مقالة منهجية

سرعة اقتناء الصور 3D باستخدام عالية الدقة Episcopic المجهر

DOI:

10.3791/54625

⸱

نوفمبر 21, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatric Surgery, The Second Affiliated Hospital & Yuying Children's Hospital, Wenzhou Medical University, 2Departments of Urology, Boston Children's Hospital, 3Department of Surgery, Harvard Medical School, 4Department of Cardiovascular Surgery, Guangdong Cardiovascular Institute, Guangdong General Hospital, Guangdong Academy of Medical Sciences

* These authors contributed equally

في هذه المقالة

ملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نصف بروتوكولا مفصلا باستخدام الفحص المجهري الأسقفي عالي الدقة للحصول على صور ثلاثية الأبعاد (ثلاثية الأبعاد) لأجنة الفئران. يستخدم هذا البروتوكول المحسن طريقة تحضير الأنسجة المعدلة لتعزيز تغلغل الصبغة الفلورية ، مما يسمح بالتحليل المورفومتري لكل من العينات الصغيرة والكبيرة الحجم.

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
تتيح تقنية

المجهرية الأسقفية عالية الدقة (HREM) الحصول السريع على البيانات المورفومترية الرقمية الحجمية وثلاثية الأبعاد (3D). هنا ، نصف البروتوكول التفصيلي لتصوير جنين الفأر بأكمله. يتكون البروتوكول من أربعة أقسام رئيسية: إعداد العينة ، والتضمين ، والحصول على الصور ، وأخيرا ، التصور ثلاثي الأبعاد. تتطلب التقنية تلطيخ العينات بصبغة فلورية ، والتي يمكن أن تكون مشكلة بالنسبة للعينات الكبيرة أو الكثيفة. للتغلب على هذا القيد ، قمنا بتحسين البروتوكول الحالي لتعزيز تغلغل الأنسجة للصبغة عن طريق المعالجة المسبقة للعينة بمحلول يحتوي على اليوريا وكبريتات دوديسيل الصوديوم. يستخدم البروتوكول فقط معدات المختبرات والكواشف الروتينية لسهولة التكيف في إعدادات المختبر القياسية. نظهر أن الصور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة الناتجة تلخص بأمانة السمات المورفولوجية التفصيلية للأعضاء الداخلية لأجنة الفئران ، مما يسمح بالتحليلات المورفومترية. نقدم معا بروتوكولا مفصلا ومحسنا باستخدام معدات المختبرات القياسية للحصول على صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة للعينات الصغيرة والكبيرة الحجم.

المقدمة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

أدى ظهور تقنيات التصوير ثلاثي الأبعاد إلى فتح إمكانية التحليل المنهجي للسمات المورفولوجية التفصيلية أثناء نمو الجنين. تتوفر الآن مجموعة متنوعة من طرق التصوير ثلاثية الأبعاد بما في ذلك التصوير بالرنين المغناطيسي الدقيق (التصوير بالرنين المغناطيسي الدقيق) ، والتصوير المقطعي المحوسب الدقيق ، والموجات فوق الصوتية عالية التردد ، والتصوير المقطعي البصري للتماسك ، والتصوير المقطعي البصري للمشروع ، والفحص المجهريالأسقفي 1-4. كل طريقة لها ميزاتها الفريدة في الدقة والتباين والسرعة والتكلفة وقدرة الرحم والتوافر.

التقاط الصور الفلورية الأسقفية (EFIC) والفحص المجهري الأسقفي عالي الدقة (HREM) هي طرق تصوير مجهريةأسقفية 4. هنا ، يتم التقاط صور تسلسلية عالية الدقة بشكل مستمر من وجه الكتلة بدلا من أقسام الأنسجة. تعكس الصور الناتجة بأمانة السمات المورفولوجية التفصيلية مع الحد الأدنى من تشويه الأنسجة أو بدونها. يتم تحويل البيانات الحجمية المكتسبة بسهولة إلى صور ثلاثية الأبعاد عالية الدقة مناسبة للتحليل المورفومتري الدقيق. بسبب التكلفة المنخفضة نسبيا والدقة العالية ، أصبحت HREM و EPIC البدائل المتفوقة للتقييم المنهجي لنماذج الفئران للعيوب الخلقية البشرية2،4-8.

تتطلب كل من طرق EFIC و HREM تضمين العينات في الوسط المناسب. يكتشف EFIC التألق الذاتي المنبعث من الأنسجة المضمنة. لهذا السبب ، يقتصر الأمر على العينات التي تنبعث منها مستويات عالية من التألق الذاتي ولكن ليس تلك ذات التألق الذاتي الضعيف نسبيا مثل أجنة المرحلة المبكرة9. للتغلب على اعتماد التألق الذاتي ، يتم تلطيخ العينات بصبغة فلورية مثل اليوزين لتصوير HREM. تجعل خيارات الأصباغ وطرق التلوين أيضا HREM أكثر توافقا للكشف عن الإشارات الجزيئية في سياق بنية الأنسجة والتشكل4،10.

في هذه المقالة ، نقدم بروتوكول HREM محسن مناسب لتقييم الجسم بالكامل لأجنة الفئران في المرحلة المتأخرة. لتسهيل التلوين ، نقوم بتضمين خطوة المعالجة المسبقة لزيادة اختراق الأنسجة ، وبالتالي تمكين تصوير HREM لأجنة الفئران الأكبر سنا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تمت الموافقة على جميع الاستخدامات الحيوان من قبل لجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسي في مستشفى الأطفال في بوسطن.

التحضير 1. عينة

  1. التزاوج توقيت
    1. وضع C57Bl6 النوع البري من الذكور والإناث معا في نفس القفص.
    2. تحقق لتشكيل المكونات التزاوج في وقت مبكر صباح اليوم التالي. المكونات التزاوج (ويعرف أيضا باسم، عن طريق المهبل أو المكونات الجماع) هو ترسب هلامي تصلب الذي يمنع المهبل.
    3. تحديد موعد المكونات كما الجنينية يوم 0.5 (e0.5).
  2. العزلة من أجنة الفئران
    1. الموت ببطء الإناث الحوامل من CO 2 الخنق.
    2. وضع الفئران مستلق على وسادة ماصة ورش منطقة البطن مع الايثانول 70٪.
    3. رفع الجلد وجعل شق 5 مم الأولي في منطقة البطن الذيلية باستخدام مقص جراحي. قطع وإزالة الجلد في منطقة البطن للكشف تماما عن الأعضاء الداخلية
    4. قطع بالقرب زارة شؤون المحاربين القدامىجينا لإزالة الرحم بأكمله.
    5. قطع بين المواقع زرع طول قرن الرحم. يجب أن يكون كل جزء أو الحمل المستكن جنين واحد فقط في الداخل.
    6. الحفاظ على شرائح الرحم في 1X الجليد الباردة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  3. تشريح الجنين
    1. وضع كل الحمل المستكن في طبق منفصل مع الثلج الباردة برنامج تلفزيوني تحت المجسام.
    2. إزالة أنسجة الرحم، والمشيمة والأغشية الجنينية ثم بالتتابع باستخدام ملقط تشريح غرامة.
    3. نقل الأجنة تشريح لأنبوب 50 مل مع 1X الجليد الباردة برنامج تلفزيوني باستخدام ماصة نقل كبيرة. تجنب التقاط الجنين مباشرة مع ملقط للحد من تلف الأنسجة.
  4. تثبيت
    1. إصلاح الأجنة تشريح في 10٪ محايد حل الفورمالين مخزنة في 4 درجة مئوية لمدة أكثر من 24 ساعة مع لا يقل عن 10 مجلدات عينة من تثبيتي.
  5. المعالجة
    1. إعداد الحل المقاصة: 4M اليوريا، و 10٪ الجلسرين، و 4٪ الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) في الماء المقطر المزدوج.
    2. استبدال تثبيتي مع الحل المقاصة.
    3. تناوب بلطف العينة على الكرسي الهزاز في درجة حرارة الغرفة ل1-2 أسابيع. تبادل الحل المقاصة مرة واحدة في الثاني واليوم الثالث. العينة يصبح ببطء واضح وشفاف.
    4. استبدال الحل المقاصة مع 10٪ من الفورمالين وترك على الكرسي الهزاز لمدة 2 أيام.
  6. جفاف
    1. غسل العينات سابقة التجهيز مع برنامج تلفزيوني 1X 3 مرات لمدة 5 دقائق لكل منهما.
    2. يذوى العينات في سلسلة الإيثانول تصاعدي في درجة حرارة الغرفة على الكرسي الهزاز لطيف. للأجنة E15.5، استخدام سلسلة تصاعدي الإيثانول بما في ذلك 50٪، 60٪، 70٪، 80٪، 85٪، 90٪، 95٪، والإيثانول بنسبة 100٪، 2 ساعة كل خطوة. لأجنة كبار السن، ويحتاج فترة حضانة إلى زيادة.
  7. تلطيخ
    1. إعداد تلطيخ الحل: إضافة 0.1375 غراما من يوزين Y الصوديوم والملح و0.0275 غراما من الأكريدين أورانج نصفي (كلوريد الزنك) ملح إلى 50 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. تحرك المكونات لمدة 2 ساعة. تصفية مع ورقة الترشيح. تخزين في درجة حرارة الغرفة، وتجنب ضوء من خلال تغطية بورق الألمنيوم.
    2. نقل العينة إلى الحل تلطيخ لمدة 1 ساعة.
    3. استبدال الحل تلطيخ الطازجة وصمة عار بين عشية وضحاها.
  8. تسلل
    1. إعداد تسلل الحل: الجمع بين 100 مل من محلول ألف من JB-4 طقم التضمين، 1.25 غرام من محفز C، 0.275 غرام من يوزين Y الصوديوم والملح و0.055 غرام من البرتقال الأكريدين نصفي (كلوريد الزنك) الملح. يحرك المزيج حتى خلط (200 دورة في الدقيقة) في دلو الثلج لمدة 2 ساعة، ثم تصفية مع ورقة الترشيح.
    2. تخزين الحل التسلل عند 4 درجات مئوية، وتجنب ضوء من خلال تغطية بورق الألمنيوم.
    3. نقل الأجنة إلى تسلل الحل: الحل تلطيخ (1: 1)، واحتضان لمدة لا تقل عن 3 ساعة على الكرسي الهزاز في 4 درجات مئوية.
    4. نقل الأجنة إلى تسلل الحل واحتضان لمدة 3 ساعاتص على الكرسي الهزاز في غرفة باردة.
    5. استبدال تسلل الحل مرة واحدة كل يوم، وترك في غرفة باردة على الكرسي الهزاز لطيف لمدة ثلاثة أيام أخرى.

2. تضمين

  1. إبقاء الحل B وتسلل الحل على الجليد.
  2. جعل تضمين الحل (1:25 من الحل B وتسلل الحل) على الفور قبل التضمين.
  3. الشرق العينة في قالب التضمين، ثم صب البارد الحل تضمينها في القالب تضمين بلطف. إعادة توجيه مع دبوس إذا لزم الأمر.
  4. استخدام دبوس لدراسة ما إذا كانت توطد الحل التضمين. طرد كتلة العينة، وتقليم إذا لزم الأمر.
  5. إعادة توجيه كتلة العينة باستخدام قالب منفصل للحصول على التوجه عبر.
  6. وضع حامل كتلة في أعلى القالب التضمين. صب بلطف تضمين الحل في القالب حتى يتم المغمورة العفن وحامل كتلة من تضمين الحل.
  7. الحفاظ على العينة في وعاء الثانوية وترك الأمرعلى الجليد لمدة 3-4 ساعة في غطاء الدخان.
  8. تخزين العينات عزز في 4 درجات مئوية.
  9. قشر بعيدا قالب التضمين. وضع كتلة تحت مجهر تشريحي مع إضاءة مائلة لتفقد وضع العينة في الكتلة. على وجهه كتلة، خطوط الشبكة كافة أنحاء العينة.
  10. تقليم كتلة لإزالة كمية صول تضمين المواد باستخدام خطوط الشبكة ضعت المراجع.

3. الحصول على الصور

  1. المشبك كتلة العينة إلى مشراح والحصول على قطع السطحية العذبة. تعيين سمك الباب (على سبيل المثال، e9.5-10.5، 1.5 ميكرون، e11.5-12.5، 2.0 ميكرون، e13.5-15.5، 2.5 ميكرون، e16.5-كبار السن، 3 ميكرون). الحفاظ على عينة / كتلة في موقف البيت من مشراح.
  2. جبل المجهر ستيريو التكبير التي تواجه أفقيا على سطح كتلة من العينة.
  3. قم بتشغيل الكمبيوتر والمجهر، والبدء في البرنامج الحصول على الصور.
  4. تصور والتركيز البصريات إلى كتلة وجهتحت عنوان "عرض لايف" واسطة من برامج التصوير.
  5. محاذاة المجهر ومشراح إذا لزم الأمر بحيث كتلة الوجه في مركز عدسة الكاميرا.
  6. ضبط التكبير بحيث كامل كتلة الوجه داخل عدسة الكاميرا.
  7. اختر الأخضر بروتين فلوري (GFP) فلتر (الإثارة 470 ± 20 نانومتر، مزدوج اللون 495 نانومتر، وانبعاث 525 ± 25 نانومتر) وتركيز إذا لزم الأمر.
  8. قياس وضبط الوقت التعرض يدويا (على سبيل المثال، 80-400 مصغرة ثانية).
  9. الحصول على صور من كتلة وجه بعد كل قطع الطازجة وحفظ الصور تلقائيا إذا أمكن ذلك.
  10. المعالم الهامة سجل بما في ذلك القرار، سمك الباب والتكبير.
  11. بعد الانتهاء من العينة كلها والتصدير وتحويل جميع ملفات الصور إلى صيغة JPEG إذا لزم الأمر.
  12. عكس كل الصور الأصلية باستخدام برامج معالجة التصوير، وضبط السطوع والتباين.
  13. حفظ جميع الصور المجهزة في مجلد منفصل.

4. 3Dتصور

  1. تحميل جميع الصور المجهزة لبرنامج التصور 3D اتباع التعليمات.
  2. قرار المدخلات وسمك الباب لتحويل جميع الصور لبيانات حجمية (أي حجم فوكسل) وحفظ الملف 3D.
  3. محاذاة كل الصور باستخدام طريقة تلقائية. ضبط الصور الفردية يدويا إذا لزم الأمر.
  4. حفظ الصورة الانحياز إلى اسم ملف جديد.
  5. تحليل الخصائص المورفولوجية للعينة باستخدام برنامج 3D التصور.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

لقد ذكرت الصور HREM جودة عالية من أجنة الفئران بين E9.5 وE13.5 8. جودة الصورة من الأجنة نظموا في وقت متأخر، ومع ذلك، هو خطر كبير بسبب اختراق الأنسجة محدود من يوزين صبغة الفلورسنت. لزيادة كفاءة تلطيخ، اختبرناها عدة طرق المعالجة التي تتوافق التصوير الفلورسنت 11. على وجه التحديد، تم علاج أجنة الفئران E15.5 مع أي هيئة السلع التموينية / ه A2 12 أو كامل الجسم CUBIC 13. لقد اختبرنا أيضا صيغة مبسطة، والمقاصة الحل...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المناقشة

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هنا، نقدم بروتوكول تعديلها باستخدام المعدات المخبرية الروتينية للحصول على الصور HREM التسلسلية التي تتلاءم مع التصور 3D السريع وتحليل المورفومترية من الهياكل المعقدة. لأنه يتم أخذ صور عالية الدقة مباشرة من على وجه كتلة بدلا من المقاطع الفردية، والحفاظ على الميزات الشكلية الجميلة وأعيد بناؤها بسرعة رقميا في برنامج التصور 3D.

عروض 3D التصوير مزايا كبيرة في تصور وفهم الخصائص المورفولوجية المعقدة. تعتمد معظم تقنيات ا...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

الإفصاحات

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

شكر وتقدير

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نشكر الدكتورين Yichen Huang و Chunming Guo و Zhenfang Zhou على دعمهم الفني. تم تمويل هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة / NIDDK (1R01DK091645-01A1 ، XL) وجمعية القلب الأمريكية (AHA ، 13GRNT16950006 ، XL).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة
الاسمالشركةرقم فهرسيالتعليقات
الفئرانمختبر جاكسونC57BL6
الكحول الإيثيليPharmco-Aaper111000200200 إثبات ، مطلق ، ACS / USP / كوشير الصف
فورمالينسيجماHT501128-4L
اليورياسيجماU5128محلول المقاصة
الجلسرينفيشر العلميG33-4المقاصة
محلول المقاصة Dodecyl SulfateInvitrogen15525-017المقاصة
Eosin Y ملح ثنائي الصوديومفيشر محلولالتسلل العلمي BP241925
Acridine Orange hemi (كلوريد الزنك) ملحSigmaA6014محلول التسلل
ورق WhatmanGE3030-153
JB-4 طقم التضمين - Solution APolysciences، Inc.0226A-800حل التسلل
JB-4 طقم التضمين - الحل بPolysciences، Inc.0226B-30الحل
JB-4  مجموعة التضمين - CatalystPolysciences، Inc.02618-12حلول التسلل
تضمين قوالبPolysciences، Inc.23185-116 × 8 مم
قوالب التضمين الحادة Peel-A-WayPolysciences، Inc.18986-122 مم × 22 مم مربع، مقطوعة إلى 12 مم × 12 مم
JB-4  حاملي البلوك البلاستيكيPolysciences، Inc.15899
أنابيب نقل متدرجة يمكن التخلصمنها VWR414004-014
طبق بنزينVWR25384-088ملقط تشريح الأجنة
ملقط طرف إينوكس  ROBOZRS-5015تشريح الأجنة
Graefe Tissue Forcep  ROBOZRS-5153الأجنة
مقص التشغيل الدقيق  ROBOZRS-6700تشريح الأجنة
14 مل أنابيب البولي بروبيلين المستديرةفالكون352059
50 مل أنابيب مخروطية من مادة البولي بروبيلينفالكون352098
دلو ثلجماجيك تاتش آيس وير إنترناشيونال كورب.R19-343
100 مل (3.4 أونصة) قوارب وزن البوليسترين المضادة للكهرباء الساكنةVWR89106-766
330 مل (11.2 أونصة) قوارب وزن البوليسترين المضادة للكهرباء الساكنةVWR89106-770
كلوريد الصوديومMP الطب الحيوي102892محلول PBS
كلوريد البوتاسيومسيجماP0662PBS محلول
فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدةسيجماP5405PBS محلول
فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة سباعي الهيدراتسيجما-ألدريتشS9390PBS
الكاميرا الرقميةHamamatsu PhotonicsC11440-10C
MicrotomeLeicaRM2265
IlluminatorCarl ZeissHXP 200C
Fluorescence Stereo ZoomCarl ZeissAxio Zoom.V16
مجهر ستيريوأوليمبوسSZX16
مصدر ضوء الألياف البصريةلايكاKL 1500 LCD
Microtome Blade القابل للتصرفVWR95057-832
موزع أحادي الحافةPersonna62-0330-0000
ZENCarl Zeisspro 2012
PhotoshopAdobeCS6 v13.0
Amira 3D SoftwareVisage Imaging5.4
Computerمحرك الأقراص الثابتة Dell T7600 و 2x900GB SAS و 64 جيجابايت DDR3
ذاكرة هزازات المنصة الهزازVWR40000-304
محرك الأقراص الساخنة القياسيVWR12365-382
الميزان التحليليMettler ToledoAB54-S
محلول محلول تضمين تشريح القاع الحل Microscope RDIMM

المراجع

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gregg, C. L., Butcher, J. T. Quantitative in vivo imaging of embryonic development: opportunities and challenges. Differentiation. 84, 149-162 (2012).
  2. Liu, X., Tobita, K., Francis, R. J., Lo, C. W. Imaging techniques for visualizing and phenotyping congenital heart defects in murine models. Birth defects Res C. 99, 93-105 (2013).
  3. Norris, F. C., et al. A coming of age: advanced imaging technologies for characterising the developing mouse. Trends Genet. 29, 700-711 (2013).
  4. Weninger, W. J., et al. Phenotyping structural abnormalities in mouse embryos using high-resolution episcopic microscopy. Dis model mech. 7, 1143-1152 (2014).
  5. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 641-646 (2012).
  6. Sizarov, A., et al. Three-dimensional and molecular analysis of the arterial pole of the developing human heart. J Anat. 220, 336-349 (2012).
  7. Anderson, R. H., et al. Normal and abnormal development of the intrapericardial arterial trunks in humans and mice. Cardiovasc Res. 95, 108-115 (2012).
  8. Huang, Y. C., Chen, F., Li, X. Clarification of mammalian cloacal morphogenesis using high-resolution episcopic microscopy. Dev Biol. 409, 106-113 (2016).
  9. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Embedding embryos for episcopic fluorescence image capturing (EFIC). Cold Spring Harb protoc. , 675-677 (2012).
  10. Weninger, W. J., Mohun, T. J. Three-dimensional analysis of molecular signals with episcopic imaging techniques. Methods mol biol. 411, 35-46 (2007).
  11. Richardson, D. S., Lichtman, J. W. Clarifying Tissue Clearing. Cell. 162, 246-257 (2015).
  12. Hama, H., et al. Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).
  13. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157, 726-739 (2014).
  14. Mohun, T. J., Weninger, W. J. Generation of volume data by episcopic three-dimensional imaging of embryos. Cold Spring Harb protoc. , 681-682 (2012).

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة