Method Article

تقييم الشبكية دبقية أكلة وظيفة في فيفو باستخدام الفحص القائمة على الخلوي التدفق

DOI:

10.3791/54677

⸱

October 18th, 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Cell and Molecular Biology, The Scripps Research Institute, 2Department of Chemical Physiology, The Scripps Research Institute, 3The Lowy Medical Research Institute

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

البلعمة دبقية أمر بالغ الأهمية للحفاظ على توازن الأنسجة وعدم كفاية وظيفة أكلة وقد تورط في علم الأمراض. ومع ذلك، تقييم وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة في الجسم الحي يمثل تحديا تقنيا. قمنا بتطوير تقنية بسيطة ولكنها قوية لرصد وقياس القدرة أكلة من الخلايا الدبقية الصغيرة في إعداد الفسيولوجية على وجه التحديد.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Microglia هي البلاعم المقيمة في الأنسجة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وتؤدي مجموعة متنوعة من الوظائف التي تدعم توازن الجهاز العصبي المركزي ، بما في ذلك البلعمة في المشابك أو الخلايا التالفة ، والحطام ، و / أو مسببات الأمراض الغازية. كان ضعف وظيفة البلعمة متورطا في التسبب في أمراض مثل مرض الزهايمر والتنكس البقعي المرتبط بالعمر ، حيث تتراكم لويحات الأميلويد β والدروسين ، على التوالي. على الرغم من أهميته ، إلا أن البلعمة الدبقية الدقيقة كانت صعبة في التقييم في الجسم الحي. هنا ، نصف تقنية بسيطة ولكنها قوية لمراقبة وقياس إمكانات البلعمة في الجسم الحي للشبعية الصغيرة في الشبكية بدقة وقياسها. اعتمدت الطرق السابقة على تقنيات التلوين والتصوير. تستخدم طريقتنا قياس التدفق الخلوي لقياس امتصاص الخلايا الدبقية الدقيقة للجسيمات المصنفة بالفلورسنت بعد التوصيل داخل الجسم الزجاجي إلى العين في القوارض الحية. تحل هذه الطريقة محل الممارسات التقليدية التي تتضمن تقطيع الأنسجة الشاقة والتلوين المناعي والتصوير ، مما يسمح بتقدير أكثر دقة لوظيفة البلعمة الدبقية الصغيرة في أقل من ست ساعات. يمكن أيضا تكييف هذا الإجراء لاختبار كيفية تغيير المركبات المختلفة للبلعمة الدبقية الدقيقة في البيئات الفسيولوجية. بينما تم تطوير هذه التقنية في العين ، إلا أن استخدامها لا يقتصر على أبحاث الرؤية.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ويتمثل الهدف العام من هذا الأسلوب هو إجراء تقييم دقيق وتحديد في البلعمة دبقية الجسم الحي. الخلايا الدبقية الصغيرة هي الضامة المقيمين أنسجة الجهاز العصبي المركزي (CNS). وأداء مجموعة متنوعة من المهام لضمان الحفاظ على توازن الأنسجة. وتشمل هذه المراقبة المناعي، إفراز عوامل عصبية و، من أهمية محورية، البلعمة 1. البلعمة دبقية أساسية في العديد من الأحداث الهامة خلال تطور الدماغ وشبكية العين، مثل البلعمة من نقاط الاشتباك العصبي غير ذات صلة (التقليم متشابك) وإزالة الخلايا العصبية أفكارك 2-4. وعلاوة على ذلك، وقد تبين البلعمة دبقية صغيرة من الخلايا العصبية التالفة أو أفكارك، والحطام الخلوي، والميكروبات الغازية لأنها ضرورية للحفاظ على الجهاز العصبي المركزي التوازن من خلال سن البلوغ 5. وأخيرا، فقد تورطت البلعمة دبقية في التسبب في العديد من الأمراض العصبية، بما في ذلك مرض الزهايمر والمرتبط بالعمرالضمور البقعي، حيث قيل إن المعيبة أو غير كافية القدرة أكلة يمكن أن تسهم في تراكم اميلويد β (Aβ) لويحات وبراريق شفافة، على التوالي 6،7.

وينظم وظيفة دبقية بإحكام من قبل المكروية، وخاصة من خلال العوامل القابلة للذوبان مثل ورم عامل النمو β أو التفاعلات خلية خلية. الخلايا العصبية تعبير جوهري عدة بروابط سطح الخلية، مثل CD200 وCX3CL1، في حين أن الخلايا الدبقية الصغيرة التعبير حصرا المستقبلات منها CD200R وCX3CR1. هذه المستقبلات تحتوي على immunoreceptor الزخارف تثبيط القائم على التيروزين (ITIMs) في جزء من الخلايا. هذه المانع مستقبلات حيوية لمنع الإفراط في تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة، التي يمكن أن تسهم في neuroinflammation. وهكذا، في ظل ظروف فسيولوجية طبيعية، والتفاعلات خلية خلية بين الخلايا العصبية والخلايا الدبقية الصغيرة تبقي الخلايا الدبقية الصغيرة في حالة سكون. أثناء إصابة الأنسجة، ومع ذلك، يمكن أن الخلايا العصبية أسفل تنظيم إكسبression هذه بروابط، وإزالة تأثير كابح بشكل خاص على تنشيط الخلايا الدبقية الصغيرة. وهكذا وظيفة دبقية (بما في ذلك البلعمة) ترتبط ارتباطا وثيقا المكروية من 8. ومع ذلك، حتى الآن، لا توجد فحوصات موحدة لدراسة الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة في سياق الفسيولوجية أو في الطريقة التي يعيد كامل الجهاز العصبي المركزي المكروية بهم.

وقد وضعت عدة فحوصات لقياس النشاط أكلة من الخلايا الدبقية الصغيرة في المختبر، حيث الخلايا الدبقية الصغيرة الأولية أو خطوط الخلايا الدبقية الصغيرة يتم تربيتها مع الخلايا المستهدفة (على سبيل المثال، الخلايا العصبية أفكارك) أو حبات fluorescently المسمى. ثم يتم تقييم امتصاص الهدف باستخدام الفلورسنت المجهر التصوير أو التدفق الخلوي 9-12. هذه المقايسات تتيح اختبار كيفية التلاعب الدوائي أو وراثية قد تؤثر على البلعمة دبقية صغيرة، وبينما غنية بالمعلومات، تفشل لتكرار تماما المجمع في بيئة الجسم الحي. طرق غير مباشرة لدراسة البلعمة دبقيةفي الجسم الحي وقد تم الإبلاغ عن: يتم إنجاز هذه تلوين جزيئات يعتقد أن تشارك في البلعمة (على سبيل المثال، CD68)، وتقييم القرب المادي من الخلايا الدبقية الصغيرة والأهداف لالبلعمة (على سبيل المثال، الخلايا العصبية للخطر أو عناصر متشابك)، أو عن طريق كشف المناعى من أكلة أهداف داخل الخلايا دبيقي (على سبيل المثال، Aβ) 13-17. وقد استخدمت دراستين نهج أكثر مباشرة لتقييم الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة في الجسم الحي. وقد استخدمت هيوز ورفاقه تقنيات التصوير لقياس امتصاص دبقية من الخرز تسليمها عبر الطريق داخل الجمجمة 18. سييرا وآخرون بتطوير أسلوب دقيق لتقييم كمي البلعمة الخلايا الدبقية الصغيرة من الخلايا أفكارك باستخدام تقنيات التصوير المعقدة 4. ومع ذلك، هذه الطرق تتضمن بروتوكولات معقدة لإعداد الأنسجة، باجتزاء، والتصوير، والتحليل. لقد استخدمت سابقا تحليل cytometric تدفق لتقييم البلعمة من مبصرة خارجشرائح إيه بواسطة خلايا الشبكية الظهارة الصباغية (RPE) في الثقافة (19). هنا، نحن تصف بروتوكول لتقييم امتصاص بسرعة fluorescently المسمى الجسيمات من قبل الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين كإجراء الكمي في الجسم الحي الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمة.

البروتوكول وصفنا هنا يسمح لقياس موثوقة والكمي للالبلعمة دبقية صغيرة في شبكية العين في أقل من ست ساعات في ثلاث خطوات حاسمة: (1) تسليم intravitreal من جزيئات fluorescently المسمى، (2) الحصاد وإعداد أنسجة الشبكية، و (3) تدفق تحليل cytometric. طريقة وضعنا هو وسيلة قوية لتقييم البلعمة دبقية صغيرة في شبكية العين، ويمكن استخدامه بنجاح لاختبار مدى مختلف المركبات أو التلاعب الجيني تغير هذه الوظيفة دبقية الرئيسية في إعدادات الفسيولوجية. كمجال متخصص في الجهاز العصبي المركزي، وشبكية العين هو نظام نموذجي للوصول بسهولة إلى دراسة وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة 20. في حين تم تطوير هذه الطريقة في تيانه عين، فإننا نعتقد أنه يمكن أن تكون مفيدة لجميع علماء الأعصاب التحقيق وظيفة الخلايا الدبقية الصغيرة أكلة.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

تم علاج جميع الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية التي وضعها معهد سكريبس للأبحاث.

1. إعداد مواد للحقن

  1. تعقيم إبرة 33 G وحقنة: تفكيك والأوتوكلاف على 115 ο C. تعد الإبر لحقن بسبب ارتفاع في العقيمة الفوسفات مخزنة المالحة (PBS).
  2. ذوبان الجليد جزيئات fluorescently المسمى في درجة حرارة الغرفة ل5-10 دقيقة. يعد حل الجسيمات للحقن خلال إعادة تأسيس ل/ مل حل 50 ملغ في برنامج تلفزيوني العقيمة مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+.
    ملاحظة: تستخدم الجزيئات المسمى AF488 من أصل الفطرية التي تم التحقق من صحتها لفحوصات البلعمة في هذا البروتوكول 21-23. لامتصاص الأمثل، وإعداد جزيئات جديدة ومباشرة قبل الحقن.
    قد يكون الأمثل الجسيمات تركيزات لكل تجربة محددة: الملاحظة (2).

2. Intravitreal حقن الخرزة الحل

ملاحظة: اثنان صeople المطلوبة لإجراء الحقن، بطريقة مثل أن الشخص أداء الحقن يمكن الاستمرار على الماوس، والحفاظ على التركيز على مقلة العين، في حين أن الشخص الآخر يمر المحاقن تحميلها ويدفع المكبس.

  1. تخدير القوارض عن طريق الحقن داخل الصفاق من 100 ملغ / مل الكيتامين و 10 ملغ / مل زيلازين بجرعة 20 ميكرولتر / 10 غرام من وزن الجسم. قبل الحقن، واستخدام قرصة أخمص القدمين إلى تقييم مستوى التخدير.
    ملاحظة: الأيزوفلورين له تأثير عميق على وظيفة خلايا الدم النخاعي، وبالتالي، واستخدامه في جميع أنحاء هذا الاختبار يجب تجنب 24،25.
  2. تحميل إبرة مع 0.5 حل الجسيمات ميكرولتر من fluorescently المسمى.
  3. وضع الماوس جانبية تحت المجهر الجراحي (الشكل 1A-B). استخدام مواد لينة، على سبيل المثال، حزمة هلام، لتحديد المواقع أفضل من الفأرة. بالنسبة للفئران الشباب فيها العيون ليست مفتوحة حتى الآن، افتح برفق الجفون مع مساعدة من غرامة 45 س ملقط الزاوية عن طريق إنشاء fissuإعادة على طول الشق الذي الجفون سوف تفتح في نهاية المطاف.
    1. مع مساعدة من ملقط غرامة 45 س الزاوية تطبيق بعناية الضغط حول جفن، بحيث ملوثات العضوية الثابتة مقلة العين قليلا من مأخذ. عقد رئيس مع اثنين من أصابع فقط فوق الأذن والفك، وتمتد برفق الجلد بالتوازي مع الجفون للحفاظ على العين قليلا من مأخذ. يجب الحرص على عدم فهم قريبة جدا من الحلق (الشكل 1B).
  4. ثقب مقلة العين، تضاف إبرة الحقنة في حوف القرنية (حيث القرنية والصلبة الاتصال). هذا واضح كدائرة رمادية في الفئران مصطبغة. سحب الإبرة قليلا لطرد كمية صغيرة من السائل الزجاجي ومن ثم حقن. الشخص الذي يؤدي حقن ينبغي أن تعقد بلطف الفأر مع يد واحدة وإبرة مع الآخر. الشخص الثاني أن تدفع ببطء الغطاس.
  5. سحب الحقنة ببطء. ترطيب تطبيق قطرات العين للحفاظ على العين رطبة.
  6. دع القوارض يتعافى في قفص على وسادة الحرارة ويستمر لمراقبة الحيوانات. إذا كان يعمل مع الجراء، لا عودة الحيوان إلى قفص مع الحيوانات في حالة تأهب أخرى حتى يتم التنفس وقادرة على الحركة العفوية. إذا كان يعمل مع الكبار، لا عودة القوارض إلى قفص مع الحيوانات في حالة تأهب أخرى حتى يستعيد رقود القصية.

3. حصاد الأنسجة الشبكية

ملاحظة: أنسجة الشبكية من عيون لا حقن جزيئات fluorescently المسمى ينبغي جمع كعنصر تحكم لتحليل تدفق cytometric. على الرغم من أن الفحص يمكن القيام بها باستخدام الشبكية واحدة، للحصول على أفضل أداء، يجب أن تجمع اثنين من شبكية العين معا.

  1. جمع الشبكية الأنسجة 3 ساعات بعد الحقن intravitreal من جزيئات fluorescently المسمى.
    ملاحظة: على الرغم من الوقت بعد الحقن من الحل الجسيمات قد يكون الأمثل لكل تجربة محددة، وجدنا أن 3 ساعة بعد الحقن، ويمكن أن ينظر الجسيمات امتصاص طوال معظم طبقات سو شبكية العين (الشكل 1C-D).
  2. التضحية الفئران عن طريق التفكك عنق الرحم.
  3. جمع مقل العيون عن طريق الضغط بلطف على الجفن بمساعدة غرامة 45 س ملقط الزاوية لproptose مقلة العين. وضع ملقط وراء مقلة العين وسحب.
  4. تشريح شبكية العين تشريح تحت المجهر. نقل مقلة العين إلى طبق بتري تحتوي على كمية صغيرة من برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+. في منطقة جافة من طبق بيتري، خرم مقلة العين في حوف القرنية مع غيض من ملقط رقيق.
  5. عقد مقلة العين بمساعدة غرامة 45 س ملقط الزاوية واستخدام مقص الربيع لخفض حول حوف القرنية، حتى يتم قطع ما يقرب من نصف محيط حوف القرنية.
  6. عقد مقلة العين مع غرامة 45 س ملقط الزاوية وتقديم مقلة العين في برنامج تلفزيوني. مع الزوج الثاني من غرامة 45 س ملقط الزاوية المسيل للدموع القرنية والصلبة على حدة. والعدسة والشبكية يخرج طntact.
  7. فصل العدسة والشبكية. جمع شبكية العين ونقل إلى أنبوب اختبار 5.4 مل البوليسترين تحتوي على 2 مل من برنامج تلفزيوني مع الكالسيوم 2+ / المغنيسيوم 2+.

4. إعداد تعليق خلية واحدة

  1. إعداد تعليق خلية واحدة باستخدام طقم تفكك الأنسجة العصبية مع تعديلات طفيفة لتعليمات الشركة الصانعة. لفترة وجيزة، شبكية العين يسحن من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع ماصة P1000 وإجراء عملية الهضم الأنزيمي في 37 درجة مئوية دون أن تهتز.

5. تلطيخ تعليق خلية واحدة لتحليل تدفق Cytometric

  1. Resuspend الخلايا في 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ (Dulbecco والفوسفات مخزنة المالحة مع الزلال 0.2٪ المصل البقري (BSA) وبنسبة 0.09٪ أزيد الصوديوم) ونقل إلى لوحة U-أسفل 96-جيدا. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 130 ز س.
    ملاحظة: أزيد الصوديوم الضارة على البشر والبيئة. استخدام المناسب معدات الحماية الشخصية لالثانية التخلص من النفايات من وفقا للوائح المحلية.
  2. عكس لوحة أكثر من بالوعة إلى تجاهل طاف. لمنع مستقبلات اف سي، وخلايا resuspend في 25 ميكرولتر من العازلة وصمة عار تحتوي على 5 ميكروغرام / مل من مكافحة فأر CD16 / CD32 الأجسام المضادة لكل بئر. احتضان لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
  3. إضافة 25 ميكرولتر من العازلة تلطيخ تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من مكافحة فأر Ly6C-APC-Cy7، و 0.5 ميكروغرام / مل من مكافحة فأر Ly6G-بي-Cy7 و 2.5 ميكروغرام / مل من مكافحة فأر CD11b-AF650. احتضان لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
  4. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 130 ز س. عكس لوحة لتجاهل طاف. يغسل عن طريق إعادة التعليق الخلايا في 200 ميكرولتر من العازلة تلطيخ.
  5. أجهزة الطرد المركزي لمدة 5 دقائق في 130 ز س. resuspend في 200 ميكرولتر من العازلة البقعة التي تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من يوديد propidium (PI). نقل إلى أنابيب عيار مكروي 1.2 مل.
  6. غسل الآبار مع 100 ميكرولتر إضافية من العازلة تلطيخ تحتوي على 0.5 ميكروغرام / مل من PI والتجمع مع 200 ميكرولتر السابقة في1.2 مل أنابيب عيار مكروي. يتم الحصول على الحجم الكلي 300 ميكرولتر من الخلايا الملون.

6. تحليل تدفق Cytometric

  1. باستخدام الليزر ثلاثة التقليدي (البنفسجي والأزرق، والأحمر ليزر)، وتجنب PE، PerCP-Cy5.5، BV510، والأصباغ PI بسبب امتداد كبير من جسيمات AF488 الفلورية مشرق للغاية. استخدام الرابع (الصفراء) ليزر لتحسين هذا الاختبار، لأنها تسمح لالأجسام المضادة PE المسمى وPI (في القناة mCherry بدلا من قناة PerCP-Cy5.5) ليتم استخدامها (الشكل 2).
    ملاحظة: إذا كان ليزر أصفر غير متوفر، استخدام القتلى استبعاد الخلايا الصبغة في قناة أخرى.
  2. البوابة على PI خلايا السلبية (PI-) لاستبعاد الخلايا الميتة (الشكل 2B).
  3. بعد استبعاد الخلايا الميتة، بوابة على CD11b خلايا إيجابية (CD11b +)، وهذا يشمل جميع خلايا الدم النخاعي (الشكل 2C).
  4. بين السكان CD11b +، بوابة على Ly6C - / Ly6G - استبعادالعدلات (CD11b + / Ly6G +) وحيدات (CD11b + / + Ly6C؛ الشكل 2D). بعد تبوب على الخلايا الدبقية الصغيرة (هنا تعرف بأنها CD11b + / Ly6C - / Ly6G - البساطة)، وينبغي أن يكون اثنين من السكان واضحا وضوحا. واحد سلبي وإيجابي للجسيمات fluorescently المسمى. واتخذت الخلايا البلعمية تصل الجزيئات، وبالتالي فهي AF488 + (الشكل 2E).
    ملاحظة: Ly6C إيجابية أو Ly6G السكان الإيجابي الذي يمكن أيضا تحليل لقياس امتصاص الجسيمات باستخدام هذا النهج تلطيخ. النسبة المئوية للأكلة CD11b + الخلايا يرتبط بشكل جيد مع نسبة الخلايا الدبقية الصغيرة البلعمية (الشكل 2F). للباحثين من دون خبرة التدفق الخلوي، تحليلا أكثر بساطة مع تلطيخ CD11b وحدها لا يمكن أن يؤديها، وإن كان هذا سيشمل العدلات وحيدات البلعمية، وكذلك الخلايا الدبقية الصغيرة. وفي هذا CD11b + / Ly6C - / Ly6G - </ sup> في السكان، وهذه الخلايا هي> 99٪ الخلايا الدبقية الصغيرة كما تقرره تلطيخ مع علامات F4 / 80 و CX3CR1. هذه العلامات يمكن إضافة ولكن ليست ضرورية في أيدينا.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

نحن هنا تصف طريقة لبسرعة وبشكل موثوق تحديد عدد الخلايا الدبقية الصغيرة في شبكية العين البلعمية في إعداد الفسيولوجية باستخدام تحليل تدفق cytometric (الشكل 2). ويمكن تكييف هذه الطريقة لاختبار تأثير المركبات و / أو التلاعب الجيني على القدرة أكلة ل الخلايا الدبقية الصغيرة (أرقام 3A، 3B). ويمكن أن تستخدم أيضا في الشباب (10-20 أيام بعد الولادة) أو فئران بالغة (الشكل 3C). كانت تدار جرعات متفاوتة ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هناك ثلاث خطوات حاسمة في هذا الأسلوب: (1) حقن intravitreal من جزيئات fluorescently المسمى. (2) الحصاد وإعداد أنسجة الشبكية. و (3) تحليل تدفق cytometric. من المستحسن أن الباحثين ممارسة حقن intravitreal قبل أداء طريقة يمكننا في هذا المقام. الفئران البيضاء (على سبيل المثال، BALB / ج)، وإيجاد حل اللون (على سبيل المثال، جزيئات fluorescently المسمى) يمكن استخدامها لرؤية سهلة للإبرة وحل حقن. حقن Intravitreal تشكل تحديا وإذا لم يتم تنفيذ بشكل صحيح سوف تؤدي إلى نتائج متحي...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

ليس لدى المؤلفين ما يكشفون عنه.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Salome Murinello مدعومة بمنحة جمعية السكري الأمريكية # 1-16-PDF-072. تم دعم هذا العمل من خلال منح لمارتن فريدلاندر من المعاهد الوطنية للصحة (المعهد الوطني للعيون EY11254 و EY22025) ومعهد لوي للبحوث الطبية.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
المجهر المجهرينيكونتوقف
هاميلتون   حقنة ، 600 سلسلةSigma26702
33 قياس ، محور صغير RN NDL ، 0.5 بوصة ، نمط النقطة 4 - 12oهاميلتون7803-05
Zymosan A (S. cerevisiae< / em>) الجسيمات الحيوية ، Alexa Fluor 488 مترافقThermoFisher ScientificZ-23373استعد مباشرة قبل الحقن
DPBSCorning21-030-CV
Dumont # 5/45 ملقطأدوات العلوم الدقيقة11251-35تحتاج إلى ملقطين
من Dumont #5SFأدوات العلوم الدقيقة11252-00
Vannas Spring Scissors - 3 مم أدواتالعلوم الدقيقةالمتطورة 15000-10
مجموعة تفكك الأنسجة العصبية المنحنية &ndash ؛ الخلايا العصبية بعد الولادةMiltenyi Biotec130-094-802
5 مل من البوليسترين أنبوب دائريالقاع Falcon352054
96 بئر صفيحة على شكل حرف UFalcon353077
Stain Buffer (BSA)BD Biosciences554657
CD11b-BV650 الأجسام المضادةBioLegend101259
Ly6C-APC-Cy7BioLegend128025
Ly6G-PE-Cy7BioLegend127617
بروبيديوم يوديدBD Biosciences556463
الأجسام المضادة CD16 / 32BioLegendللفأر 101301
المنقى المضاد

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gomez-Nicola, D., Perry, V. H. Microglial dynamics and role in the healthy and diseased brain: a paradigm of functional plasticity. Neuroscientist. 21, 169-184 (2015).
  2. Tremblay, M. E., Lowery, R. L., Majewska, A. K. Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience. PLoS Biol. 8, e1000527(2010).
  3. Schafer, D. P., et al. Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner. Neuron. 74, 691-705 (2012).
  4. Sierra, A., et al. Microglia shape adult hippocampal neurogenesis through apoptosis-coupled phagocytosis. Cell Stem Cell. 7, 483-495 (2010).
  5. Sierra, A., Abiega, O., Shahraz, A., Neumann, H. Janus-faced microglia: beneficial and detrimental consequences of microglial phagocytosis. Front Cell Neurosci. 7 (6), (2013).
  6. Chan, G., et al. CD33 modulates TREM2: convergence of Alzheimer loci. Nat Neurosci. 18, 1556-1558 (2015).
  7. Murinello, S., Mullins, R. F., Lotery, A. J., Perry, V. H., Teeling, J. L. Fcgamma receptor upregulation is associated with immune complex inflammation in the mouse retina and early age-related macular degeneration. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 247-258 (2014).
  8. Ransohoff, R. M., Perry, V. H. Microglial physiology: unique stimuli, specialized responses. Annu Rev Immunol. 27, 119-145 (2009).
  9. Derecki, N., Cronk, J., Kipnis, J. Assay of phagocytic function in primary murine microglia. Protoc Exchange. , (2012).
  10. Fricker, M., Oliva-Martin, M. J., Brown, G. C. Primary phagocytosis of viable neurons by microglia activated with LPS or Abeta is dependent on calreticulin/LRP phagocytic signalling. J Neuroinflammation. 9, 196(2012).
  11. Koenigsknecht-Talboo, J., Landreth, G. E. Microglial phagocytosis induced by fibrillar beta-amyloid and IgGs are differentially regulated by proinflammatory cytokines. J Neurosci. 25, 8240-8249 (2005).
  12. Neher, J. J., et al. Inhibition of microglial phagocytosis is sufficient to prevent inflammatory neuronal death. J Immunol. 186, 4973-4983 (2011).
  13. Fricker, M., et al. MFG-E8 mediates primary phagocytosis of viable neurons during neuroinflammation. J Neurosci. 32, 2657-2666 (2012).
  14. Mildner, A., et al. Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease. J Neurosci. 31, 11159-11171 (2011).
  15. Neher, J. J., et al. Phagocytosis executes delayed neuronal death after focal brain ischemia. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, E4098-E4107 (2013).
  16. Perego, C., Fumagalli, S., De Simoni, M. G. Temporal pattern of expression and colocalization of microglia/macrophage phenotype markers following brain ischemic injury in mice. J Neuroinflammation. 8, 174-174 (2011).
  17. Preissler, J., et al. Altered microglial phagocytosis in GPR34-deficient mice. Glia. 63, 206-215 (2015).
  18. Hughes, M. M., Field, R. H., Perry, V. H., Murray, C. L., Cunningham, C. Microglia in the degenerating brain are capable of phagocytosis of beads and of apoptotic cells, but do not efficiently remove PrP(Sc), even upon LPS stimulation. Glia. 58, 2017-2030 (2010).
  19. Westenskow, P. D., et al. Using flow cytometry to compare the dynamics of photoreceptor outer segment phagocytosis in iPS-derived RPE cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 53, 6282-6290 (2012).
  20. London, A., Benhar, I., Schwartz, M. The retina as a window to the brain-from eye research to CNS disorders. Nat Rev Neurol. 9, 44-53 (2013).
  21. Fritzenwanger, M., Jung, C., Goebel, B., Lauten, A., Figulla, H. R. Impact of short-term systemic hypoxia on phagocytosis, cytokine production, and transcription factor activation in peripheral blood cells. Mediators Inflamm. , 429501(2011).
  22. Ragsdale, R. L., Grasso, R. J. An improved spectrofluorometric assay for quantitating yeast phagocytosis in cultures of murine peritoneal macrophages. J Immunol Methods. 123, 259-267 (1989).
  23. Stokes, L., Surprenant, A. Dynamic regulation of the P2X4 receptor in alveolar macrophages by phagocytosis and classical activation. Eur J Immunol. 39, 986-995 (2009).
  24. Kotani, N., et al. Intraoperative modulation of alveolar macrophage function during isoflurane and propofol anesthesia. Anesthesiology. 89, 1125-1132 (1998).
  25. Xu, X., Feng, J., Zuo, Z. Isoflurane preconditioning reduces the rat NR8383 macrophage injury induced by lipopolysaccharide and interferon gamma. Anesthesiology. 108, 643-650 (2008).
  26. abd-el-Basset, E., Fedoroff, S. Effect of bacterial wall lipopolysaccharide (LPS) on morphology, motility, and cytoskeletal organization of microglia in cultures. J Neurosci Res. 41, 222-237 (1995).
  27. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. , (2014).
  28. Jackson, W. S. Selective vulnerability to neurodegenerative disease: the curious case of Prion Protein. Dis Model Mech. 7, 21-29 (2014).
  29. O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina. Sci Rep. 6, 20636(2016).
  30. Usui, Y., et al. Angiogenesis and Eye Disease. Annu Rev Vision. 1, 155-184 (2015).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Retinal MicrogliaPhagocytic FunctionFlow CytometryIntravitreal InjectionFluorescent ParticlesTissue DissociationCell SuspensionFc Receptor BlockingViability DyeLPS Challenge

Related Articles