي. ومن بين جميع الاستراتيجيات غير الفيروسية المذكورة أعلاه، وPiggyBac (PB) نظام ينقول / ترانسبوزاز يتطلب فقط يكرر محطة مقلوب المرافقة التحوير والتعبير عابرة للانزيم ترانسبوزاز لتحفيز الإدراج أو الختان أحداث 32. ميزة في استخدام الترانسبوزونات على الطرق الأخرى لتوليد خلايا الجذع هي إمكانية الحصول على خلايا الجذع خالية من ناقلات مع نهج ناقلات غير الفيروسية التي تظهر بنفس الكفاءة ناقلات فيروسات. وهذا ممكن عن طريق الاستئصال أقل أثر للترميز ينقول متكامل لreprogramming العوامل التالية تعبير عابر الجديد للترانسبوزاز في خلايا الجذع 33. وبالنظر إلى أن PB غير فعالة في مختلف أنواع الخلايا 34، 35، 36، 37، هو أكثر ملاءمة للنهج السريرية فيما يتعلق النواقل الفيروسية، ويسمح لإنتاج خلايا الجذع خالية من XENO يتعارض مع بروتوكولات إنتاج الفيروسية الحالية التي تستخدم أجنبي بيولوجيا الشروط، يتم استخدام هذا النظام للحصول على خلايا الجذع من الفئران AF.

نحن هنا اقتراح بروتوكول مفصلة بعد العمل التي سبق نشرها لإظهار إنتاج الحيوانات المستنسخة الجذع المحفزة من خلايا AF الماوس (خلايا الجذع-AF) 38.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

وكانت جميع الإجراءات وفقا للقانون الإيطالي. تم حصادها عينات الفئران AF من الفئران الحوامل بنسبة 13.5 في أيام تال للجماع (DPC) من C57BL / 6-TG (UBC-GFP) 30Scha / J الفئران دعا GFP.

الإنتاج 1. ينقول

ملاحظة: تم إنشاؤها ناقلات التعبير ينقول باستخدام إجراءات الاستنساخ القياسية. تم إعداد البلازميد فأرة الحاسوب AF خلايا ترنسفكأيشن باستخدام مجموعات تجارية.

  1. مزيج 10 نانوغرام من البلازميد مع 50 ميكرولتر من البكتيريا DH5α في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. احتضان أنبوب microcentrifuge على الجليد لمدة 20 دقيقة.
  2. الصدمة الحرارية في درجة حرارة 42 درجة مئوية لمدة 40 ثانية.
  3. وضع أنبوب microcentrifuge على الجليد لمدة 2 دقيقة.
  4. إضافة 250 ميكرولتر من قبل تحسنت (37 ° C) مرق استذابة مرق (LB). تهز (300 دورة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
  5. نشر 30 ميكرولتر من كل تحول على لوحات LB مع 0.1 ملغ / مل الأمبيسلين. السماح لوحات لتجف واحتضان مقلوب عند 37 درجة مئوية اوفernight.
  6. في اليوم التالي، في فترة ما بعد الظهر، واختيار 3 المستعمرات، وذلك باستخدام معقم 200 نصائح ميكرولتر من كل تحول ونقل على 0.1 ملغ / مل LB أمبير.
  7. تهز (300 دورة في الدقيقة) البكتيريا بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية.
  8. لتنقية البلازميد استخدام مجموعات تجارية. البلازميدات السهم عند -20 درجة مئوية.

2. الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEF) الثقافة

  1. طلاء لوحات 6 بشكل جيد مع 0.1٪ الجيلاتين
    1. لوحات معطف تحت غطاء محرك السيارة بإضافة 1 مل من العقيمة الجيلاتين 0.1٪ إلى كل من الآبار الستة. دع الجيلاتين تتبلمر في الحاضنة (37 درجة مئوية) لمدة 1 ساعة.
    2. تجاهل الزائدة، وتجف لوحات لمدة 1 ساعة.
    3. استخدام بارافيلم لاغلاق ووحات تخزينها في درجة حرارة الغرفة.
  2. تثبيط MEF مع ميتوميسين C
    1. ذوبان الجليد قارورة من 4 × 10 6 خلايا MEF باستخدام C حمام 37 درجة.
    2. البذور MEF في غطاء محرك السيارة على طبق بيتري (150 ملم) مع المتوسط ​​MEF.
    3. زراعة خلايا في 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2.
    4. (تنبيه) إضافة ميتوميسين C (5 ملغ / مل) عندما الخلايا متموجة.
    5. مكان الخلايا في حاضنة (37 درجة مئوية و 5٪ CO 2) لمدة 3 ساعات.
    6. إزالة المتوسطة مع خلايا ميتوميسين جيم غسل ثلاث مرات مع المياه المالحة عازلة 1X الفوسفات (PBS).
    7. إضافة 2 مل من الخلايا التربسين ومكان التجارية في الحاضنة 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق. بعد إضافة 18 مل من عرقلة المتوسطة لوقف رد الفعل التربسين.
    8. عد الخلايا باستخدام غرفة burker وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.
    9. خلايا الطرد المركزي في 145 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف.
    10. البذور 60000 خلية / سم 2 من المعطل MEF على 0.1٪ الجيلاتين المغلفة لوحات.
    11. زراعة الخلايا لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية و CO 2 5٪، قبل البذر AF و / أو خلايا الجذع-AF.

3. ماوس AF عزل الخلايا

  1. إعداد التزاوج في الوقت المناسب وتحقق PLU المهبلع بعد 24 ساعة من شارك في السكن.
  2. بمراعاتها حتى 13.5 DPC والتضحية السد حامل عن طريق خلع عنق الرحم.
  3. تنظيف جدار البطن للحيوان باستخدام الايثانول 70٪.
  4. باستخدام مقص، تنفيذ البطن خط الوسط عمل قطع في طول جدار البطن للوصول إلى تجويف البطن.
  5. فضح الرحم باستخدام ملقط. إزالة الرحم باستخدام مقص ونقل إلى صحن 100 ملم بيتري مليئة العقيمة وضعت برنامج تلفزيوني 1X على الجليد.
  6. استخدام مجهر تشريحي لجمع AF في 10X التكبير.
  7. عقد الرحم مع ملقط وإزالة جدار الرحم مع مقص. كن حذرا لتجنب أي ضرر للأغشية الجنين ويترتب على ذلك تسرب السائل الذي يحيط بالجنين.
  8. جمع الأجنة في صحن 100 ملم بيتري مليئة العقيمة برنامج تلفزيوني 1X ووضع على الجليد.
  9. فهم المشيمة الجنين واحد مع ملقط غرامة نقطة ومكان في 100 مم طبق بيتري نظيفة.
  10. إزالة الكيس المحي باستخدام ملقط غرامة نقطة.
    11. تعطيل السلى باستخدام ملقط غرامة نقطة وجمع 30 ميكرولتر من AF لكل الجنين باستخدام حقنة الانسولين الى 15 مل قارورة المخروطية.
  11. بعد جمع AF، وغسل كل جنين مع العقيمة برنامج تلفزيوني 1X تستكمل مع 1٪ مصل بقري جنيني (FBS) وجمع في 15 مل أنبوب مخروطي يحتوي على AF.
  12. الطرد المركزي AF في 145 x ج لمدة 5 دقائق. إزالة طاف تحت غطاء محرك السيارة والبذور الخلايا AF مكعبات.

زراعة الخلايا 4. ماوس AF

  1. بذر خلايا الفأر AF
    1. قبل يوم واحد من البذر، وإعداد 0.1٪ الجيلاتين المغلفة لوحة 6 جيدا مع MEF تعامل C-ميتوميسين.
    2. بعد جمع AF، البذور الخلايا التي تم الحصول عليها من بزل السلى (حوالي 1 × 10 7 خلايا التي تم الحصول عليها من الأجنة 6) على MEF المعطل ميتوتيكلي باستخدام AF مستنبت.
    3. زراعة خلايا في 37 درجة مئوية و CO 2 5٪، وتغيير المتوسط كل يوم.
    4. بعد 7 أيام من الثقافة، عبرخلايا fect AF باتباع الإجراء هو موضح أدناه.

5. ترنسفكأيشن، IPS-AF الجيل خلية والثقافة

و transfected خلايا الفأر AF مع ينقول البلازميد PB-tetO2-IRES-OKMS، جنبا إلى جنب مع البلازميد التعبير ترانسبوزاز (mPBase) ومع transactivator التتراسيكلين العكسية (PB-CAG-rtTA) البلازميد ينقول: ملاحظة. وتم تزويد جميع البلازميدات البروفيسور أندراس ناجي 33.

  1. مزيج 1 ميكروغرام من PB-tetO2-IRES-OKMS مع 0.5 ميكروغرام من mPBase و 0.5 ميكروغرام من PB-CAG-rtTA (عدد الحمض النووي: 2 ميكروغرام) في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل.
  2. تمييع DNA إلى 100 ميكرولتر مع المصل خالية المتوسطة (Dulbecco لتعديل النسر متوسطة - DMEM).
  3. إضافة 8 ميكرولتر من كاشف ترنسفكأيشن (على سبيل المثال، FUGENE) (في نسبة البلازميد: وكيل ترنسفكأيشن من 2 ميكروغرام (DNA) إلى 8 ميكرولتر وكيل ترنسفكأيشن) في 1.5 مل أنبوب microcentrifuge تحتوي على الحمض النووي.
  4. احتضان ترنسفكأيشن خليط كاشف / الحمض النووي لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  5. إضافة قطرة قطرة 100 ميكرولتر من خليط ترنسفكأيشن الكاشف / الحمض النووي لكل بئر لوحة 6 جيدا مع خلايا AF الماوس وتوزيعها من قبل يحوم طيف، مع الحجم النهائي من 2 مل / جيد. يترك لمدة 24 ساعة.
  6. في اليوم التالي، حمل التعبير عن العوامل ياماناكا في (Oct4، Klf4، cMyc، Sox2) عن طريق تغذية الخلايا مع المتوسط ​​الطازجة IPS-AF تستكمل مع 1.5 ميكروغرام / مل من الدوكسيسيكلين (2 مل من وسائل الإعلام لكل بئر).
  7. تغذية الخلايا كل يوم، دون مرور، مع المتوسطة التي تحتوي على دوكس جديدة (الحفاظ على خلايا في وسائل الإعلام تستكمل مع الدوكسيسيكلين حتى نقطة 5.13).
  8. مراقبة الخلايا خلال 24 ساعة للتعبير عن mCherry ويوميا لتشكيل مستعمرة (تظهر المستعمرات عادة بين 20 و 30 يوما بعد ترنسفكأيشن).
  9. قبل يوم واحد قطف مستعمرة، وإعداد لوحة 96-جيدا زراعة الأنسجة مع MEF تعامل C-ميتوميسين.
  10. اختيار المستعمرات واحد في 50 ميكرولتر من حجم النقيبالجا 200 ميكرولتر ماصة، ونقلها بالتتابع في لوحة 96-جيدا في الآبار الفردية.
  11. في اليوم التالي، تنأى كل مستعمرة في الخلايا واحد عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من التربسين التجاري واحتضان لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية.
  12. ماصة صعودا وهبوطا إلى تفصيل مستعمرة.
  13. نقل 50 ميكرولتر من التربسين التي تحتوي على مستعمرة فصلها في بئر جديد مع المعطل MEF على الجيلاتين 0.1٪ المغلفة 96 جيدا لوحة مليئة 100 ميكرولتر من الطازجة المتوسطة الجذع-AF تستكمل مع الدوكسيسيكلين.
  14. عندما تصل خلايا 60-70٪ التقاء، تقسيم في بئر من 24 لوحة جيدا.
  15. عندما تصل خلايا 60-70٪ التقاء، وتقسيم 1: 2 لبئرين، واحدة مع الدوكسيسيكلين والآخر دون الدوكسيسيكلين، للتحقق من ظهور المستعمرات أيضا في حالة دون الدوكسيسيكلين.
  16. الاستمرار في الحفاظ على استنساخ الجذع-AF، الدوكسيسيكلين مستقل، على المعطل MEF في المتوسط ​​IPS-AF.
  17. زراعة خلايا في 37 درجة مئوية و CO 2، 5٪ الفصلanging المتوسط ​​يوميا.

6. الفوسفاتيز القلوية تلطيخ

  1. أداء القلوية تلطيخ الفوسفاتيز التالية بروتوكول الشركة المصنعة كلما كان هناك ظهور الدوكسيسيكلين خلايا الجذع-AF مستقلة.

7. المناعي

  1. كلما كان هناك ظهور الدوكسيسيكلين خلايا مستقلة IPS-AF، البذور 150000 خلية / سم 2 على بئر من 24 لوحة جيدا مع المعطل MEF، وتنمو الخلايا لمدة 48 ساعة على 37 درجة مئوية، وCO 2 5٪.
  2. (تنبيه) إصلاح الخلايا بإضافة 300 ميكرولتر لكل بئر من 4٪ لامتصاص العرق (PFA) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة 300 ميكرولتر من 0.1٪ NP-40 إلى permeabilize الخلايا.
  4. شطف الخلايا مع 300 ميكرولتر من 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين 20.
  5. إضافة 300 ميكرولتر من عازلة تمنع (مصل الحصان 10٪ في برنامج تلفزيوني 1X) لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  6. استخدام الأجسام المضادة الأولية التالية: Oct4 (1:80)، Sox2 (1:80)، Klf4 (1:80)، NANOG (1:100) وSSEA1 (1:80). تمييع SSEA1 مع 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA)، و 10٪ العادي مصل الماعز، 0.3 M الجلايسين في 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين-20. تمييع كل الأضداد الأخرى مع مصل الحصان 10٪ في برنامج تلفزيوني 1X.
  7. احتضان الأجسام المضادة بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
  8. شطف مع 300 ميكرولتر من 0.1٪ في برنامج تلفزيوني-توين-20.
  9. استخدام الأجسام المضادة الثانوية المخفف في مصل الحصان 10٪ في برنامج تلفزيوني 1X: الماعز Alexa594 مترافق المضادة للماوس مفتش (1: 200)، Alexa594 مترافق الدجاج مكافحة الماعز مفتش (1: 200)، Alexa594 مترافق الدجاج المضادة للأرنب مفتش (1: 200)، الماعز Alexa568 مترافق المضادة للماوس الغلوبولين المناعي (1: 200). احتضان لمدة 2 ساعة في درجة حرارة الغرفة.
  10. شطف مع برنامج تلفزيوني 1X.
  11. نوى وصمة عار مع حل هويشت (1: 10000) في برنامج تلفزيوني 1X.

8. في المختبر تمايز الخلايا

  1. لتشكيل شنقا انخفاض الهيئات مضغي (EBS)، وزراعة قطرات واحدة (2000 خلية / 20 ميكرولتر) على غطاء من أطباق بتري، وذلك باستخدام وسيلة التمايز.
  2. احتضان الأطباق في 37 ° Cو 5٪ CO 2 لمدة 4 أيام.
  3. نقل EBS إلى 100 ملم أطباق الصف البكتيري في الثقافة تعليق لمدة 3 أيام في المتوسط ​​التمايز.
  4. EBS لوحة في 24 جيدا لوحات المغلفة مع مصفوفة الغشاء القاعدي (مخفف 01:10 في DMEM) لمدة 14 يوما أخرى.
  5. ليحلل المناعي، استخدام الأجسام المضادة الأولية: T (1: 100)، αfp (1: 200) وTubb3 (1: 500) 37.

9. في فيفو مسخي تشكيل

  1. ضخ 100 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني 1X تحتوي على 1 × 10 6 خلايا الجذع-AF في العضلات من hindlimb من Rag2 - / - γc - / - الفئران.
  2. التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم بعد 6 أسابيع حقن الخلايا.
  3. إزالة ورم الجماهير، تتميز حجمها، من hindlimb من الفئران لالتحليلات التالية.
  4. قطع 7-10 ميكرون المقاطع العرضية سميكة من ورم نظير البنتان المجمدة باستخدام ناظم البرد.
  5. لHaematoxylin لد يوزين (سعادة) وصمة عار:
    1. وصمة عار مع سعادة لتقييم تكوين أنسجة الورم، بعد بروتوكول الشركة المصنعة.
  6. لوصمة عار المناعي:
    1. إصلاح أقسام مسخي مع PFA 4٪ لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    2. Permeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100.
  7. احتضان مع الأجسام المضادة التالية: Tubb3 (1: 100)، αfp (01:50) وαSMA (1: 100) المخفف في 1٪ BSA في برنامج تلفزيوني 1X. احتضان لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية (لTubb3) أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية (للأجسام أخرى).
  8. البيروكسيديز كتلة باستخدام الميثانول بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة.
  9. احتضان لمدة 45 دقيقة عند 37 درجة مئوية مع الأجسام المضادة الثانوية المضادة للماوس-HRP مترافق (1: 150).
  10. شطف مع برنامج تلفزيوني 1X.
  11. احتضان مع البيروكسيديز (HRP) الركيزة (انظر الجدول مواد) لمدة 5 دقائق.
  12. شطف مع مياه الصنبور لمدة 5 دقائق.
  13. وصمة عار مع Haematoxylin QS لمدة 9 ثانية.
  14. شطف مع مياه الحنفية.

    15. 10. استخراج الحمض النووي الريبي من الخلايا

    1. استخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي التجارية وفقا لبروتوكول أوصت الشركة الصانعة.

    11. استخراج الحمض النووي الريبي من ورم مسخي

    1. التجانس مسخي باستخدام مدقة والنيتروجين الهاون وسائل لتجنب ذوبان العينة.
    2. تزن 25 ملغ من الأنسجة.
    3. إضافة 1 مل من كاشف التجاري لاستخراج الحمض النووي الريبي و 200 ميكرولتر من كلوروفورم.
    4. يحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
    5. أجهزة الطرد المركزي في 13000 x ج و 4 درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.
    6. نقل طاف مسح لأنبوب جديد.
    7. لتنقية الحمض النووي الريبي استخدام عدة استخراج الحمض النووي الريبي التجارية وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة.

    12. عكس النسخ، البلمرة تحليل سلسلة من ردود الفعل

    1. توليف [كدنا أول حبلا باستخدام الناسخ العكسي للالنسخ العكسي (RT) سلسلة -polymerase رد فعل (PCR) وبنسبة ضئيلة (DT) أكوردينغ لبروتوكول الشركة المصنعة، للحصول على 50 نانوغرام / ميكرولتر من [كدنا]. تمييع [كدنا بالماء ريبونوكلياز خالية بتركيز 10 نانوغرام / ميكرولتر.
    2. أداء RT-PCR باستخدام البلمرة DNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة، وذلك باستخدام 1 نانوغرام / ميكرولتر من [كدنا].

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

لتقييم قدرة برمجة، جمعت خلايا فأر AF من أجنة الفئران GFP. و transfected الخلايا مع ينقول بلازميد دائري PB-tetO2-IRES-OKMS، والذي يعبر عن العوامل ياماناكا (Oct4، Sox2، cMyc وKlf4) يرتبط بروتين فلوري mCherry بطريقة الدوكسيسيكلين محرض، وعكس التتراسيكلين transactivator (PB- CAG-rtTA) البلازميدات جنبا إلى جنب مع البلازميد التعبير ترانسبوزاز (mPBase). و transfected خلايا فأر AF مع Oct4، Klf4، cMyc وSox2 بعد 1 أسبوع في المختبر التوسع على طبقة الم...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

طريقة اختيار الحصول على تحريض تعدد القدرات هي ذات الصلة لسلامة الخلية السريرية فيما يتعلق زرع المدى الطويل. في الوقت الحاضر، هناك العديد من الطرق المناسبة لإعادة برمجة. ومن بين الأساليب غير التكاملية، والفيروسي (SEV) ناقلات سينداي هو فيروس RNA التي يمكن أن تنتج كميات كبيرة من البروتين دون الاندماج في نواة الخلايا المصابة 40 ويمكن أن يكون استراتيجية للحصول على خلايا الجذع. ناقلات SEV يمكن أن يكون مرشحا جذابا لتوليد خلايا الجذع متعدية الصف، ولكنه يقدم بعض أوج...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

شكر وتقدير

تم دعم هذا العمل من قبل منحة مؤسسة CARIPARO رقم 13/04 ومنحة مؤسسة Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza رقم 10/02. يتم تمويل Martina Piccoli و Chiara Franzin و Michela Pozzobon من قبل Fondazione Istituto di Ricerca Pediatrica Città della Speranza. يتم تمويل إنريكا بيرتين من قبل منحة مؤسسة كاريبارو رقم 13/04. يتم تمويل باولو دي كوبي من قبل مؤسسة جراحية للأطفال في مستشفى جريت أورموند ستريت.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
أطباق بتري 100 مم من الدرجة البكتيرية BD Falcon351029ل in vitro< / em> التمايز
2-mercaptoethanol سيجماM6250للفأر AF ، خلايا iPS-AF ووسط التمايز
Alexa568 الماعز المترافق المضاد للفأر IgM & nbsp ؛ثيرمو فيشر العلميA21043الجسم المضاد الثانوي (التألق المناعي)
Alexa594-مترافق الدجاج المضاد للماعز IgG & nbsp ؛ثيرمو فيشر العلميA21468الجسم المضاد الثانوي (التألق المناعي)
Alexa594 مترافق الدجاج المضاد للأرانب IgG & nbsp ؛Thermo Fisher ScientificA21442الجسم المضاد الثانوي (التألق المناعي)
Alexa594 الماعز المترافق المضاد للفأر IgG & nbsp ؛ثيرمو فيشر ScientificA11005الجسم المضاد الثانوي (التألق المناعي)
مجموعة الفوسفاتيز القلوية   ؛Sigma85L1Alkaline Phosphatase   تلطيخ
AmpicillinSigmaA0166للاختيار البكتيري
ألبومين مصل البقر  سيجماA7906BSA ، لحل الحظر. مخفف في PBS 1x
ChloroformSigmaC2432لاستخراج الحمض النووي الريبي
DH5 & خلايا ألفاThermo Fisher Scientific18265-017بكتيريا لإجراء
الاستنساخ Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo FisherScientific 41965039ل MEF ، AF للفأر ، خلايا iPS-AF ووسط
التمايزدوكسيسيكلين سيجماD9891للتعبير عن العوامل
الخارجية أنابيب الطرد المركزي الدقيقة (1.5 مل)  Sarstedt 72.706لإنتاج PB  
ES FBS 10439024 Thermo Fisher Scientificلخلايا AF للفأر و iPS-AF ووسط التمايز
FBS & nbsp ؛Thermo Fisher Scientificل MEF ملقط متوسط
نقطة دقيقةF.S.Tدومون # 5 & nbsp ؛عزل الضبط البؤري التلقائي
الجيلاتينJTBaker131يستخدم بنسبة 0.1٪ ، مخفف في PBS 1x
GlycineBio-Rad161-0718لحجب الحل. مخفف في PBS 1x
مختبرات الهيماتوكسيلين QSVectorH3404الكشف عن النوى
HE Bio-Optica04-061010التحليل النسيجي للورم المسخي
Hoechst Thermo Fisher ScientificH3570Nuclei
Detection Horse Serum ثيرمو فيشر العلمي16050-122لحجب الحل
الماعز المترافق HRP المضاد للفأر IgGSantaCruzsc2005الجسم المضاد الثانوي (إيمونوبيروكسيديز)
ImmPACT NovaRED & nbsp ؛مختبرات ناقلاتSK4805حقنة الأنسولين الركيزة بيروكسيداز
بإبرة (25 جم)TerumoSS + 01H25161إجراء بزل السلى
Klf4 & nbsp ؛SantaCruzsc-20691أرنب متعدد النسيلة IgG
L-glutamine   ؛Thermo Fisher Scientific25030للفأر AF ، خلايا iPS-AF ووسط التمايز
مرق LB (Lennox)SigmaL3022لنمو البكتيريا
LIF & nbsp ؛سيجماL5158للفأر AF وخلايا iPS-AF المتوسطة
Matrigel BD354234للتمايز < > في المختبر < / em>. مخفف 1:10 في DMEM
MethanolSigma32213بيروكسيداز يحجب
MULTIWELL 24 لوحةبئر BD Falcon353047 ل in vitro < / em> التمايز
MULTIWELL 6 بئر لوحةBD Falcon353046 ل MEF ، AF الفأر و iPS-AF زراعة
الخلايا Nanog & nbsp ؛ReproCELLRCAB0002P-FRabbit متعدد النسيلة IgG
الأحماض الأمينية غير الأساسية   ؛سيجماM7145للفأر AF ، خلايا iPS-AF ووسط التمايز
مختبرات ناقلاتمصل الماعز العاديS2000لحجب الحل. مخفف في PBS 1x
NP-40Sigma12087-87-0لنفاذية الخلية. مخفف في PBS 1x
Oct4SantaCruzsc-5279الماوس أحادي النسيلة IgG2b
Oligo (dT)   ؛Thermo Fisher Scientificل RT-PCR
Paraformaldehyde (محلول)Sigma441244PFA ، مثبت ، مخفف في PBS PBS
10xThermo Fisher Scientific14200-067D-PBS ، خالي من Ca2 + < / sup> / Mg2 + < / sup>. مخفف بالماء المعقم للحصول على PBS 1x
Penicillin - Streptomycin 15070063 Thermo Fisher Scientificل MEF ، AF للفأر ، خلايا iPS-AF ووسيط التمايز
طبق بتري (150 مم)BD Falcon353025لثقافة MEF ، زراعة الأنسجة
PiggyBac التعبير عن transposase البلازميد   ؛مقدمة من البروفيسور أندراس ناجي
PiggyBac-tetO2-IRES-OKMS بلازميد الينقولاتالمقدمة من البروفيسور أندراس ناجي مختبر-PB-tetO2-IRES-OKMS
QIAprep Spin Maxiprep KitQiagen12663لتنقية البلازميدات
QIAprep Spin Miniprep KitQiagen27106لتنقية
البلازميداتالتتراسيكلين العكسي منشط الترانسبوزون البلازميد مقدمة من البروفيسور أندراس ناجي مختبرrtTA
RNeasy Mini Kit   ؛Qiagen74134لاستخراج الحمض النووي الريبي
Sox2 & nbsp ؛SantaCruzsc-17320الماعز متعدد النسيلة IgG
SSEA1   ؛Abcamab16285الماوس أحادي النسيلة IgM
SuperScript II Reverse Transcriptase ثيرمو فيشر العلمي18064-014ل RT-PCR
T & nbsp ؛Abcamab20680أرنب متعدد النسيلة IgG
Taq DNA PolymeraseThermo Fisher Scientific10342020PCR
Trypsin & nbsp ؛Thermo Fisher Scientific25300-054ممر ثقافة الخلية
Triton X-100Bio-Rad161-047لنفاذية الخلية ، مخفف في PBS 1x
TRIzol كاشفThermo Fisher Scientific15596-026لاستخراج
Tubb3 & nbsp ؛  Promega G712Aفأر أحادي النسيلة IgG1
TWEEN-20SigmaP1379لنفاذية الخلية ، مخفف في PBS 1x
& alpha ؛ fp     R & D أنظمةMAB1368الماوس أحادي النسيلة IgG1
&alpha & SMA   ;Abcamab7817كاشف تعداء IgG2a أحادي النسيلة IgG2a
(FuGENE HD) Promega  ؛E2311لتعداء خلايا AF
مجهر مجسمنيكونSM2645لأداء بزل السلى   ؛
200 مو ؛ l نصائحSarstedt 70.760012لاختيار مستعمرات البكتيريا
مقصFST14094-11 غير القابل للصدأ 25Uلأداء بزل السلى   ؛
الإيثانولسيجما2860لتنظيف جدار البطن للسد الحامل
صحن بتري لزراعة الأنسجة (150 مم)  BD Falcon 353025لتوسيع MEF
Mitomycin CSigmaM4287-2MGلتعطيل MEF
MULTIWELL 96 لوحة بئرBD Falcon353071لثقافة iPS-AF
10270106 18418012 مختبر-mPBase الحمض النووي الريبي

المراجع

  1. You, Q., et al. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid. Int J Gynaecol Obstet. 103 (2), 149-152 (2008).
  2. Prusa, A. R., Hengstschlager, M. Amniotic fluid cells and human stem cell research: a new connection. Med Sci Monit. 8 (11), RA253-RA257 (2002).
  3. Ditadi, A., et al. Human and murine amniotic fluid c-Kit+ Lin- cells display hematopoietic activity. Blood. 113 (17), 3953-3960 (2009).
  4. Piccoli, M., et al. Amniotic fluid stem cells restore the muscle cell niche in a HSA-Cre, Smn(F7/F7) mouse model. Stem Cells. 30 (8), 1675-1684 (2012).
  5. Zani, A., et al. Amniotic fluid stem cells improve survival and enhance repair of damaged intestine in necrotising enterocolitis via a COX-2 dependent mechanism. Gut. 63 (2), 300-309 (2014).
  6. Rota, C., et al. Human amniotic fluid stem cell preconditioning improves their regenerative potential. Stem Cells Dev. 21 (11), 1911-1923 (2012).
  7. Mirabella, T., et al. Pro-angiogenic soluble factors from Amniotic Fluid Stem Cells mediate the recruitment of endothelial progenitors in a model of ischemic fasciocutaneous flap. Stem Cells Dev. 21 (12), 2179-2188 (2012).
  8. Mirabella, T., Cili, M., Carlone, S., Cancedda, R., Gentili, C. Amniotic liquid derived stem cells as reservoir of secreted angiogenic factors capable of stimulating neo-arteriogenesis in an ischemic model. Biomaterials. 32 (15), 3689-3699 (2011).
  9. Yeh, Y. C., et al. Cardiac repair with injectable cell sheet fragments of human amniotic fluid stem cells in an immune-suppressed rat model. Biomaterials. 31 (25), 6444-6453 (2010).
  10. Kim, J. A., et al. MYOD mediates skeletal myogenic differentiation of human amniotic fluid stem cells and regeneration of muscle injury. Stem Cell Res Ther. 4 (6), 147(2013).
  11. Vadasz, S., et al. Second and third trimester amniotic fluid mesenchymal stem cells can repopulate a de-cellularized lung scaffold and express lung markers. J Pediatr Surg. 49 (11), 1554-1563 (2014).
  12. Turner, C. G., et al. Preclinical regulatory validation of an engineered diaphragmatic tendon made with amniotic mesenchymal stem cells. J Pediatr Surg. 46 (1), 57-61 (2011).
  13. Galende, E., et al. Amniotic Fluid Cells Are More Efficiently Reprogrammed to Pluripotency Than Adult Cells. Cloning Stem Cells. 12 (2), 117-125 (2009).
  14. Li, C., et al. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells. Hum Mol Genet. 18 (22), 4340-4349 (2009).
  15. Ye, L., et al. Induced pluripotent stem cells offer new approach to therapy in thalassemia and sickle cell anemia and option in prenatal diagnosis in genetic diseases. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (24), 9826-9830 (2009).
  16. Wolfrum, K., et al. The LARGE Principle of Cellular Reprogramming: Lost, Acquired and Retained Gene Expression in Foreskin and Amniotic Fluid-Derived Human iPS Cells. PLoS ONE. 5 (10), 137-138 (2010).
  17. Ye, L., et al. Generation of induced pluripotent stem cells using site-specific integration with phage integrase. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (45), 19467-19472 (2010).
  18. Lu, H. E., et al. Selection of alkaline phosphatase-positive induced pluripotent stem cells from human amniotic fluid-derived cells by feeder-free system. Exp Cell Res. 317 (13), 1895-1903 (2011).
  19. Lu, H. E., et al. Modeling Neurogenesis Impairment in Down Syndrome with Induced Pluripotent Stem Cells from Trisomy 21 Amniotic Fluid Cells. Exp Cell Res. 319 (4), 498-505 (2012).
  20. Kobari, L., et al. Human induced pluripotent stem cells can reach complete terminal maturation: in vivo and in vitro evidence in the erythropoietic differentiation model. Haematologica. 97 (12), 1795-1803 (2012).
  21. Li, Q., Fan, Y., Sun, X., Yu, Y. Generation of Induced Pluripotent Stem Cells from Human Amniotic Fluid Cells by Reprogramming with Two Factors in Feeder-free Conditions. J Reprod Dev. 59 (1), 72-77 (2012).
  22. Fan, Y., Luo, Y., Chen, X., Li, Q., Sun, X. Generation of Human β-thalassemia Induced Pluripotent Stem Cells from Amniotic Fluid Cells Using a Single Excisable Lentiviral Stem Cell Cassette. J Reprod Dev. 58 (4), 404-409 (2012).
  23. Liu, T., et al. High efficiency of reprogramming CD34+ cells derived from human amniotic fluid into induced pluripotent stem cells with Oct4. Stem Cells Dev. 21 (12), 2322-2332 (2012).
  24. Jiang, G., et al. Human transgene-free amniotic-fluid-derived induced pluripotent stem cells for autologous cell therapy. Stem Cells Dev. 23 (21), 2613-2625 (2014).
  25. Drozd, A. M., et al. Generation of human iPSC from cells of fibroblastic and epithelial origin by means of the oriP/EBNA-1 episomal reprogramming system. Stem Cell Res Ther. 6 (122), (2015).
  26. Moschidou, D., et al. Human mid-trimester amniotic fluid stem cells cultured under embryonic stem cell conditions with Valproic acid acquire pluripotent characteristics. Stem Cells Dev. 22 (3), 444-458 (2012).
  27. Moschidou, D., et al. Valproic Acid Confers Functional Pluripotency to Human Amniotic Fluid Stem Cells in a Transgene-free Approach. Mol Ther. 20 (10), 1953-1967 (2012).
  28. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  29. Mikkelsen, T. S., et al. Dissecting direct reprogramming through integrative genomic analysis. Nature. 454 (7200), 49-55 (2008).
  30. Sridharan, R., et al. Role of the murine reprogramming factors in the induction of pluripotency. Cell. 136 (2), 364-377 (2009).
  31. Knight, S., Collins, M., Takeuchi, Y. Insertional mutagenesis by retroviral vectors: current concepts and methods of analysis. Curr Gene Ther. 13 (3), 211-227 (2013).
  32. Fraser, M. J., Ciszczon, T., Elick, T., Bauser, C. Precise excision of TTAA-specific lepidopteran transposons piggyBac (IFP2) and tagalong (TFP3) from the baculovirus genome in cell lines from two species of Lepidoptera. Insect Mol Biol. 5 (2), 141-151 (1996).
  33. Woltjen, K., Kim, S. I., Nagy, A. The PiggyBac Transposon as a Platform Technology for Somatic Cell Reprogramming Studies in Mouse. Methods Mol Biol. 1357, 1-22 (2015).
  34. Wu, S. C., et al. piggyBac is a flexible and highly active transposon as compared to sleeping beauty, Tol2, and Mos1 in mammalian cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (41), 15008-15013 (2006).
  35. Ding, S., et al. Efficient transposition of the piggyBac (PB) transposon in mammalian cells and mice. Cell. 122 (3), 473-483 (2005).
  36. Wang, W., et al. Chromosomal transposition of PiggyBac in mouse embryonic stem cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (27), 9290-9295 (2008).
  37. Cadiñanos, J., Bradley, A. Generation of an inducible and optimized PiggyBac transposon system. Nucleic Acids Res. 35 (12), e87(2007).
  38. Bertin, E., et al. Reprogramming of mouse amniotic fluid cells using a PiggyBac transposon system. Stem Cell Research. 15 (3), 510-513 (2015).
  39. Woltjen, K., et al. piggyBac transposition reprograms fibroblasts to induced pluripotent stem cells. Nature. 458 (7239), 766-770 (2009).
  40. Fusaki, N., et al. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci. 85 (8), 348-362 (2009).
  41. Nishishita, N., et al. Generation of virus-free induced pluripotent stem cell clones on a synthetic matrix via a single cell subcloning in the naive state. PLoS One. 7 (9), e38389(2012).
  42. Ono, M., et al. Generation of induced pluripotent stem cells from human nasal epithelial cells using a Sendai virus vector. PLoS One. 7 (8), e42855(2012).
  43. Yant, S. R., et al. High-resolution genome-wide mapping of transposon integration in mammals. Mol Cell Biol. 25 (6), 2085-2094 (2005).
  44. Wilson, M. H., Coates, C. J., George, A. L. PiggyBac transposon-mediated gene transfer in human cells. Mol Ther. 15 (1), 139-145 (2007).
  45. Galvan, D. L., et al. Genome-wide mapping of PiggyBac transposon integrations in primary human T cells. J Immunother. 32 (8), 837-844 (2009).
  46. Huang, X., et al. Gene transfer efficiency and genome-wide integration profiling of Sleeping Beauty, Tol2, and piggyBac transposons in human primary T cells. Mol Ther. 18 (10), 1803-1813 (2010).
  47. Meir, Y. J., et al. Genome-wide target profiling of PiggyBac and Tol2 in HEK 293: pros and cons for gene discovery and gene therapy. BMC Biotechnol. 11 (28), (2011).
  48. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  49. Filareto, A., et al. An ex vivo gene therapy approach to treat muscular dystrophy using inducible pluripotent stem cells. Nat Commun. 4 (1549), (2013).
  50. Darabi, R., et al. Human ES- and iPS-derived myogenic progenitors restore DYSTROPHIN and improve contractility upon transplantation in dystrophic mice. Cell Stem Cell. 10 (5), 610-619 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة